TTÜ keemiainstituut Biokeemia õppetool YKL3312 Biokeemia-praktikum Laboratoorne Töö pealkiri: töö nr. 2.2 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Õpperühm: Töö teostaja: YASB-21 Andrei Popov 082559 Õppejõud: Töö teostatud: Protokoll esitatud: Protokoll arvestatud: Tiina Randla Teoreetiline osa. Geelkromatograafia on meetod erinevate suurustega molekulide eraldamiseks segust. Kolonni laetakse peeneteraline, võimalikult ühtlase poorsusega geel, kolonni alumisse otsa pannakse geeli mitte läbilaskev, kuid uuritavate ainete läbimist lubav takistus(klaasvill), mis lubab eraldada puhastatava aine geelist endast. Molekulid, mis on liiga suured, et mahtuda geeli pooridesse, tulevad kolonnist läbi esimesena. Kõige väiksemad molekulid aga takistuvad pooridesse, ning väljuv...
2. SEGUDE LAHUTAMINE JA AINETE IDENTIFITSEERIMINE 2.1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL Kromatograafia on segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva (mobiilse) ja liikumatu (statsionaarse) faasi vahel. Geelkromatograafia meetoditest on kõige tuntum geelfiltratsioon ehk molekulaarsõelte meetod. See on ainete lahutamise, puhastamise ja analüüsi meetod, mis baseerub segus olevate ainete molekulmasside erinevusele. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Protsessi viiakse läbi kolonnis, mis on täidetud poorse geelimaatriksiga, kusjuures poorid on samas suurusjärgus lahutatavate makromolekulide mõõtmetega. Geeligraanulite pooridest suuremad molekulid pooridesse ei mahu ning seetõttu nimetatakse protsessi ka eksklusioonkromatograafiaks. Geelkromatograafias kasutatavad geelid koosnevad kas dek...
· Täidise kõrgus ja kolonni sisediaameter: D=1,8cm , L=32,7 · Arvutatud täidise kogumaht Vt: Vt= r2 *L = 3,14*0,9*32,7= 83,21cm3 · Arvutatud maksimaalne elueerimismaht Vx max : Vg= K*Vt , Vmax =Vt-Vg Vg = 0,1 *83,21 =8,321 Vmax=83,21 -8,321 =74,89. · Arvutuslik fraktsioonide üldarv: n= Vmax/2 n=74,89/2 = 37,4 Siis fraktsiooni kogumisekd on vajalik umbes 37 katseklaasi!!! Mõõtmistulemuste tabel. Saannud andmete järgi koostame kromatogrammi 0 proov on eluaat mida me kogusime 100 ml mõõduklaasi. Selgitus kromatogrammi kohta. · Enne dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga eluaadi väljumist on väljunud umbes 20 ml eluaadi. · Elueeritud segus oli: 1) Dekstraansinine. Absorbeerib lainepikkusel 670 nm(sinie joon kromatogramil). Temal on sinine värvus ja ta väljub kolonnist esimesena, sest dekstraansinine on
17. Gaasikromatograafi ehitus (koos lühikirjeldusega) Proov sisestatakse süstides aurutisse, kus see aurustub ja seejärel juhitakse teatud osa kandegaasi abil (mobiilne faas) läbi lahutuskolonni. Proovi erinevad komponendid lahutuvad vastavalt nende jaotuskoefitsentidele statsionaarse ja mobiilse faasi vahel. Ainete tsoonid jõuavad detektorisse, kus mõõdetakse mingi füüsikaliskeemline parameeter ja saadakse signaal => signaal võimendatakse ja andmetöötluse süsteem genereerib kromatogrammi (koosneb nulljoonest ja piikidest) 18. Kandegaasid GK-s ( sh.nõuded) Kandegaas - tagab maksimaalse proovi komponentide lahutuvuse, tagab maksimaalse detektori tundlikuse, on madala viskoossusega, on puhas (vee ja hapnikuvaba), pole plahvatus-ohtlik ega odav. Tavaliselt N2, He, Ar ja vahel ka H2. Mobiilne faas ehk kandegaas peab olema inertne statsionaarse faasi ja lahutatavate ainete suhtes. 19
