Induktsioon geeniprodukti süntees vastusena induktorile Operoni organisatsioon ja induktsioon E. coli lac operon: E. coli glükoosi metabolismi geenid ekspresseeritud pidevalt Alternatiivsete suhkrute metabolismi rada ekspresseeritud spetsiifiliselt (näit. Laktoos) Laktoos on disahhariid (glükoos+galaktoos), energiavehetuses Laktoos toimib kui induktor (effektor molekul) ja stimuleerib umbes 1000x ekspressiooni kolmele valgule: 1. galaktosidaas (lacZ) ·Lagundab laktoosi glükoosiks ja galaktoosiks ·Konverteerib laktoosi allolaktoosiks ja reguleerib lac operoni. 2. Laktoos permeaas (lacY) ·Transpordib laktoosi keskkonnast läbi plasmamembraani 3. Transatsetülaas (lacA) ·Päris täpselt funktsioni ei teata E. coli lac operon: Francois Jacob ja Jacques Monod (Pasteur'i Instituut, Pariis) Tegid kindlaks E. coli lac operoni organisatsiooni Nobeli preemia 1965.
• Molekulaarbioloogia üks olulisemaid teemasid on – miks osa geene avalduvad ühtedes rakkudes/kudedes ja teised geenid teistes rakkudes/kudedes? • Kõige olulisem geeni avaldumise regulatsioon toimub transkriptsiooni tasemel. Geenide regulatsiooni tasemed Transkriptsiooni regulatsiooni uuringud said alguse E. coli bakteris Operonis on kolm geeni: Z, Y ja A. LacZ on b-galaktosidaas ehk ensüüm, mis lõikab laktoosi glükoosiks ja galaktoosiks. Lähedal asub LacI geen, mis kodeerib repressorvalku ja seondub Operaator regiooniga. Sellega blokeerib geenide ekspressiooni. Teisalt seondub hästi laktoosiga. Kui söötmes on laktoosi, siis vabaneb promootor ja LacZ geeni käivitub. Eukarüootse geeni regulatsioon Regulatoorsed DNA elemendid, kuhu seonduvad regulatsioonis osalevad valgud (transkriptsiooni faktorid jne)
õnnestunud. Geeli analüüsil selgus, et inserdi kontsentratsioon oli umbes 13,7 ng/l. Kuna vektori ja inserdi pikkuste suhe 3851/330=11,7. Kuna vektorit oli 9 ng, saame leida vektori ja inserdi koguste suhte: (13,7*11,7)/9=17,70. See suhe on küllaltki sobiv. 3. Rekombinantse plasmiidi ligeerimine a) Kasutasime pSTBlue-1 vektorit, mis sisaldab kahte replikatsiooniks vajalikku origini (üks kummaski suunas), ampitsilliini ja kanamütsiini resistentsusgeeni ja lacZ operoni, mille lugemisraami sisestame oma inserdi. See võimaldab sini-valge meetodil välja selgitada, millistes kolooniates on tühi, millistes meie inserti sisaldav plasmiid. Vektoril on T-overhangidega otsad, mis võimaldab A-overhangidega inserti sisestada. b) PCR-i produkti on võimalik vektorisse ligeerida, kuna vektoril on T-overhang otsad ning PCR-i produktil on A-overhang otsad. T ja A on omavahel komplementaarsed,
molekuli. DNAde otsad seovad komplementaarselt kokku ligaasi abil. 44. Me kasutasime kloneerimiseks pSTBlue-1 vektorit (T-overhangidega), kuhu saab sisestada saadud DNA järjestuse (A-overhangidega inserdi 3’ otsades). Toimub A-T otste komplementaarne paardumine ning vektor ja DNA ligeeritakse. 45. 46. pSTBlue-1 vektor sisaldab replikatsiooni vajaliku origini, antibiootikumiresistentsuse geeni ning ka lacZ operooni, mis annab bakterile lisatoitumisallika, kuna kodeerib β-galaktosidaasi. β-galaktosidaas lõhub β1-4 glükosiidsidet ja erinevaid substraate ette söötes saame kindlaks teha, millised meie kasutatud bakterikoloonuatest sisaldavad tühja plasmiidi ja millistel on insert seda ensüümi kodeeriva järjestuse „ära rikkunud“. 47. Ligeerimiseks tuleb pipeteerida kokku ligeerimissegu (5 μl), segada pipeti või vorteksi abil,
