R. Koch avastas vaktsiini Siberi katkule, tuberkuloosile ja koolerale. Bakterid on prokarüoodid ehk eeltuumsed. Bakteritel puudub tuum ja teised membraaniga ümbritsetud organellid. vibureid võib olla ka mitu Bakteril puudub tuum Rõngas DNA bakteri kromosoom genoom Bakteris peavad olema ka ribosoomid (valgusüntees). Gaasivakuoolid asuvad samuti bakteris, reguleerib kas bakter vajub põhja või tõuseb pinnale, toimib nagu kala ujupõis. Plasmiid väikerõngas DNA. Plasmiidis on geenid mis võimaldavad bakteril elada ekstreemsetes tingimustes. Ilma plastiidita (antibiootikumid, kõrge temperatuur, kõrge rõhk, happeline, aluseline keskkond). bakter on ilma plastiidita elujõuline Plasmiide võib olla ka mitu. Bakterid muutuvad resistentseks antibiootikumide suhtes. Bakterid paljunevad iga 20 minuti pärast. Plasmiide võib olla ühel bakteril ka mitu. Kuidas bakterid energiat saavad? väga erineval viisil: a) Autotroofid...
Transposoonid ehk ,,hüppavad geenid" on transponeeruvad ehk mobiilsed geneetilised elemendid. Nii pro kui ka eukarüootides. Jaotatakse kolme põhitüüpi: IS elemendid, Tn elemendid ehk kompleksed transposoonid, Tn3 elemendid ehk replikatiivsed transposoonid. IS elemendid ehk insertion sequences (800 2000 np), suht identse ehitusega, võivad lülituda väga erinevatesse kohtadesse bakteri kromosoomis või plasmiidis, näit. IS50.Iseloomustus: väikesed, alla 2500 np, suht identse ehitusega sisaldavad ainult transpositsiooniks vajalikke geene mõlemas otsas on IR järjestused (inverted repeat) ehk 9 50 bp otsmised pöördkordusjärjestused (vastassuunalised, palindroomsed) IS-elemendi insertsioonil tekivad elemendi otstes 2 13 bp pikad DR- (direct repeat) ehk otsekordusjärjestused. IS element kodeerib ensüümi transposaas, mis võimaldab
4. Rakumembraani kombineeritud ravi). läbilaskvuse vähenemine. 5. Aktiivne 2. Sünteetilised väljapumpamine. Seondub labiilselt 30 S plasmiidis). 2. Välismembraani pooride ribosoomiga > takistab tRNA muutus (kaasneda võib resistentsus a) 2. Tetratsükliinid kinnitumist ribosoomi ja mRNA penitsilliinidele, b) tsefalosporiinidele, c)
Konjugatsioon- bakteri DNA vahetu ülekanne doonorist retsipienti, mis eeldab rakkudevahelist kontakti. Kodeeritud tra geenide abil. F-plasmiidi kandev rakk (doonor) moodustab sex pilid retsipient rakuni. Üle kandub üheahelaline DNA. F-plasmiid võib üle kanduda nii plasmiidina kui kromosoomi integreerutuna. PMST. ´´bakterite suguelu´´ 18. Antraksi plasmiidid Bacillus anthracis genoomi suurus on 5,2 Mbp. Põhilised virulentsudfaktorid on kodeeritud 2-s plasmiidis, PXO1 (189 kb, antraksi toksiin) ja pXO2 (96 kb, kapslit kodeerivad geenid). pXO1 kodeeritud toksiin on kompleks 3-st plasmiidis kodeeritud valgust (LF (lethal factor) ja EF (edema (turse) factor). Kõrge LF tase hävitab leukotsüüdid ja bakter pääseb organismi. EF tõstab cAMP taset. Koos EF on peremees nakkusele tundlikum cAMP taseme tõus suurendab vedeliku akumulatsiooni rakkudesse. Teine plasmiidis kodeeritud valk PA (protective antigen) laseb toksilised valgud rakkudesse
