Kui kolonnis liikuv esimene sinine riba oli jõudnud kolonni põhja lähedale, hakati eluaati koguma nummerdatud katseklaasidesse 2 ml kaupa. Fraktsioonide kogumine lõpetati, kui eluaat oli muutunud värvituks. Ainete kontsentratsiooni igas fraktsioonis väljendati lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse kaudu, mida mõõdeti aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel spektrofotomeetriga. Tulemused Kolonni iseloomustavad parameetrid täidise mark ja materjal: dekstraan, Sephadex G-75 täidist iseloomustav pundumistegur: k=0,1 täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L=17,5 cm ; d=2,6 cm arvutatud täidise kogumaht: arvutatud maksimaalne elueerimismaht: arvutuslik fraktsioonide üldarv: Uuritava segu koostis: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat Voolutuslahus: 7,5 pH; Tris/HCl 0,1 M NaCl 2 Mõõtmistulemuste tabel
2) VS graanulitesisese vedeliku maht 3) Vg geelimaterjali ehk maatriksi maht 4) Vt täidise kogumaht ehk üldmaht. On arvväärtuselt lähedane maksimaalse elueerimismahuga Vxmax. Töö käik Kolonni iseloomustamine Kasutusel on geelkromatograafia kolonn nr 3 (aknast kõige kaugemal). Kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark G-75 k = 0,1 Fraktsioneerimispiirkond: 3000 80000 D Materjal: dekstraan Täidise kõrgus L = 33 cm Täidise diameeter d = 1,8 cm ; r = 0,9 cm Täidise kogumaht Vt = r 2 L = 0,9 2 33 = 83,98cm3 Geelmaatriksi maht Vg = k Vt = 0,1 83,98 = 8, 40cm3 Maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt - Vg = 83,98 - 8, 40 = 75,58cm3 Fraktsioonide üldarv V max 75,58 n= x = = 37, 78 38 2 2 Voolutuslahuse koostis 50 mMTris-HCl 150 nM NaCl pH = 7,5 Uuritava proovi koostis Dekstraansinine (sinine) Müoglobiin (pruun)
neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel · absorptsiooni mõõdetakse spektrofotomeetril · värviliste segude puhu mõõdetakse vaid selliste fraktsioonide absorptsiooni, milles võib täheldada vähimatki värvust · koostatakse 3-veeruline katseandmete tabel, mille alusel tehakse kromatogramm 3. Tulemused A. kolonni iseloomustavad parameetrid Täidise materjal ja mark: Dekstraan, Sephadex G-75 Pundumistegur: k = 0,1 Täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L = 26,3; d = 1,8 Täidise kogumaht: Vt = 66,93 Geelmaatriksi maht: Vg = k*Vt = 0,1*66,93 = 6,69 Arvutatud maksimaalne elueerimismaht: Vxmax = Vt Vg = 66,93 6,69 = 60,24 Arvutatud fraktsioonide üldarv: n = Vxmax / 2 = 60,24 / 2 = 30,12 (30 fraktsiooni) B. Mõõtmistulemuste tabel ja kromatogramm Elueerimismaht Optiline Lainepikkus Fraktsiooni nr
Optilist tihedust mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel, spektrofotomeeriga elektromagnetilise kiirguse visuaalses piirkonnas. Siniseid fraktsioone mõõtsin lainepikkusel 670 nm, pruune lainepikkusel 410 nm ja kollaseid lainepikkusel 360 nm. Tulemused ja nende interpreteerimine A. Kasutatud kolonni iseloomustavad parameetrid: ·Täidise materjal: Dekstraan ·Täidise mark: Sephadex G75 ·Täidist iseloomustav pundumistegur k=0.1 ·Täidise kõrgus: 28cm ·Kolonni sisediameeter:2.2 cm ·Arvutatud täidise kogumaht Vt=106 ·Arvutatud maksimaalne elueerimismaht Vx;max=106-0.1*106=95.4 ·Arvutuslik fraktsioonide üldarv n=Vx;max/2= 95.4/2=47.7 B. Mõõtmistulemuste tabel ja kromatogramm. Fraktsiooni nr. Elueerimismaht V;ml Optiline tihedus,A 0 26 ml 0.000
Transfektsioon = transformatsioon+infektsioon Transfektsioon on võõr-DNA viimine loomarakku plasmiidi kujul (bakterite puhul nimetatakse sarnast protsessi transformatsiooniks). Viiruste abil DNA üle kandmist nimetatakse transduktsiooniks. Keemilised meetodid tekitatakse DNA-reagent kompleks: · Kaltsiumfosfaat tekitatakse kaltsiumfosfaat-DNA sade, mis lisatakse rakkudele, avastati 1973, hea odav, probleemiks efektiivsus. · katioonsed polümeerid (PEI-polüetüleenimiin, DEAE dekstraan) - soodustavad DNA seostumist membraaniga ja endotsütoosi, puuduseks toksilisus. · dendrimeerid suured hargnevad polümeerid, mis seovad DNA-d. · liposoomid ja katioonsed lipiidid (näit. Lipofectamine) fuseeruvad membraaniga, suhteliselt efektiivne, vähe toksiline, probleemiks hind. Füüsikalised meetodid. · elektroporatsioon rakule tehakse elektrisokk, mille tulemusel tekivad membraani väikesed avad ja DNA siseneb rakku. Tapab osa rakke maha.