ligatsioonireaktsiooniks jne... Kui palju DNA saadakse 50bp-10kb puhul 70-90% Praktiline töö nr. 5: Rekombinantse plasmiidi ligeerimine Eesmärk: Meid huvitava aplifitseeritud DNA järjestuse sisestamine vahevektorisse ehk paljundusplasmiidi. Materjalid: 1,25 µl pSTBlue-1 vektor Lineaarne vahevektor, kus on origin, (16ng/µl) antibiootikumide resistentsusgeen, lacZ üksus ja AccepTor kloneerimissait. 3,75 µl PCR produkt Sisaldab inserti 1 µl 10X ligeerimispuhvrit Loob sobiva keskkonna 0,5 µl T4 DNA ligaasi (5U/µl) Ligeerib inserdi ja vektori kokku 3,5 µl MQ lahusti Arvutused: Vektor: 16/1 = 20/x x = 1,25 µl PCR produkt: 150ng/10µl=15ng/µl PCR vektrori suhe peab olema 3:1
*struktuurne geen sellelt toodetakse mRNA *regulaatorgeen st. repressor, mis kodeerib regulaatorvalgu, mis seondudes operaatoriga takistab transkriptsiooni. Operon kobar järjestikuseid geene, mida transkribeeritake ühelt promootorilt ning mille transkript omab paljude erinevate valkude transleerimiseks vajalikku järjestust. lac-operon valke toodetakse vaid laktoosi olemasolul Laktoosi operon sisaldab promootor, operaator, 3 struktuurset geeni : lacZ, lacY, lacA (esimesed 2 vajalikud). Lac operon on indutseeritav, sest geenid avalduvad vaid laktoosi olemasolul. Kui induktorit rakus pole lacI (lac operoni regulaatorgeen) kodeerib repressorvalgu, mis on seondunud operaatoriga ja operoni transkriptsioon on alla surutud. Allolaktoosi seondumine repressoriga põhjustab repressori dissots. operaatorilt. 10. Mis on peamine erinevus prokarüootse mRNA ja eukarüootse mRNA vahel?
3. Millised elemendid peavad olema eukarüootses ekspressioonivektoris? Loomarakkudele mõeldud ekspressioonivektor (plasmiid) sisaldab: 1.komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (prokarüootset replikatsiooni alguspunkti, antibiootikumi resistentsusgeeni); 2.kloneerimisala (MCS) erinevate restriktaaside lõikekohad; 3.uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul); 4.reportergeeni (GFP, lutsiferaas, lacZ jt.) või märgise (tag; FLAG, myc, V5, GFP) järjestust. 5.eukarüootset promootorit (CMV, SV40) ja polüadenüleerimisjärjestust (SV40); 6.selektsioonimarkeri ekspressioonikassetti. Praktiline töö III Immuunotsütokeemia 1. Mille poolest on erinevad monoklonaalsed ja polüklonaalsed antikehad? Mka reageerivad vaid ühe epitoobiga antigeeni molekulis, on väga spetsiifilised 2. Mis on epitoop? Too välja kaks erinevat tüüpi epitoopide rühma ja kirjelda
järjestuste (MARide) c. abil. 17. Kuidas tuvastada transkriptsiooniregulaatorite märklaud gene? a. Footprinting. Märklaud geenid ei sisalda TATAboxi. 18. Miks kasutatakse "heat-shock" geenide promootoreid? a. Sidumine proksimaalse elemendi teatud järjestusele stimuleerib peatunud RNA-polII jätkama elongatsiooni ja indutseerib kiiret reinitsiatsiooni uute RNA-polII molekulidega. 19. Mida tähendab väljend "kasutades lacZ reporterina" ja mis analüüsi- meetodiga on tegu? Transgeenne analüüs. a. Reportergeen viiakse uuritavasse rakku... 20. Defineeri enhancer ja loetle enhanceri omadused. Missuguseid analüüsi-meetodeid kasutatakse enhanceralade tuvastamiseks? a. Enhancer lühike DNA ala, mis seob aktivaatoreid (valgud), initsieerib transkriptsiooni läbi mediaatorkompleksi. b. Tuvastamiseks kasutatakse linkerskaneeritud, mutatsioon