geenitehnoloogia meetodeid, protsessi võib kirjeldada lühidalt. Geneetiliselt muundatatud taime valmistamine järgmiselt: Et eraldada DNA-ahelast siirdamiseks vajalikke geene, kasutatakse restriktsiooniensüüme, mis lõikavad DNA- ahela soovitud kohast lahti ja valivad vajalikud geenid. Need DNA-lõigud viiakse bakteri DNA-sse plasmiiidi. Bakter paljuneb kiiresti ja lühikese aja jooksul valmistatakse tuhandeid uue geeni koopiaid. Plasmiidis sisalduv DNA-lõik koos uue geeniga kantakse agrobakteri vahendusel taimerakkudesse, mis võimaldab saada transgeense ehk GM-taime. Looduslike ensüümide abil looduses esinevasse plasmiidsesse DNA-sse viidud geen liigub rakutuuma tavalist tuumatransporti kasutades. Kromosoomi siseneb DNA-sse tänu igas rakus toimuvale DNA-rekombinatsioonile. GM-taime tegemine lõpeb võõr- DNA-d sisaldavast rakust uue taime regeneerimisega, mille puhul kasutatakse ära
2005). Bakteriofaagide genoomide modifitseerimine Bakteriofaagide antimikroobsete omaduste võimendamiseks on välja töötatud erinevaid tehnikaid. Hiljuti loodi uus in vivo tehnika: bakteriofaagi elektroporeeritud DNA rekombineerimine ehk BRED (bacteriophage recombineering of electroporated DNA). BRED töötati välja Mycobacterium’i faagide jaoks, kuid seda saab rakendada ka teiste faagide peal. BRED-i puhul viiakse elektroporatsiooni abil faagi DNA bakteriraku sisse ning plasmiidis olevad rekombinatsiooni geenid üleekspresseeritakse, et tõsta homoloogilise rekombinatsiooni sagedust faagi DNA ja sihtmärk DNA vahel. BRED-i läbiviimiseks kasutatakse enamasti faag λ- t või Rac profaagi. Lisaks elektroporatsioonile kasutatakse ka keemilist transformatsiooni. Selle eeliseks on DNA ülekandel väiksemate pooride teke rakumembraani (Nobrega et al., 2015). Kõige enam üritatakse geneetiliste modifikatsioonide abil suurendada faagide peremeesringi (Nobrega et al., 2015)
20g/ml) vajalik sööde sini-valge selektsiooni läbiviimiseks, 25 l IPTG-d (lõppkonts. 0,1mM) vajalik lacZ promootori aktivatsiooniks, 200 l ampitsilliini (lõppkonts. 100 g/ml) vajalik selleks, et plasmiidi mittesisaldavad rakud ei saaks plaadil kasvama hakata, ja loksutasime segamini. Saadud sooja homogeense söötme valasime õhukese kihina Petri tassidele ning jätsime tarduma. Antibiootikumina kasutasime ampitsilliini, kuna transformeeritavas plasmiidis on ampitsilliini resistentsusgeen, mis võimaldab rakkudel, milles transformeerimine on õnnestunud, kasvama ja paljunema hakata. Oleks saanud kasutada ka kanamütsiini, kuna plasmiidis on ka kanamütsiini resistentsusgeen, kuid ampitsilliini kasutamine on vähem komplitseeritud. 5. DNA minipreparatsioon: a. Bakterikoloonia on bakterite kogum, mis tekib ühe bakteriraku paljunemisel. b. Petri tassil oli 25 kolooniat, neist 4 valged
Bakterirakk Bakterid on kõige väiksemad üherakulised organismid, mis suudavad iseseisvalt kasvada ja paljuneda. See eristab neid viirustest. Kõrgematest organismidest erinevad bakterid eeskätt membraaniga ümbritsetud tuuma puudumise poolest.Bakterid on prokarüootsed organismid, mille keskmine pikkus on vaid mõni mikromeeter. Bakterirakk on ehituselt lihtsam eukarüootsest rakust ega sisalda viimastele omaseid membraanseid organelle. DNA paikneb bakteritel kromosoomis ja plasmiidis. Bakterite ribosoomid erinevad nii suuruselt kui koostiselt eukarüootide omadest. Mõned bakterid moodustavad ebasoodsate tingimuste üleelamiseks endospoore. Lk 44. Kordamine! Kas esitatud laused on tõesed või väärad? vale väite korral lisage õige lause eitust mitte kasutades! 1. Makroelemendid kuuluvad üksnes orgaaniliste ainete koostisse. (V).... nii org. kui ka anorg. hulka 2. Anorgaanilised ja orgaanilised ained esinevad kõigis organismides. (Õ) 3