Uuritavad segud Koosnes 3-st erineva molekulmassiga komponendist. Segus olid kõik ained värvilised, et komponentide lahutumine oleks kolonnis ka visuaalselt jälgitav ja geelkromatograafia põhimõte arusaadavam. Ühe komponendina sisaldas praktikas uuritav segu dekstraansinist (3mg/ml), mis elueerus minimaalse väljumismahuga ja mille järgi sain teada kasutatava kolonni vaba mahu (Vxmin = Vv). Dekstraansinine on kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2*106), mille külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi max lainepikkusel 625 nm. Lisaks sisaldas uuritav segu Müoglobiini (6mg/ml), mille molekulmass on 16800 Da ja DNP- aspartaati (0,3 mg/ml). Kolonni voolutamine Enne kõige kiiremini liikuvat komponenti (dekstraansinist) kolonnis väljuva puhta vooluti kogun ühendatud fraktsioonina, milleks asetan enne voolutamise algust kolonni väljalaskeava alla 100 ml kuiva kolvi.
destilleeritud vees, sobivas puhvris või nõrgas NaCl lahuses. Meie praktikumis uuritavates segudes on kas kõik ained värvilised, et segu komponentide lahutumine kolonnis oleks ka visuaalselt jälgitav ja geelkromatograafia põhimõte arusaadavam. Ühe komponendina sisaldavad praktikumis uuritavad segud dekstraansinist(6mg/ml), mis elueerub minimaalse väljumismahuga ja mille järgi saame teada kasutatava kolonni vaba mahu (Vxmin = Vv ). Dekstraansinine on kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2·106), mille külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi max lainepikkusel 625 nm. Teine komponent oli valk müoglobiin(6 mg/ml), mille neeldusmaksimum on lainepikkusel 410 nm. Müoglobiinil on helekollane värv. Tema molekulmass on 16 800 g/mol.Müoglobiin on väga tähtis inimese kehas, kuna ta on skellet- ja südamelihase hapnik-siduv valk. Kolmas komponent, millel on kõige väiksem molekulmass oli DNP aspartaat, so asparagiinhappe
Grami järgi värvimine. Rakukesta ehitus grampositiivsetel ja gramnegatiivsetel bakteritel. Mis eristab mükoplasmasid teistest prokarüootidest? Kuidas toimib bakterirakule penitsilliin? Kuidas lüsosüüm? Mis on nende märklaudadeks? Erilised rakukestad prokarüootidel (deinokokid, arhed). L- vormid bakteritel. Bakteriraku kapsel, selle roll. Eri koostisega kapslid. Bakteriaalne tselluloos ja selle kasutamisvõimalused. Sahharoos kui juuretis kapslite sünteesil. Dekstraan ja levaan. Kuidas on seotud bakterid, sahharoos ja hambaaugud? Bakterite varuained. Too näiteid varuainete kohta (polüsahhariidid, rasvad, polüfosfaadid, tsüanofütsiin, PHA-d) ja nimeta nende varuainete funktsioonid. Miks säilitatakse varuaineid polümeriseerituna? Polühüdroksüalkanoaadid (PHA) ja bioplast. Endospoori omadused, koostis, omadused. Erinevus vegetatiivsest rakust. Endospoori funktsioon. Kui kaua säiluvad endospoorid idanemisvõimelised ja millest säilumine sõltub
destilleeritud vees, sobivas puhvris või nõrgas NaCl lahuses. Meie praktikumis uuritavates segudes on kas kõik ained värvilised, et segu komponentide lahutumine kolonnis oleks ka visuaalselt jälgitav ja geelkromatograafia põhimõte arusaadavam. Ühe komponendina sisaldavad praktikumis uuritavad segud dekstraansinist(6mg/ml), mis elueerub minimaalse väljumismahuga ja mille järgi saame teada kasutatava kolonni vaba mahu (Vxmin = Vv ). Dekstraansinine on kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2·106), mille külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi max lainepikkusel 625 nm. Teine komponent oli valk müoglobiin(6 mg/ml), mille neeldusmaksimum on lainepikkusel 410 nm. Müoglobiinil on helekollane värv. Tema molekulmass on 16 800 g/mol.Müoglobiin on väga tähtis inimese kehas, kuna ta on skellet- ja südamelihase hapnik-siduv valk. Kolmas komponent, millel on kõige väiksem