promootorjärjestustele. Transkriptsiooni initsiatsiooni lõppedes vabaneb sigma faktor RNA polümeraasi koosseisust. 4. Prokarüootne operoon regulatoorne üksus, milles asuvad struktuurgeenid, operaator ja promootor. Operooni mudeli järgi kontrollivad struktuurgeenide transkriptriooni regulaatorgeen ja operaatorgeen. Laktoosi (lac) operoni regulatsioon E.Coli rakkudes. Lac operon sisaldab promootorit P, operaatorit O ja 3. struktuurgeeni lacZ (-galalaktosidaasi geen), lacY (-galalaktosidaasi permeaasi geen) ja lacA (transatsetülaas). Operoni geenide negatiivne kontroll toimub läbi repressorvalgu Lac I seondumise operaatorile ja positiivne kontroll läbi aktivaatorvalgu CAP seondumise operaatoralale. 5. Eukarüootse mRNA kodeeriv osa erineb prokarüootsest selle poolest, et sisaldab tüüpiliselt vaid üht tsistronit e. ORF'i. Erineva struktuuri tõttu ei ole mRNA eukarüootide ja prokarüootide vahel vahetatav, st
4 Mõned neist geenidest kodeerivad valke, mis on denatureerivatele tingimustele erakordselt vastupidavad, teised jälle tsaperone, mis denatureeritud valke uuesti re-struktureerivad. Heat-shock geenide transkriptsioonil peatub PolII pärast esimese 25 bp sünteesi, aga ei termineeri transkriptsiooni. Transkriptsioon jätkub pärast seda, kui keskkonnamuutuse mõjul on aktiveerunud HSTF (heat-shock transkriptsiooni faktorid). 19. Mida tähendab väljend "kasutades lacZ reporterina" ja mis analüüsimeetodiga on tegu? Transgeenne analüüs. Ei tea täpselt, aga pmst luuakse DNA konstrukt, milles on uuritav sidumissait (näiteks mingi UAS), TATA-box ja reportergeen (siin lacZ geen). Reportergeen valitakse selline, mille produktide aktiivsust on lihtne määrata ja järeldusi teha. Sellist meetodit nim ilmselt siis transgeenseks analüüsiks?? 20
sellisena ka tsütoplasmas. Geenide operoni paigutumise eesmärk on vastavalt vajadusele kas nende koos avaldumine või kõigi nende ekspressiooni täielik üheaegne mahasurumine. 7.2 Kirjeldage lühidalt laktoosi operoni toimimist. Lac operon kodeerib laktoosi metabolismi geene. Koosneb promootorist, operaatorist ja terminaatoris. Lac operooni geenid: lacZ kodeerib B-galaksidaasi, mis lõhustab laktoosi glükoosiks ja galaktoosiks; lacY ja lacA. Üleval: Kui keskkonnas ei esine laktoosi (mis inhibeeriks repressorit), repressor seondub operaatoriga. See takistab RNA-polümeraasi seostumist
Meie valitud vektor sisaldab ka antibiootikumiresistentsuse geeni ka β-galaktosidaasi kodeerivat lacZ operooni. Kui inserd ligeeris vektoriga kokku, siis see vektor enam ei kodeeri ensüümi, mis lõhub β- galaktosidaasi, kuna inserdi sisestamisel me rikkume selle geeni lugemisraamid. Selle alusel
