Lipiidide eraldamine, hüdrolüüs ja GC analüüs (0)

Lipiidide eraldamine, hüdrolüüs ja GC analüüs

Uuritavaks objektiks oli seamaks 1,87 g.
Töö eesmärgiks oli määrata määrata uuritavas preparaadis sisalduvad rasvhapped .
Töö koosnes 3 põhiosast :
1. Lipiidide eraldamine looduslikust ainest
2. Lipiidide leeliseline hüdrolüüs
3. Rasvhapete gaaskromatograafiline analüüs

Töö käik

Lipiidide hüdrolüüs

Algmaterjalile lisatud 30 ml kloroform: metanool segu (2:1 v/v) ja homogeniseeritud. Saadud segu filtreeritud läbi paberfiltri keeduklaasi, lisatud 0,2 mahtu 0,9% NaCl vesilahust ja loksutatud. Kihistunud lahusest eemaldatud pipetiga veekiht . Kloroformi kihile lisatud 0,25 mahtu vesi:metanool segu (1:1 v/v) ja segatud . Lahus tsentrifuugitud kihtide eraldamiseks ning taas veekiht eemaldatud. Kloroformi lahus kuivatatud Na2SO4-ga. Lahus valatud läbi paberfiltri eelnevalt kaalutud ümarkolbi ning vaakumrotatsioonaurutiga aurustatud lahusti pealt ära. Kolb kaalutud uuesti, lipiidide kaalutiseks saadud 0,0564 g.
Lipiidid lahustatud 200 μl kloroformis, mis jagati kaheks, nii et mõlema paarilise ependorfi sai tõsta 40 μl lahust, kuna sea maksas on palju lipiide . Kloroform puhutud inertgaasiga pealt ära, lisatud 500μl 0,6N KOH lahust 90% metanoolis. Lahust kuumutatud 55-60°C 1,5-2h, jahutatud toatemperatuurini ja külmutatud -20°C.

Hüdrolüüsitud rasvhapete eraldamine

Lipiidilahusest ekstraheeritud hüdrolüüsimata jäänud materjal lisades 300μl heksaani , loksutatud segamini ning kihistunud lahusest eraldatud heksaani kiht. Korratud 3 korda. Vesilahus hapustatud 1N HCl-ga pH 3-ni. Rasvhapped ekstraheeritud lisades 300μl heksaani ning pärast kihistumist eraldatud heksaani kiht ning pandud teise ependorfi. Korratud 4 korda. Heksaani lahus kuivatatud Na2SO4-ga.
Heksaani lahus kantud ümarkolbi ning roteeritud heksaan pealt ära. Rasvhapped lahustatud 200μl kloroformis.

Hüdrolüüsitud rasvhapete analüüs TLC meetodil

TLC plaadile kantud 2 μl hüdrolüüsitud proovi, 1 μl alglahust ja 2 μl AA standardit. Plaat asetatud elueerimissegusse (heksaan/etüülatsetaat/äädikhape (3:1:0,05)), ilmutatud aniisaldehüüd-ilmutiga.

Lipiidide hüdrolüüsil saadud rasvhapete segu kvantitatiivne analüüs TLC meetodil

TLC plaadile kantud 2 μl proovi ja rasvhappe (AA) standardit (1 μg/μl). Plaati elueeriti, seejärel ilmutati fosformolübdeenhappe 2,5% etanoolilahuses.

Rasvhapete metüleerimine

Metüleerimiseks võeti 10 μl proovi. Lahusti aurustati inertgaasiga puhudes. Proov lahustatud 25 μl metanoolis ja loksutatud. Lahusele lisatud 100 μl diasometaani eetrilahust, avatud kaanega eppendorf pandud 37°C termoblokki kuni lahusti oli enamjaolt pealt ära auranud. Jääk puhuti inertgaasiga minema. Eppendorfi lisatud 25 μl metanooli.

Metüleerimise kontroll ja gaaskromatograafliste proovide ettevalmistamine

Metüleerimise toimumist kontrolliti TLC meetodil, samamoodi kui eespool . Metüleeritud proov kantud GC proovipudelisse ning antud analüüsi.

Tulemused

TLC analüüsi käigus ilmutatud plaadilt oli näha, et proovi pleki suurus oli ligikaudu 4,5x suurem kui standardi oma, mis tähendab, et kui standardi plekis sisaldus umbes 2 μg rasvhapet, siis uuritava proovi 2 μl-s sisaldus 9 μg rasvhappeid . Kuna uuritavat lahust oli umbes 300 μl, siis terves uuritavas proovis sisaldus järelikult 300x4,5=1350 μg rasvhappeid.
Kromatogrammi järgi oli proovis kõige rohkem oleiinhapet 12%, palmitiinhapet 15%, linoolhapet 15,5%, arrahidoonhapet 18% ja steariinhapet 23%.
ω6 ja ω3 rasvhapete massisuhe arvutati identifitseeritud rasvhapete piikide pindalade järgi, mis on võrdelised rasvhapete kogusega proovis. Tulemuseks saadi ligikaudu, et ω3 rasvhappeid moodustuvad vaid 15% ω3 ja ω6 rasvhapetest .
Xxxxx Xxxxx
999999 YASXX