seotud trisahhariidiga, milles domineerib mannoos. Vees on üsna lahustuv. Viskoossus on suurel määrav sõltuv temperatuurist. Stabiliseeriv ja suspendeeriv võime. 19) Skleroglükaan Scerotium'i liigid Vees väga lahustuv. Lahused on kõrge viskoossusega ja omavad pseudoplastilisi tiksotroopseid omadusi. 20) Dekstraan Bakterites Vees väga lahustuv. Kasutatakse paksendajana ja stabiliseerijana 21) Inuliin ja oligofruktoos Lahustub soojas vees ja on leelisekindel 22) Polüvinüül pürolidoon (PVP) Üsna lahustuv vees ja orgaanilistes lahustites Moodustab lahustumatuid komplekse fenoolsete ühenditega ja seega leiab kasutamist jookide tööstuses selitajana. Pektiin
Süües tärkliserikkaid produkte, toimub inimese seedetraktis selle biopolümeeri ensümaatiline hüdrolüüs, mis annab rohkesti glükoosi. Kõige tärkliserikkamad on kartuli, bataadi ja kassaava mugulad ning teraviljade terad. Tselluloos on eluslooduse enimlevinud biopolümeer olles taimede rakukesta põhikomponent. Aktiveerib mao ja soolestiku motoorikat, seedemahlade eritumist ja loob täiskõhu tunde. Ei lõhustu, organism ei omasta. Kitiin, inuliin, agar-agar, dekstraan H e t e r o p o l ü o o s i d ehk heteropolüsahhariidid Koosnevad reeglina korduvatest disahhariidsetest "plokkidest", need plokid koosnevad omakorda erinevate monooside derivaatidest. Võivad sisaldada ka teisi, mitte süsivesikulisi aineid, näiteks orgaanilisi happeid, lämmastikaluseid. Organismis on nad kompleksis valkudega (glükoproteiinid) ja rasvadega. Organismile olulised heteropolüoosid on: hüaluroonhape - on põhiliseks rakkudevahelise aine koostisosaks
Leu, Ile, Met, Phe, Thr, Trp, Val; Cys, Glu, Tyr), Kasvufaktoreid, Vitamiine, Seerumit,(Kinnitus maatriksit (ECM kinnituseks) koosneb kollageenist, hüaluroon happest ja teistest ECM valkudest). Osad võivad kasvada ka 3D geelis ja suspensioonis. · Mida nimetatakse transfektsiooniks, milliseid alternatiivseid meetodeid saab kasutada? Transfektsioon on võõra DNA viimine rakku. Keemilised meetodid. Kaltsiumfosfaadi meetod, DEAE dekstraan Füüsikalised meetodid. Mikroinjektsioon ja elektroporatsioon Membraanide fusioonid. Liposoomid, katioonsed lipiidid ja DNA kompleks lipofektsioon (DNA) konstrukti sisestamine viiruste abil. DNA viirused= näit. SV 40 (simian virus) pôhinevad vektorid · Mis on GFP, milliseid konkreetseid ekspresioonikonstrukte praktikumis kasutati? GFP-green fluoroescent protein, GFP võib funktsioneerida kui proteiin tag, ta viiakse
glükosiidsidet. Seda ensüümi leidub inimese paljudes kudedes (pisarad, veri, sperma jne). Ensüümi roll: hävitada baktereid. o Glükosiidsidet peptidoglükaani glükaanahelas saab lüüsida lüsotsüümiga. o Märklauaks on glükosiidside 10. Bakteriraku kapsel, selle roll. Eri koostisega kapslid. Sahharoos kui juuretis kapslite sünteesil. Dekstraan ja levaan. Kuidas on seotud bakterid, sahharoos ja hambaaugud? Bakteriraku kapsel, selle roll o Kaitseb rakku kuivamise eest. o Takistab faagide adsorbeerumist rakule. o Kaitseb fagotsütoosi eest. o Liidab rakke niitideks ja agregaatideks o Takistab hapniku difusiooni rakku. o Võib osaleda bakteri libiseval liikumisel. o Takistab toksikantide tungimist rakku. o Osaleb rakkude adhesioonil pindadele.