Komplementatsioonitesti kasutamine on raskendatud ka polaarsete mutatsioonide puhul. Polaarse mutatsiooni puhul mõjutab mutatsioon mitte üksnes selle geeni avaldumist, milles ta asub, vaid mõjutab ka temaga külgnevate geenide avaldumist. Need geenid paiknevad mutatsiooni sisaldavast geenist alati ühes kindlas suunas sellest ka mutatsiooni polaarne toime. Näiteks bakterirakus paiknevad paljud struktuurgeenid operonina. Laktoosioperoni puhul paiknevad geenid lacZ (kodeerib laktoosi lagundavat ensüümi -galaktosidaas) ja lacY (laktoosi permeaas järjekorras: lac-promootor lacZ lacY. Juhul, kui lacZ geeni algusosas tekib mutatsioon, mis tekitab sinna translatsiooni stop koodoni, mõjutab see oluliselt ka geeni lacY translatsiooni efektiivsust. 12. Käitumise geneetiline kontroll Käitumine on koordineeritud neuromuskulaarne vastus keskkonna signaalidele, milles osalevad nii sensoorsed, neuraalsed kui ka hormonaalsed faktorid.
Inhibiitormolekulide ja nende signaalradade blokeerimine; Perifeerse närvi tüki siirdamine läbi armkoe; Regenereeruvate aksonite navigeerimine ajus. Transkriptiline kontroll kidney arengus. Trasriptioonilise faktori GATA perekond.6 GATA faktorit selgrootsetel. Sisaldavad 2 Cys4 tüübi zing finger domääni; seostuvad DNAle WGATAR, tugeva aktivaatori; GATA3 reguleerib embüro hemopoeesi, T-raku ja närvisüsteemi arengut.GATA3 roll urogenitaala arengul: GATA3-lacZ knock-in mice. Wollfian kanaali laiendamine on reguleeritud:reguleerivate faktorite, raku kuju muutmise ja liikuvate valkude, ECm,signaalradade ja transkriptioonilise faktoritega. Wnt1 ekspressioon GATA 3: Wnt mitte kunagi ei ole ekspresseeritud Wd-is; Lim1 on astmeliselt kaob WD-is; GFRal kaob WD-is;GDNF jääb ilma effektita mesenhüümis. Enamuse WD markerite ekspressioon on algab, aga astmeliselt kaob; mesenhüümide
- Glükoos inhibeerib cAMP moodustumist. - Glükoosi olemasolul on [cAMP] madal. Glükoosi ärakasutamisel [cAMP] tõuseb. Moodustub CAP-cAMP kompleks, mis seostub lac operonis oma spetsiifilise DNA järjestusega ja soodustab ekspressiooni. Kui laktoos puudub keskkonnast, siis lacI repressor seostub operaatoriga, lacZYA ei ekspresseeru. Kui laktoos on keskkonnas, siis repressor inaktiveeritud induktoriga seostumise tõttu, lacZ, lacY, ja lacA geenid ekspresseeruvad. - LacZYA geenid on tavaliselt väga madalal tasemel ekspresseerunud - Laktoosi olemasolul seostub üks tema ainevahetuse produktidest repressoriga, inhibeerides selle - Repressor ei seondu enam operaatoriga, ja lacZYA geenid transkribeeritakse - Repressoriga seostuja on induktor. - lacZYA RNA transkript on ebastabiilne ja lagundatakse ruttu. Seega, laktoosi lõppemisel või
- Glükoos inhibeerib cAMP moodustumist. - Glükoosi olemasolul on [cAMP] madal. Glükoosi ärakasutamisel [cAMP] tõuseb. Moodustub CAP-cAMP kompleks, mis seostub lac operonis oma spetsiifilise DNA järjestusega ja soodustab ekspressiooni. Kui laktoos puudub keskkonnast, siis lacI repressor seostub operaatoriga, lacZYA ei ekspresseeru. Kui laktoos on keskkonnas, siis repressor inaktiveeritud induktoriga seostumise tõttu, lacZ, lacY, ja lacA geenid ekspresseeruvad. - LacZYA geenid on tavaliselt väga madalal tasemel ekspresseerunud - Laktoosi olemasolul seostub üks tema ainevahetuse produktidest repressoriga, inhibeerides selle - Repressor ei seondu enam operaatoriga, ja lacZYA geenid transkribeeritakse - Repressoriga seostuja on induktor. - lacZYA RNA transkript on ebastabiilne ja lagundatakse ruttu. Seega, laktoosi lõppemisel või