Kannan bakterisegu Petri tassile. Kallan klaasterad tassile ja loksutan et bakterid laiali kanduksid. Asetame tassid 37 kraadi juurde kasvama . Mida ja miks me transformeerime? Millist tulemust ootad? Viime enda vaheplasmiidi bakterisse, et see paljuneks ja et tekiksid kolooniad. Vastavalt valged ja sinised. Meie tahame valgeid kolooniaid saada. Milleks lisasime antibiootikumi? Mis oleks saanud kui oleksime lisanud tertatsükliini? Selleks, et meie plasmiidis oli ampitsiliini resistentsussait. Kui lisame seda antibiootikumi, jäävad ellu ainult transformeeritud bakterid. Kui oleksime lisanud tertatsükliini pole midagi saanud, sest kõik bakterid oleksid surnud või siis oleks need elus kus on tertatsükliini resistentsus. Aga need ei ole meie bakterid. Mis juhtuks, kui unustaksime lisada X-gali? Kas viga oleks saanud parandada? Milleks X-gali on vaja? 11
Selleks kasutatakse isepaljunevaid susteeme voi polumeraas-ahelreaktsioooni. Isepaljunevate susteemidena (nimetatakse ka vektoriteks) kasutatakse tavaliselt baketerite plasmiide voi viiruseid- bakteriofaage. Plasmiid rongakujuline kaheahelaline DNA molekul, mis sisaldab autonoomset paljunemist voimaldavaid geneetilisi elemente (eelkoige replikatsiooni alguspunkti), selektiivset markerit (ampitsilliinile resistentsust tagavat geeni) ja unikaalseid restriktaaside loikamiskohti (esinevad plasmiidis ainult uks kord). Vajalik DNA-loik uhendatakse vektoriga ja moodustunud rekombinant-DNA viiakse bakteri rakku, kus vektor asub paljunema tootes luhikese ajaga miljoneid koopiaid meid huvitavast DNA-fragmendist. Plasmiidide abil geeni paljundamise pohietapid on jargmised 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "loikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni voi DNA-loigu "valjaloikamine" kromosoomist sama restriktaasiga s
on jälgitav kodeerivate järjestuste asendumine mittekodeerivatega kuni nende kadumiseni. Pärmirakus ei muutu mtGenoom ja tuumagenoom üksteisest sõltumatult. Võimalik, et HGT mitokondri ja tuuma vahel on siiani käimasolev protsess. Seenerakus esineb palju viirusi ja plasmiide, mis võivad osaleda geenide ülekandel erinevate organismide vahel. Plasmiid võib olla mtGenoomi koosseisus või iseseisvalt paljuneda ja omada kindlaid funktsioone (raku kasvu pidurdamine, vananemine, plasmiidis kodeeritud mürkide abil konkurentide surmamine). Neid geene antakse edasi tsütoplasmaga seenehüüfide kokkukasvamisel (heteroplasmas). On kirjeldatud HGT bakterilt seenele, seenelt seenele (eri liikide või sama liigi eri isendite mtGenoomide vahel, seeneperekondade või ühe perekonna liikide tuumagenoomide vahel) ja seenelt taimele (sümbiontse või parasiitsete seene mtGenoomist taime mtGenoomi). HGT on leitud rDNA I grupi intronite osas ja mitmete valke kodeerivate järjestuste osas.