Ta on ülekaalukalt meie toidu peamine süsivesik. Süües tärkliserikkaid produkte, toimub inimese seedetraktis selle biopolümeeri ensümaatiline hüdrolüüs, mis annab rohkesti glükoosi. ◦ Tselluloos on eluslooduse enimlevinud biopolümeer, mis on taimede rakukesta põhikomponent. Aktiveerib mao ja soolestiku motoorikat, seedemahlade eritumist ja loob täiskõhu tunde. Ei lõhustu, organism ei omasta. Siia võib tuua ka kitiin, inuliin, agar-agar, dekstraan POLÜSAHHARIIDID EHK POLÜOOSID Heteropolüoosid ehk heteropolüsahhariidid. koosnevad reeglina korduvatest disahhariidide "plokkidest" ja need plokid koosnevad omakorda erinevate monooside derivaatidest. Võivad sisaldada ka teisi, mitte süsivesikulisi aineid, näiteks orgaanilisi happeid, lämmastikaluseid. Organismis on nad kompleksis valkudega (glükoproteiinid) ja rasvadega. ◦ hüaluroonhape on põhiliseks rakkudevahelise aine koostisosaks, mida leidub
Redutseeriva oligosahhariidi määrab vaba hemiatsetaalsne OH, st vaba redutseeriv ots. Sahharoos ei ole redutseeriv (taandav) suhkur. Olulisemad disahhariidid: maltoos, laktoos, sahharoos, tsellobioos, isomaltoos. 5. Polüsahhariidid e polüüsid koosnevad väga paljudest glükosiidsidemetega ühendatud monosahhariidi molekuli jääkidest. Funktsioonid: energiavaru: tärklis, glükogeen, dekstraan, inuliin. Struktuurne e ehituslik: tselluloos, kitiin, ksülaan, galaktaan. Molekulaarne äratundmine: rakupinna polüsahhariidid. Tärklis on glükoosi varu taimedes. Sisaldab 2 tüüpi glükoosi polümeere, millest 10-30% on amüloos ja 70-90% amülopektiin. Glükogeen on glükoosivaru loomades. Energiavaru, mis moodustab kuni 10% maksa ja 1-2% lihaste massist. Koosneb glükoosijääkidest, mis ühendatud (1,4)-glükosiidsidemetega
Geelfiltratsioonimaterjalide iseloomustus Fraktsioneerimispiirkond, Materjal Mark daltonit (D) Sephadex G-10 50700 G-25 10005000 Dekstraan G-50 100030000 G-75 3000-80000 G-100 4000150000 G-200 5000600000 Bio-Gel P-2 1001800 P-6 10006000
Oligosahhariidid on liitsuhkrud, mis koosnevad väikesest arvust (2,3,4...) mono- sahhariidi molekuli jääkidest, mida seovad glükosiidsidemed. Polüsahhariidid e. Polüoosid koosnevad tuhandetest glükosiidsidemetega ühendatud monosahhariidi (monoosi) molekuli jääkidest * Lineaarsed ahelad- tselluloos, amüloos, pektiin, kitiin * Hargnenud ahelaga - glükogeen, amülopektiin Klassifikatsioon funktsiooni järgi ja esindajad · Energiavaru: tärklis, glükogeen, dekstraan, inuliin · Struktuurne e. ehituslik: tselluloos, kitiin, mannaan, ksülaan, galaktaan, peptidoglükaanid (bakterite rakukestades) · Molekulaarne äratundmine: rakupinna polüsahhariidid (glükoproteiinid, proteoglükaanid, lipopolüsahhariidid) Steroidid polütsükli-lised ühendid, sisaldavad 3 tsükloheksaani ja 1 tsüklopentaani tuuma ehk steraani skeletti. Kolesterool - levinuim steroid loomsetes organismides, kõikide loomsete steroidide lähteühend.