Mõned neist geenidest kodeerivad valke, mis on denatureerivatele tingimustele erakordselt vastupidavad, teised jälle chaperone, mis denatureeritud valke uuesti re-struktureerivad (re-fold). Nende geenide ekspressiooni regulatsiooni mehanism on evolutsiooniliselt kujunenud selliseks, et ekstremaalsetes tingimustes on transkriptsiooniks kõik olemas, st pole vaja kromatiini lahti pakkida ega transkriptsiooni preinitsiatsiooni kompleksi kokku panna. 38. Mida tähendab väljend "kasutades lacZ reporterina" ja mis analüüsimeetodiga on tegu? Transgeenne analüüs. Reporter geen on geen, mida lisatakse teise huvipakkuva geeni uurimiseks geeni sisse (rakukultuuris, loomadesse või taimedesse). Neid lisatakse sellepärast, et tunnused, mida nad end ekspresseerivates loomades tekitavad, on kergelt äratuntavad ja mõõdetavad. Üldjuhul kasutatakse, et uurida, kas huvipakkuv geen ekspresseerub. LacZ on geen, mida ekspresseerides hakkab organism tootma laktoosi.
sageli erinevas koguses. Operoni geenidevahelises alas on leitud järjestusi, mille baasil võivad tekkida RNA sekundaarstruktuurid. Polütsistroonse mRNA lõikamine algab enamasti geenide vahelt ning kuna tekkinud mRNA segmendid on erineva elueaga, võib see olla üheks mehhanismiks, mis aitab reguleerida geenide ekspressioonitaset operonisiseselt. Näiteks laktoosioperoni puhul toimub lacY-spetsiifilise mRNA degradatsioon ligikaudu 2-korda kiiremini kui lacZ mRNA lagundamine. Translational coupling Iga geeni ees peaks olema oma RBS, kus toimub uus initsiatsioon, eri segmentidel eri efektiivsusega, olenev järjestusest. Osade polütsistroonsete mRNA-de puhul paiknevad geenid nii lähestikku, et lõppeva geeni stop koodon ja temale järgneva geeni initsiaatorkoodon asuvad kõrvuti või kattuvalt. Sel juhul ei dissotseeru ribosoomid pärast stop koodonit mRNA-lt, vaid difundeeruvad külgneva geeni initsiaatorkoodonini ning
sageli erinevas koguses. Operoni geenidevahelises alas on leitud järjestusi, mille baasil võivad tekkida RNA sekundaarstruktuurid. Polütsistroonse mRNA lõikamine algab enamasti geenide vahelt ning kuna tekkinud mRNA segmendid on erineva elueaga, võib see olla üheks mehhanismiks, mis aitab reguleerida geenide ekspressioonitaset operonisiseselt. Näiteks laktoosioperoni puhul toimub lacY-spetsiifilise mRNA degradatsioon ligikaudu 2-korda kiiremini kui lacZ mRNA lagundamine. Geenide ekspressioonitaset kontrollitakse operonisiseselt mRNA stabiilsuse kaudu F plasmiidi tra operonis. See operon on 32 kb-pikkune ja sisaldab hulgaliselt geene, mille produktide järele on rakus erinev vajadus. Kõige enam vajatakse traA geeni produkti piliin, mis on piilide koostisosa. Piliini kodeerivad mRNA segmendid on teistest tunduvalt stabiilsemad. Kuigi nad on 5' otstest heterogeensed, on kõigi segmentide 3'
geenisesene komplementatsioon. Geen-valk. Valkude isovormid: transkriptide splaissingu alternatiivsed ainevahetusalad (lähedasi omadusi omavad ensüümid/valgud). Üks geen võib moodustada perekonna lähedasi valke eksonite alternatiivse splaissingu tulemusel. "Viga parandab vea" - geenisisene komplementatsioon. Kahe samas geenis asuvate mutatsiooni mõjul moodustub normaalne fenotüüp. Polaarne mutatsioon - mutatsioon, mis takistab endast allavoolu (tavaliselt?) olevate geenide avaldumise. LacZ, beta-galaktosidaas; lacY, beta-galaktosiid permeaas - moodustub multigeenne mRNA, mis annab translatsioonil need 2 ensüümi. Polaarne mutatsioon ei komplementeeru isegi siis mitte kui teine mutatsioon on samas geenis.