· nahaalune rasvkude (naistel hästiarenenud meestel mitte) · rasvumise tüüp (meestel kõhuõõnde, naistel alakehasse) · toruluude pikkus (meestel pikemad) Naine + testosteroon = mehelikud tunnused naistel e. maskulisatsioon. Mees + östrogen = naisestumine e. Feminisatsioon 21. aheldusrühm- aheldusastme alusel lineaarselt järjestatud geneetiliste lookuste (eelkõige geenide) rühm mingis pidevas geneetilises strutuuris (kromosoomis, plasmiidis jms.). Aheldusrühma kaugemate elementide vaheline aheldus (rekombinatsioonisageduse piiratus) järk-järgult nõrgeneb, kusjuures rühma eri otste lookused ei pruugi olla omavahel geneetiliselt aheldunud (st. rekombineeruvad vabalt). Tuumalookuste täielike aheldusrühmade arv võrdub kromosoomide arvuga genoomis. Liitelised geenid- ühes kromosoomis olevad geenid päranduvad koos, on omavahel aheldunud, ning moodust. ühtse ahaldusrühma
· rasvumise tüüp (meestel kõhuõõnde, naistel alakehasse) · toruluude pikkus (meestel pikemad) Naine + testosteroon = mehelikud tunnused naistel e. maskulisatsioon. Mees + östrogen = naisestumine e. Feminisatsioon 21. aheldusrühm- aheldusastme alusel lineaarselt järjestatud geneetiliste lookuste (eelkõige geenide) rühm mingis pidevas geneetilises strutuuris (kromosoomis, plasmiidis jms.). Aheldusrühma kaugemate elementide vaheline aheldus (rekombinatsioonisageduse piiratus) järk-järgult nõrgeneb, kusjuures rühma eri otste lookused ei pruugi olla omavahel geneetiliselt aheldunud (st. rekombineeruvad vabalt). Tuumalookuste täielike aheldusrühmade arv võrdub kromosoomide arvuga genoomis. Liitelised geenid- ühes kromosoomis olevad geenid päranduvad koos, on omavahel aheldunud, ning moodust. ühtse ahaldusrühma.
alad. 1.Kromatiid 2.Tsentromeer 3.Lühike ,,käsi" 4.Pikk ,,käsi" 18. Milliseid rakke ümbritseb rakukest? Taimerakke. 19. Mis on plasmiid? Plasmiid on rõngakujuline kaheahelaline DNA molekul, mis sisaldab autonoomset paljunemist võimaldavaid geneetilisi elemente (eelkõige replikatsiooni alguspunkti), selektiivset markerit (ampitsilliinile resistentsust tagavat geeni) ja unikaalseid restriktaaside lõikamiskohti (esinevad plasmiidis ainult 1 kord). 20. Rakutsükli etapid. Rakutsükkel koosneb M-faasist (mitoos e. karüokinees(tuuma jagunemine) + tsütokinees(tsütoplasma jagunemine) e. raku pooldumine, mille puhul kromosoomid jaotuvad tütarrakkude vahel võrdselt) ning interfaasist e. päristuumse raku kahe jagunemise (mitoosi või meioosi) vahele jääv eluperiood (ajaliselt 90% vôi rohkem rakutsükli kestusest). Interfaasis toimub kõikide rakukomponentide sünteesimine, et tekkivatel tütarrakkudel oleks olemas
järglastele päranduvad. Neil organismidel ilmneb uus, mõnele teisele liigile omane tunnus. Transgeensed mikroorganismid. Transgeensete organismide loomine põhineb rekombinantse DNA tehnoloogial. Siiratav geen tuleb ühendada niisugusesse DNA või RNA kompleksi, mis saab siseneda rakku ja integreeruda selle genoomi. Selliseid DNA konstrukte nimetatakse geenivektoriteks ehk –siirdajateks. (Plasmiidse geenivektori tegemine. Restriktaas lõikab plasmiidis DNA lahti kindla järjestuse kohalt. Sama restriktaasiga lõigatakse välja siiratavat geeni sisaldav DNA-fragment. Plasmiid ja DNA-fragment segatakse kokku, ”kleepuvad otsad” ühinevad. DNA ühendatakse ligaasiga töötlemisel.). Kuna niisama lihtsalt ei ole võimalik inimese geene bakteri plasmiidi sisestada, kasutatakse selleks ensüüm transkriptaasi. Eraldatakse huvipakkuvast geenis mRNA ja