Metüleeritud proov kantud GC proovipudelisse ning antud analüüsi. Tulemused TLC analüüsi käigus ilmutatud plaadilt oli näha, et proovi pleki suurus oli ligikaudu 4,5x suurem kui standardi oma, mis tähendab, et kui standardi plekis sisaldus umbes 2 μg rasvhapet, siis uuritava proovi 2 μl-s sisaldus 9 μg rasvhappeid. Kuna uuritavat lahust oli umbes 300 μl, siis terves uuritavas proovis sisaldus järelikult 300x4,5=1350 μg rasvhappeid. Kromatogrammi järgi oli proovis kõige rohkem oleiinhapet 12%, palmitiinhapet 15%, linoolhapet 15,5%, arrahidoonhapet 18% ja steariinhapet 23%. ω6 ja ω3 rasvhapete massisuhe arvutati identifitseeritud rasvhapete piikide pindalade järgi, mis on võrdelised rasvhapete kogusega proovis. Tulemuseks saadi ligikaudu, et ω3 rasvhappeid moodustuvad vaid 15% ω3 ja ω6 rasvhapetest . Xxxxx Xxxxx
kaasa ka aminohapped, mille liikumiskiirus sõltub radikaalide polaarsusest. Polaarsete radikaalidega aminohapped interakteeruvad tugevamini statsionaarse faasiga, mille moodustab sorbendisse imbunud vesi. Vooluti nivool lastakse tõusta 5 10 mm kaugusele plaadi ülemisest servast, milleks kulub umbes 0,5 1 tund. Plaat võetakse kromatografeerimisnõust välja, frondi asukoht tähistatakse pliiatsiga ja plaat kuivatatakse algul õhukäes ja hiljem lõplikult kuivatuskapis. Kromatogrammi ilmutamiseks kasutatakse aminohapete segu lahutamisel ilmutina ninhüdriini lahust, millese plaat korralikult kastetakse. Aminohapetele iseloomulikud laigud ilmuvad plaadi kuivatamisel kuivatuskapis (60 70 oC juures). Laigud ümbritsetakse grafiitpliiatsiga tõmmatud ringidega. Ninhüdriin ja aminohape reageerivad omavahel leeliselises keskkonnas, andes produktidesk H2O, CO2, RCOH, aspargiini puhul oranzikaspruuni, proliini ja
eluaat on värvitu Fraktsiooni analüüsimine Aine kontsentratsioon igas fraktsioonis väljendatakse lahuse absorptsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Absorptsiooni mõõdetakse spektrofotomeetritel. Sinised fraktsioonid mõõdetakse lainepikkusel 670nm, pruunid lainepikkusel 410nm ja kollased lainepikkusel 360nm. Koostatakse katseandmete tabel, mis on aluseks kromatogrammi koostamisele ja töö tulemuste väljatoomisele. Esimesena väljus kolonnist dekstraansinine (molekulmass 2 000 000 Da), mis ei läbinud geeli poore ja väljus minimaalse elueerimismahuga. Teisena väljus müoglobiin (molekulmass 17 800 Da), mis osaliselt difundeerus geeli. Viimasena väljus DNP-aspartaat (molekulmass 299 Da), millel on võrreldes teistega väga väike molekulmass ning seetõttu difundeerus täielikult geeli pooridesse.