reguleerimine nii domineeriv, et esimesed teated transkriptsiooni aktiveerimisest leidsid ägedat vastuseisu. Repressioon võib toimuda kõigil etappidel, mida on vajalik transkriptsiooni initsiatsiooniks: 1. RNAP seondumise takistamine 2. avatud kompleksi moodustumise takistamine 3. promootori vabastamise takistamine 73 RNAP seondumise parimaks näiteks on LacI seondumine lacZ geeni ees olevale operaatoralale, mille tulemusena lacZ geeni transkriptsiooni ei saa RNAP alustada. Operaator asub promootori ja geeni alguspunkti vahel ning takistab füüsiliselt RNAP seondumist promootoralaga. Transkriptsiooni regulaatorite seondumiskohast sõltuvalt võib aimata, kas regulaator aktiveerib või represseerib transkriptsiooni. Tavaliselt seonduvad transkriptsiooni repressorid promootorile või promootori ja geeni alguse vahele,
mutantse fenotüübiga. Komplementatsioonitesti kasutamine on raskendatud ka polaarsete mutatsioonide puhul. Polaarse mutatsiooni puhul mõjutab mutatsioon mitte üksnes selle geeni avaldumist, milles ta asub, vaid mõjutab ka temaga külgnevate geenide avaldumist. Need geenid paiknevad mutatsiooni sisaldavast geenist alati ühes kindlas suunas sellest ka mutatsiooni polaarne toime. Näiteks bakterirakus paiknevad paljud struktuurgeenid operonina. Laktoosioperoni puhul paiknevad geenid lacZ (kodeerib laktoosi lagundavat ensüümi -galaktosidaas) ja lacY (laktoosi permeaas järjekorras: lac-promootor lacZ lacY. Juhul, kui lacZ geeni algusosas tekib mutatsioon, mis tekitab sinna translatsiooni stop koodoni, mõjutab see oluliselt ka geeni lacY translatsiooni efektiivsust. Komplekssed seosed geenide ja polüpeptiide vahel Geenide ja polüpeptiidide kolineaarsus ei pruugi selle algses tähenduses alati kehtida. 1960-ndate aastate lõpus kirjeldati viirustel geenide kattuvust
Positiivse regulatsiooni puhul on eukarüootidel palju reguleerivaid piirkondi, kuhu saavad seostuda erinevad transkriptsioonifaktorid. Kui transkriptsioonifaktorit pole, siis asi ei tööta – faktor mõjub positiivselt. Regulaator paneb geenid tööle. Kui regulaatorit pole, siis geen on väljalülitatud. DNA on pakitud kromatiini – DNA tuleb kättesaadavaks teha sünteesiks ja selleks vajatakse regulaatorit. Ilma regulaatorita on geen välja lülitatud. Lac-operon, kolm geeni 1) LacZ – ensüüm β-galaktosidaasi kodeeriv geen, lagundab laktoosi; vajalik pentoosfosfaadi tsüklis. Koosneb neljast valgust. 2) LacY – membraanivalk, permeaasi (transportvalku) kodeeriv geen; võimaldab laktoosil rakku vast võtta. Pääseb väga aeglaselt. Permeaasita on laktoosi kontsentratsioon väiksem raku sees kui ümbritsevas keskkonnas. 3) LacA – transatsülaas, ensüümide aktiveerimiseks; laktoosi esmane lagundaja 50