ekspresseeruda või mitte) kaitseb antikeha-vahendatud surma eest • Kasvufaktorite haaramine: raud heemi ja laktoferriini jms küljest • Resistentsus seerumi bakteritsiidsele toimele: kihn+komplemendi sidumise takistamine • Antibiootikumresistentsus: plasmiididega liikide, perekondade vahel Shigellad: • Adherentsi- (ipaD), invasiooni- ja rakusisese paljunemise (IpaB,C) geenid plasmiidis, reguleerib kromosomaalne materjal. Esmalt kinnituvad M-rakkudele. Lüüsib fagotsütoosivakuooli, paljuneb tsütoplasmas. Korraldavad aktiinifilamendid ümber, liiguvad naaberrakku (IcsB) (immuunsüsteemile kättesaamatud). Indutseerivad apoptoosi. • Välismembraani permeaablusbarjäär • S. dysenteriae toodab Shiga toksiini (a/b), mis häirib valgusünteesi, kahjustab endoteeli. A seostub ribosoomiga ja takistab nii valgusünteesi. • Hemolüütiline koliit, HUS seos Shigellaga
Tuum, kromosoomid, ribosoomid, membraanide koostis: ester- ja eeterlipiidid, steroolid, histoonid ja rakuskeleti valgud, viburite ehitus, intronid geenides, membraansed organellid eukarüootidel. Tuum kaks membraani, pooride kaudu käib ainete transport tsütoplasmasse, välimine membraanon tihedalt seotud endoplasmaatilise retiikulaga. Tuumas on DNA. Kromosoomid bakteritel rõngas, eukarüootidel pulk, pulka esineb ka mõnel bakteriliigil. Bakteritel on osa DNAst ka plasmiidis, seda tavaliselt ei vajata, aga vahel võib olla vajalik, nt antibiootikume kahjustavate toksiinide ja ensüümide süntees. Virelentsusgeen tekitavad haigusi peremeesorganismis eukarüootidel on histoonid valkudeks, mis pakivad kromosoome kokku, prokarüootidel histoonide homoloogid. Kokkupakkimine mõjutab geeniregulatsiooni kokkupakitud kromosoom on varjestatud ja selle pealt ei saa toimuda transkriptsiooni. Eukarüootide geenides
pandud juurde teised molekulid) on erinev, aga muud asjad on üldjoontes samad. Genoom on rakus olev kogu DNA. Diploidsetes organismides loetakse genoomiks haploidset karnituuri. Kogu kromosoomis olev DNA on genoom. Genoom pole sama mis on karüotüüp, see on liigispetsiifiline. Genoom on nukleiinhape, kromosoom on kompleks nukleiinhappest ja tervest erinevast reast valkudest. Eukarüootidel on genoom paigutatud kromosoomidesse, prokarüootidel on ta tsirkulaane (plasmiidis või nukleoidis, üksainuke kromosoom). Genoom on pakendatud kuna rakk on väike. DNA molekul ühes kromosoomis on piisavalt pikk. et tagada DNA pakitus ja funktsionaalsus, on DNA omakorda erinevalt pakitud sinnamaani kuni saame mitootilise kromosoomi. DNA ja valkude kompleksi nimetatakse kromatiidiks. Eukarüootse kromosoomi struktuur Kromatiin - DNA ja valkude kompleks kromosoomis, valku 2x rohkem kui DNA Kaks põhilist valku:
heterotsstid ja vesiikulid. Assotsiatsioon taime ja N2 siduvate bakterite vahel: lmmastiku sidumine fllosfri ja risosfri bakterite poolt; 5-25 kg N ha-1 a-1. N2 sidumine toimub intensiivselt mikroelupaikades lhikestel perioodidel. Lmmastiku sidumine smbioosis 1.-Rhizobium ja liblikielised taimed, varasem perekond Rhizobium on jaotatud 4 (Rhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium) perekonda kokku 16 liigiga. Noodulite moodustumine taime juurel- selleks vajalikud geenid paiknevad plasmiidis. Lmmastiku fikseerimine algab noodulis 8-16 peva prast bakteri tungimist taimerakku. Noodulid koosnevad neljast erinevast tsoonist. Aktiivne N2 sidumine toimub tsoonis, kus paikneb leghemoglobiin. Sltuvalt nooduli tbist eksporditakse NH3 vi glutamaati, aspartaati, priine peremeestaime rakkudesse. Noodulite moodustumise puhul on tegemist peremeestaime spetsiifilisusega: maaphklil vivad nooduleid moodustada mitmed erinevad Bradyrhizobiumi