Fraktsioonide analüüsimine · Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. · Täiesti värvusetute fraktsioonide absorptsiooni väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone pole vaja mõõta. · Koostatakse 3-veeruline katseandmete tabel, mis on aluseks kromatogrammi koostamisele ja töö tulemuste väljatoomisele. Kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark G-75, seda iseloomustav tegur k=0,1 Geelisamba kõrgus L=32,7 cm Diameeter d=1,6 (raadius r=0,8) Vt=r2L=*0,82*32,7=65,75 cm3 Geelimaatriksi maht Vg=k*Vt=0,1*65,75=6,575 cm3 Maksimalne elueerimismaht Vxmax=Vt-Vg=65,75-7,575=59,175 cm3 Fraktsioonide üldarv n=Vxmax/2=59,175/230 Voolutuslahus 20mM Tris 0,15M NaCl pH=7,5
2 0.1 0 Elueerimismaht (ml) Elueeritud segus oli: 1. Dekstraansinine - absorbeerib lainepikkusel 670 nm. Sinise värvusega aine, mis väljub esimesena, sest dekstraansinine on kõrgmolekulaarne (suured molekulid), mille tulemusena molekulid ei mahu geeligranulite pooridesse ja liikuvad kiiresti nende vahel. Kromatogrammi järgi elueerimismaht on Vx min = 24 ml 2. Teisena väljus Lysozyme, mis absorbeerib lainepikkusel 280 nm Vx = 48 ml 3. DNP - Aspartaat - absorbeerib lainepikkusel 360 nm. Kollase värvusega aine väljub viimasena, kuna temal on kõige väiksem molekulaarmass ja molekulid hästi mahuvad pooridesse, mis pidurdavad nende liikumist. Vxmax = 72 ml Liikuvusteguri Rf väärtus: V x -V min x 48-24 Rf = max min
Vxmax = Vt Seda saab arvutada ka geelimaatriksi mahu abil Vxmax = Vt - Vg Aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda geeli pooridesse ja mille elueerimismaht on antud kolonnis kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf. Rf = (Vx Vxmin)/(Vxmax Vxmin) , kus 0 < Rf < 1 Fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammi. Käesolevas töös kasutatakse konstentratsioonide kindlakstegemisel spektrofotomeetrilist meetodit. Töö käik Antud töös kasutan Sephadex G-75 geeli, mille k=0,1. Mõõdan geelisamba kõrguse L=15,5 cm ja sisediameetri d=2,7 cm. Siit saan arvutada geelitäidise kogumahu Vt. d Vt = S p × L = × ( 2 )2 × L 2,7 cm Vt = × ( 2 )2 × 15,5 cm = 88,7 cm3 Siit saan arvutada geelimaatriksi mahu Vg. Vg = k × V t
Elueerimise võib lõpetada, kui väljuv eluaat on värvitu. Fraktsioonide analüüsimine 1. Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. 2. Täiesti värvusetute fraktsioonide absorptsiooni väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone pole vaja mõõta. 3. Koostatakse 3-veeruline katseandmete tabel, mis on aluseks kromatogrammi koostamisele ja töö tulemuste väljatoomisele. Kolonni täidiseks oleva Sephadex’i mark – G-75, seda iseloomustav tegur k=0,1 Geelisamba kõrgus L=30,9 cm Diameeter d=1,6 (raadius r=0,8) Vt=πr2L=π*0,82*30,9=62,10 cm3 Geelimaatriksi maht Vg=k*Vt=0,1*62,10=6,21 cm3 Maksimalne elueerimismaht Vxmax=Vt-Vg=62,10- 6,21=55,89 cm3 Fraktsioonide üldarv n=Vxmax/2= 55,89/2≈27,945 Voolutuslahus 20mM Tris 0,15M NaCl pH=7,5
1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Optiline tihedus (A) 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Eluaadi maht (V,ml) Graafik 1. Kromatogramm Järeldus Kromatogrammi pealt on näha kolm tippu, mis seletab ainete kolonnist väljumise järjekorda. Esimesena väljus kõige suurema molekulmassiga aine – dekstraansinine, seejärel müoglobiin ning siis väikseima molekulmassiga aine – DNP-aspartaat. Dekstraansinise molekulid ei mahtunud kolonni täitva geeli pooridesse. Müoglobiini molekulid difuneerusid geeli pooridesse rohkem ning DNP-aspartaadi molekulid difundeerusid geeli pooridesse täielikult.
32 87 0,305 33 89 0,121 34 91 0,064 35 93 0,029 36 95 0 37 97 0 Kromatogramm Kromatogrammi järeldused Kõige kiiremini elueerunud aine, dekstraansinise elueerumisprofiil on kujutatud sinisega. Dekstraansinine väljub esimesena, sest selle molekulid on liiga suured, et mahtuda geeli pooridesse. Minimaalne elueerimismaht ehk maht, mille juures väljub dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktisioon, on 29 ml. Järgmiseks on punasega kujutatud müoglobiini elueerumisprofiil. Tegu on geeli pooridesse osaliselt difundeeruvate molekulidega. Eluaadi maht Vx on 39 ml.