KAPSLITE KOOSTIS: 1. Homopolüsahhariidsed kapslid: Tüüpiline on disahhariid sahharoosi kasutamine juuretisena kapsli polüsahhariidi sünteesil. Sahharoosist saab sünteesida kahte sorti homopolüsahhariide: glükaane (koosnevad glükoosist) ja levaane (koosnevad fruktoosist). Sahharoos hüdrolüüsitakse ja sideme hüdrolüüsil vabaneva energia arvel polümeriseeritakse kas fruktoosi või glükoosi jäägid. Glc-Fru ® Glc-Glc-Glc-Glc +Fru (glükaan e. dekstraan, sünteesi viib läbi dekstraansukraas) Glc-Fru ® Fru-Fru-Fru-Fru + Glc (levaan, sünteesi viib läbi levaansukraas) Hambakatu bakterid Streptococcus salivarius, Actimomyces viscosus ja Streptococcus mutans toodavad sahharoosist polüfruktoosi ehk levaani (beeta 2-6 sidemed Fru jääkide vahel). Levaani sünteesitakse rakukestaga seotud ensüümi levaansukraasi abil. Kapsel kleebib bakterid hammaste pinnale ja suhkrute kääritamisel kapslitesse ja kattu kogunev
glükoosi/fruktoosi jääkidest). Tüüpiline on sahharoosi kasutamine kapsli polüsahhariidi sünteesil. Kahte sorti homopolüsahhariide sünteesitakse: glükaanid 26 (glükoos) ja levaanid (fruktoos). Sahharoos hüdrolüüsitakse ja sideme hüdrolüüsil vabaneva energia arvel polümeriseeritakse kas fruktoosi või glükoosi jäägid. Glc-Fru Glc-Glc-Glc-Glc +Fru (glükaan e. dekstraan, sünteesi viib läbi dekstraansukraas) Glc-Fru Fru-Fru-Fru-Fru + Glc (levaan, sünteesi viib läbi levaansukraas) a. Dekstraankapsel. Dekstraankapslid sünteesivad Streptococcus mutans, Leuconostoc mesenteroides. S. mutans- kapsel kleebib bakteri hamba pinnale, suhkru käärimisel moodustuv piimhape tekitab kaariest. L. mesenteroides- ohtlik saastaja suhkru- ja kondiitritööstuses. Leuconostoc mesenteroidese poolt
1. homopolüsahhariidsed kapslid 2. heteropolüsahhariididsed kapslid 3. valgulised kapslid. Tüüpiline on disahhariid sahharoosi kasutamine juuretisena kapsli polüsahhariidi sünteesil. Sahharoosist saab sünteesida kahte tüüpi homopolüsahhariide: glükaane (koosnevad glükoosist) ja levaane (koosnevad fruktoosist). Sahharoos hüdrolüüsitakse ja sideme hüdrolüüsil vabaneva energia arvel polümeriseeritakse kas fruktoosi või glükoosi jäägid. 46. Dekstraan ja levaan. Kuidas on seotud bakterid, sahharoos ja hambaaugud? Dekstraankapslit sünteesivad sahharoosist Hambakatubakter Streptococcus mutans, piimhapebakter Leuconostoc mesenteroides. Levaani sünteesitakse rakukestaga seotud ensüümi levaansukraasi abil. Hambakatu bakterid Streptococcus salivarius, Actimomyces viscosus ja Streptococcus mutans toodavad sahharoosist polüfruktoosi ehk levaani. Kapsel kleebib bakterid hammaste pinnale ja
haigustega. Haigusprotsessi käivitab organismi mikroobid. § Hambakatt - bakterirakkudest (60-70 vol%), sülje polümeeridest, bakteriaalsed ekstratsellulaarsed produktid - loomulik biofilm. Tulemuseks on rikkalik bakteriaalsete metaboliitide kontsentratsioon hamba pinnal. § Domineerivad Streptococcus sanguis ja S. mutans. § Katu teke algab streptokokkide kleepumisega sülje glükoproteiinidele. Järgneb tugevam kleepumine rakuvälistele polümeeridele (dekstraan + levaan = glükaanid), mida toodavad bakterid toidusuhkrutest. Viimased moodustavad katu maatriksi. § Kaaries on hamba emaili, dentiini ja tsemendi destruktsioon demineralisatsiooni tulemusena. Viimast põhjustab katus olevate bakterite poolt suhkrute lõhustamisel toodetavad happed. Alguses oluline S. mutans, kuid hiljem ka Lactobacillus, Actinomyces jt. Konjunktiivi mikrofloora § Mikrofloora varieeruv, kuid bakterite hulk väike. §
annaabi.ee 