mutantse fenotüübiga. Komplementatsioonitesti kasutamine on raskendatud ka polaarsete mutatsioonide puhul. Polaarse mutatsiooni puhul mõjutab mutatsioon mitte üksnes selle geeni avaldumist, milles ta asub, vaid mõjutab ka temaga külgnevate geenide avaldumist. Need geenid paiknevad mutatsiooni sisaldavast geenist alati ühes kindlas suunas sellest ka mutatsiooni polaarne toime. Näiteks bakterirakus paiknevad paljud struktuurgeenid operonina. Laktoosioperoni puhul paiknevad geenid lacZ (kodeerib laktoosi lagundavat ensüümi -galaktosidaas) ja lacY (laktoosi permeaas järjekorras: lac-promootor lacZ lacY. Juhul, kui lacZ geeni algusosas tekib mutatsioon, mis tekitab sinna translatsiooni stop koodoni, mõjutab see oluliselt ka geeni lacY translatsiooni efektiivsust. Komplekssed seosed geenide ja polüpeptiide vahel Geenide ja polüpeptiidide kolineaarsus ei pruugi selle algses tähenduses alati kehtida. 1960-ndate aastate lõpus kirjeldati viirustel geenide kattuvust
mikroobe nendest, millel plasmiide ei ole (tavaliselt mingi antibiootikumi suhtes resistentsuse geen, nii et saame antibiootikumiga söötmel kasvatada vaid plasmiidiga mikroobe). Unikaalne restriktsiooni sait, see tähendab, et ei tohi olla rohkem kui üks koht, mis lõigatakse läbi restriktsiooni ensüümiga. Siis saab sinna panna sama ensüümiga läbi lõigataud DNA lõigu. Mingi marker, millega saab eristada inserdiga plasmiide, mitte rekombinantsetest (näit. lacZ geen). Milleks cDNA raamatukogu kasutatakse: 1. Isoleerida ja järjestada geene, mis kodeerivad valku 2. Võrrelda eri organismide homoloogseid järjestusi 3. Määrata mRNA hulka ja geeni ekspressiooni taset rakus Restriktsioon analüüs: Geeni struktuuri määramiseks; piiranguks on restriktsiooni saitide olemasolu ja restriktaaside valik. RFLPs on väga oluline analüüs nii kriminalistikas kui
coli-laadsete bakterite omadusel lagundada teatuid substraate, mille tulemusena tekib vrviline produkt. Coli-laadsete bakterite puhul on substraadiks isopropl-.-D- tiogalaktopranosiid (IPTG) - kasutatakse .galaktosidaasi detekteerimiseks. E. coli puhul on substraadiks o-nitrofenool-.-D- galaktopranosiid-4metlbelliferl- .-D-glkouroniid (MUG)- kasutatakse .-glkouronidaasi detekteerimiseks. Tuntumad kommersiaalsed tooted on Colilert test ja Colisure. Veel kasutatakse geeniproove ja PCR meetodeid (lacZ coli-laadsed, uidA ja uidR E. coli). Siin on probleemiks kvantifitseerimine. Mitmed uurimistd on nidanud, et coli-laadsete bakterite arvukus ei ole kvantitatiivselt seotud patogeensete mikroobide esinemisega (ja haigestumisriskiga) vees, mistttu soovitatakse kasutada +/- teste. Indikaatormikroobi (coli-laadsete) puudused: liiga lhike eluaeg veekeskkonnas ja tundlikkus vee ttlemise (desinfitseerimise) suhtes erinevalt algloomadest ja viirustest. Seetttu ei ole meetod sobilik tvestavate
annaabi.ee 