28 81 1,6541 29 83 2,311 30 85 1,9336 31 87 1,2758 32 89 0,5664 33 91 0,1829 6. Kromatogramm 7. Kromatogrammi analüüs · Eluaadi maht kuni kõrgema kontsetratsiooniga dekstraalsinise fraktsiooni väljumiseni: Vxmin = 29 ml · Eluaadi maht kuni kõrgaima kontsentratsiooniga müoglobiini väljumiseni: Vx = 39 ml · Eluaadi maht kuni kõrgema kontsentratsiooniga DNP-aspartaadi väljumiseni: Vxmax = 85 ml · Liikuvustegur Rf valk müoglobiini jaoks: Järeldused · Esimesena väljus kolonnist dekstraalsinine. Selle aine osakesed on liiga suured et
lainepikkusel. Iga segus sisalduva aine optilise tiheduse väärtust mõõtsin ainele iseloomulikul neeldumismaksimumi lainepikkusel max. Spektrofotomeetri reguleerisin järgmisele aine üleminekul vastavale lainepikkusele. Mõõtsin lainepikkustel 670 nm, 410 nm ja 360 nm (vastavalt sinine dekstraansinine, pruun müoglobiin ja kollane DNP-aspartaat). Absorptsiooni mõõtsin spektrofotomeetril. Andmetest koostasin tabeli, mille alusel joonestasin kromatogrammi Excelis. Optiline tihedus, A Elueerimismaht V, Fraktsiooni number 670 nm/410 nm/360 mL nm Ühendatud 26 0 fraktsioon
Minu kasutatud voolutuslahuse koostis on 10mmolaarne tris ja 0.15 mol sool, pH=7.4. Seni kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent, väljub kolonnist puhas vooluti, mis täidab geeliterade poore ja teradevahelist ruumi. See osa eluaadist kogutakse ühendatud fraktsioonina. Enne voolutamise algust asetatakse kolonni väljalaskeava alla 100 ml kuiv kolb. Ühendatud fraktsiooni maht tuleb mõõta, sest see moodustab osa kogu elueerimismahust ja tuleb kromatogrammi koostamisel arvesse võtta. Kui proov oli geeli pinnale kantud, avasin kolonni väljavooluu ja hakkasin eluaati koguma. Kui proov sisenes täidisesse, viisin kiiresti pipeti abil geeli pinnale väikese koguse voolutuslahust ja lasin täidisesse imbuda. Kordasin seda teist korda ka ja siis kui veendusin, et uuritav proov on kolonni sisenenud, kandsin geeli pinnale suurema hulga voolutit, nii et moodustus 4-5 cm kõrgune vedeliku kiht.
19 56 1,917 20 58 1,762 21 60 1,084 22 62 0,46 23 64 0,136 24 66 0,036 25 68 0,013 Tabeli alusel koostatud kromatogramm: C. Kromatogrammi info: Ainetest kõige esimesena väljus dekstraansinine, sest tema molekulmass on kõige suurem (2 000 000 daltonit), ainetest järgmisena väljus Müoglobiin kuna tema molekulmass on suuruselt järgmine ( 16 800 daltonit) ja ainetest viimasena väljus DNP aspartaat, sest tema molekulmass on kõige väiksem (299,5 daltonit). Mida suurem on aine molekulmass, seda vähem difundeerub ta geeli pooridesse ja seda kiiremini ta kolonnist väljub.