· rasvumise tüüp(meestel kõhuõõnde, naistel alakehasse) · toruluude pikkus (meestel pikemad) Naine + testosteroon = mehelikud tunnused naistel e. maskulisatsioon. Mees + östrogen = naisestumine e. feminisatsioon. 21. Liitelised geenid ??,aheldusrühm Aheldusrühm (linkage group) -- aheldusastme alusel lineaarselt järjestatud geneetiliste lookuste (eelkõige geenide) rühm mingis pidevas geneetilises strutuuris (kromosoomis, plasmiidis jms.). Aheldusrühma kaugemate elementide vaheline aheldus (rekombinatsioonisageduse piiratus) järk-järgult nõrgeneb, kusjuures rühma eri otste lookused ei pruugi olla omavahel geneetiliselt aheldunud (st. rekombineeruvad vabalt). Tuumalookuste täielike aheldusrühmade arv võrdub kromosoomide arvuga genoomis. Aheldusrühma skeemi, millele on kantud lookuste nimed ja nendevahelised geneetilised kaugused sentimorganites (cM), nimetatakse geneetiliseks kaardiks. Liitelised geenid-- 22
5'ots proovis märgistati 32P (punane täpp). -globiini mRNA kaitstud proovi hübridiseeriti ~340-nukleotiidine lõik, mida oli lagundatud S1 nukleaasiga, mis lagundab üksikahelalise DNA, aga mitte RNA-DNA hübriidi. Autoradiograafia elektroforeesitud S1-kaitstud lõikudest (4) näitas, et rakud, mida oli transfekteeritud plasmiid 1-ga (1. rida) tootsid palju rohkem -globiini mRNA-d kui need, mida oli transfekteeritud plasmiid 2-ga. Tulemused näitaad, et SV40 DNA fragment plasmiidis 1 koosneb elemendist, enhancerist, mis stimuleerib -globiini mRNA sünteesi. 40. Nimeta vähemalt 3 üldist bioloogilist protsessi, kus enhancerite aktiivsusega kontrollitakse geeni ekspressiooni tasemeid? Rasvlahustuvad steroidhormoonid (östrogeen, testosteroon) võivad difundeeruda läbi plasmamembraani ja seonududa spetsiifilistele retseptoritele tsütoplasmas või tuumas. Hormooni sidumine muudab retseptori kuju
Näiteks P-nälja korral indutseerub bakteris E. coli üle 50 geeni ekspressioonitase. Ka selle meetodi rakendamisel on probleeme. Kromosomaalsete liitjärjestuste tekkimine viib märklaudgeeni aktiivsuse pärssimisele ja nii on võimatu isoleerida promootor-reportergeeni liitjärjestusi, kus promootor kontrollib rakule eluliselt tähtsate geenide tööd. Ainus võimalus on konstrueerida genoomseid raamatukogusid, kus DNA fragmendid viiakse plasmiidis asuva reportergeeni ette. Reportergeeni poolt kodeeritud valk võib rakus ka ise stressi indutseerida. Näiteks, kui kasutada reporterina GFP-d (green fluorescent protein) kodeerivat geeni, võivad rakus indutseeruda kuumashoki geenid. Kuumashoki vastuse kutsub esile GFP aeglane voltumine rakus. 3. Geenikiibid (gene chips, microarrays). Tahkele kandjale viidud DNA järjestused pärinevad organismi
üle kanduda kromosoom. E. coli F-plasmiid on võimeline inserteeruma bakteri 101 kromosoomi ja sealt ka välja tulema. E. coli tüve, mis kannab F-plasmiidi kromosoomis nimetatakse Hfr tüveks (High frequency of recombination). Teada on umbes 20 piirkonda E. coli kromosoomis, kuhu F-plasmiid võib integreeruda, kuid enamasti on eelistatud mõned piirkonnad. F-plasmiidis on mitu transponeerivat elementi: kaks IS3, üks IS2 ja üks Tn1000 (). Neid kasutatakse F-plasmiidi integreerimiseks E. coli kromosoomi homoloogilse rekombinatsiooni abil (RecA valk). Tn1000 järjestusse inserteerunud F-plasmiid on kromosoomis kõige ebastabiilsem ning võib kõige kergemini kromosoomist tagasi plasmiidiks rekombineeruda. F-plasmiid võib kromosoomist välja tulla ebakorrektselt, olles kas lühem kui algne plasmiid või pikem, olles kaasa võtnud insertsioonijärjestuse
annaabi.ee 