õhukeses ihis. Liikumatuks faasiks on thake sorbent (silikageel). Mehhanism põhineb adsorptsioonil. Liikuv faas kandub sorbendikihis edasi tavaliselt kapillaarjõudude mõjul. Moodustavad ained kandjal ümmargused või ovaalsed laigud. Laikude kogumit nimetatakse kromatogrammiks. Retensioonifaktor Rf iseloomustab aine liikuvust kromatografeerimisel. Kujutab endast uuritava aine ja liikuva faasi keskmiste liikumiskiiruste suhet kromatogrammi saamise aja jooksul. Rf väärtusele mõjutavad tugevasti kromatografeerimistingimused. Kasutatakse orienteeruvaks samastamiseks. Rf = a/b , kus a-kaugus stardijoonest laigu keskpunktini; b kaugus stardijoonest liikuva faasi frondijooneni. Rs vähetundlik juhuslikele kõrvalekallete suhtes, kasutatakse täpsemale kromatografeerimise kiiruse hindamiseks. (standardi suhtes). Kujutab ennast ühe aine Rf väärtuse suhet standardiks võrtud aine Rf väärtusesse
Teatud lisaanalüüsidega on võimalik kromatograafiat kasutada analüüsitava proovi kvalitatiivse ja kvantitatiivse koostise määramiseks. Näiteks võib aineid kindlaks teha (identifitseerida) suhteliste väljumisaegade (retentsiooniaeg) põhjal, kui neid võrrelda teadaolevate ainete andmetega. Kromatografeerimise optimeerimiseks kasutatakse vajadusel lahutustsükli käigus kolonni temperatuuri või liikuva faasi rõhu või kulu muutmist vastavalt etteantud programmile. Nii saab kromatogrammi "kokku suruda", s.t. pika väljumisajaga ained väljuvad kiiremini andes seejuures vastavalt kitsama ja kõrgema piigi. 80. Kuidas saaks kasutada kromatograafilist meetodit? Analüüs – segudest komponentide eemaldamine nende tuvastamiseks, prooviks on väikesed kogused Farmaatsias aine eeltöötlus – võetakse palju proove, mille analüüsimise eesmärgiks on lõpptootest ebapuhtuste eemaldamine. Elektrienergia tootmine taastuvatest energiaallikatest. 81
(dekstraansinine), väljub kolonnist puhas vooluti, mis täidab geeliterade poore ja teradevahelist ruumi. Selle kogumine 2 ml-te fraktsioonidena pole otstarbekas. Seetõttu võib selle osa eluaadist (ei sisalda uuritava segu komponente) koguda ühendatud fraktsioonina, milleks enne voolutamise algust asetatakse kolonni väljalaskeava alla 100 ml kuiv kolb. NB! Ärge unustage mtmast ühendatud fraktsiooni mahtu! See moodustab osa kogu elueerumismahust ja tuleb kromatogrammi koostamisel arvesse võtta. Mahu mõõtmiseks kasutatakse sobiva suurusega mõõtsilindrit. Olles proovi eelkirjeldatud viisil geeli pinnale kandnud, avatakse väljavool kolonnist ja eluaati hakatakse koguma ülalnimetatud kolbi. Niipea kui proov on täidisesse sisenenud, viiakse kiiresti (NB! Õhk ei tohi kolonni täidisesse sattuda!) pipeti abil geeli pinnale väike 54 kogus (0,51 ml) voolutuslahust ja lastakse täidisesse imbuda
Teatud lisaanalüüsidega on võimalik kromatograafiat kasutada analüüsitava proovi kvalitatiivse ja kvantitatiivse koostise määramiseks. Näiteks võib aineid kindlaks teha (identifitseerida) suhteliste väljumisaegade (retentsiooniaeg) põhjal, kui neid võrrelda teadaolevate ainete andmetega. Kromatografeerimise optimeerimiseks kasutatakse vajadusel lahutustsükli käigus kolonni temperatuuri või liikuva faasi rõhu või kulu muutmist vastavalt etteantud programmile. Nii saab kromatogrammi "kokku suruda", s.t. pika väljumisajaga ained väljuvad kiiremini andes seejuures vastavalt kitsama ja kõrgema piigi. 87. Kuidas saaks kasutada kromatograafilist meetodit? Analüüs – segudest komponentide eemaldamine nende tuvastamiseks, prooviks on väikesed kogused Farmaatsias aine eeltöötlus – võetakse palju proove, mille analüüsimise eesmärgiks on lõpptootest ebapuhtuste eemaldamine. PINNANÄHTUSED JA ADSORBTSIOON 88. Kolloidsüsteemide jaotus.
annaabi.ee 
