Loksutasin lahust hoolikalt. Kolmandasse katseklaasi pipeteerisin teist katse klaasist 5 ml 0,125 mg/ml kontsentratsiooniga lahust ning 5 ml destilleeritud vett, mille tulemusel sain 0,062 mg/ml kontsentratsiooniga lahuse ning loksutasin katseklaasi hoolikalt. Värvusreaktsiooni läbiviimine Reaktsiooniks tööreaktiiviga pidin võtma 6 kuiva ning puhast katseklaasi ning need nummerdama. Katseklaasi nr 1 pipeteerisin automaatpipetiga 1 ml destilleeritud vett, mis oli kontrollkatseks e 0-prooviks. Uuritava lahusega tuli teha kaks parallelkatset ehk katseklaasi nr 2 ja 3 pipeteerisin automaatpipetiga 1 ml uuritavat lahust. Katseklaasi nr 4, 5 ja 6 pipeteerisin automaatpipetiga 1 ml eelnevalt valmistatud 3 erineva kontsentratsiooniga kontrolllahust. Igasse katseklaasi pipeteerisin 3 ml tööreaktiivi ja loksutasin koheselt, et saavutada ühtlast
093421 KATB41 3.3. Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil Katse käik: 1. Uuritava lahuse ettevalmistamine : prooviks, milles hakatakse glükoosisisaldust määrama, on sidrunimahl. Proovi saamiseks pressisin kõigepealt sidrunist välja väikese koguse mahla (1-2 ml) ning tegin sellest praktikumi juhendaja soovituste kohaselt 50-kordse lahjenduse. Selleks pipeteerisin 0,5 ml sidrunimahla automaatpipetiga 25ml mõõtkolbi ning täitsin kolvi kriipsuni destilleeritud veega. 2. Glükoosilahuse valmistamine kalibreerimisgraafiku koostamiseks: Glükoosilahused valmistan glükoosi standardlahuse lahjendamise teel proovide järjestikkusel lahjendamisel saades lahused kontsentratsioonidega 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Lahjendused tehakse samm-sammulisel lahjendamisel. Selleks valmistatakse esmalt
kogumaht Vt. Siis arvutati geelimaatriksi maht Vg = k Vt ning Vxmax = Vt Vg. Fraktsioonide üldarvu leidmiseks (kui ühe fraktsiooni maht on 2 ml): n = Vxmax / 2 Vastavalt leitud fraktsioonide arvule võeti kalibreeritud katseklaasid ning nummerdati. Avati kolonni väljavooluava ning vedelikku koguti väiksesse keeduklaasi, kuni vedeliku tase oli jõudnud täidise pinnani. Kolonni väljavooluava suleti. 0,5 ml automaatpipetiga sisestati kolonni uuritav proov, avati kolonni väljavool ning esialgu väljuvat eluaati koguti väiksesse mõõtsilindrisse. Kui kolonnis liikuv esimene sinine riba oli jõudnud kolonni põhja lähedale, hakati eluaati koguma nummerdatud katseklaasidesse 2 ml kaupa. Fraktsioonide kogumine lõpetati, kui eluaat oli muutunud värvituks. Ainete kontsentratsiooni igas fraktsioonis väljendati lahuse absorbtsiooni ehk optilise
Suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus leitakse tiitrmiseks kulunud CuSO 4 hulga järgi kaliibrimissirgelt. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites: vedela ensüümipreparaadi korral μkat/ml, tahke preparaadi puhul μkat/g. Tiitrimisel toimub järgnev reaktsioon: Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Valmistan vajaliku koguse sobiva ensüümikontsentratsiooniga lahust. Lahustina kasutan atsetaatpuhvrit, mille pH=4,8. Mõõdan automaatpipetiga 1 ml vedelat ensüümpreparaati ning viin selle gradueeritud katseklaasi. Lisan 9 ml atsetaatpuhvrit. Alglahus: 0,2 ml, 50 x lahjendus kokku 10 ml Sulen katseklaasi korgiga, lahust loksutan kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüs) läbiviimine Pipeteerisin 50 ml mahuga katseklaasi 25 ml 7%-list sahharoosi lahust atsetaatpuhvris pH-ga 4,8 (substraat). Sulgesin katseklaasi korgiga ning asetasin vesitermostaati 30°C juurde soojenema 10 minutiks.
Töö käik: Määran glükoosisisaldust tundmatus proovis (greibimahl). Kasutan tööreaktiivi, mis sisaldab ensüüme GOD ja POD, kromogeenset substraati K3[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6, sest reaktsioon toimub happelises keskkonnas. Töö reaktiiv on ettevalmistatud, materjalide kokkuhoiu mõttes. Uuritava proovi (greibimahla lahjendus) ettevalmistamine: Valmistasin greibimahlast 1:100 lahjenduse. Selleks pipeteerisin automaatpipetiga 0,5 ml pigistatud greibi mahla 50 ml kolbi, täitsin kolvi kriipsuni destilleeritud veega ning loksutasin segamini. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks: Valmistasin 1,0 mg/ml kontsentrasiooniga glükoosi lahusest 3 lahjendust: 0,25, 0,125 ja 0,062 mg/ml. 0,25 mg/ml lahjendus: pipeteerisin puhtasse katseklaasi 2,5 ml glükoosi standardlahust ja lisasin dest. vett 7,5 ml, panin katseklaasi korgi peale ja loksutasin.
3.1. Invertaasi aktiivsuse määramine Invertaas, süstemaatilise nimetusega -D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas (EC 3.2.1.26) on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidenete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib -D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule: Sahharoos on looduses kõige levinum -D-fruktoduranosiid ja tema hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on -D-fruktoos ja -D-glükoos. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, paljud taimed, aga ka mesilased. Invertaasi preparaatide aktiivsuse määramisel kasutatakse reeglina substraadina sahharoosi. Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava i...
Selles reaktsioonis tekkiv hägune väävlisade on kergelt jälgitav ning suhteliselt lahjade (~ 1%) lahuste korral on ajavahemik lahuste kokkuvalamise hetkest kuni hägu tekkimiseni mõni minut. Töö õnnestumise eelduseks on puhtus. Katseklaasid tuleb enne töö algust pesta hoolikalt kraanivee ja harjaga ning loputada 2...3 korda destilleeritud veega. Samuti toimitakse kahe katse vahel ning töö lõpul. Eksida ei tohi pipeteerimisel õige lahus õige pipetiga. Pipeteerimisel automaatpipetiga valida sobiv automaatpipett ja panna pipeti otsa sobiv otsik. Edasi valada pipeteeritavat lahust pudelist välja väikesesse keeduklaasi. Kontrollida automaatpipetil olevat mahtu. Vajadusel reguleerida kruvi, nii et pipeti skaala näit vastab soovitud ruumalale. Vajutada pipeti peal olevale nupule kuni esimese tõrkeni (MITTE lõpuni). Hoida nuppu all ja samaaegselt asetada pipett otsikuga lahusesse, mida soovitakse pipeteerida. Aeglaselt lasta pipeti nupp lahti
Teises katses tuli raua mõõtelahust valmistada. Kalibreerimiskõvera koostamiseks vajalike raud(III) mõõtelahuste valmistamiseks kasutada valmis Fe(III) standardlahust kontsentratsiooniga 0,1 mg/mL (Fe3+). Mõõtelahused valmistada 50 mL mõõtkolbides. Iga tudeng valmistas ühe mõõtelahuse. Pipeteeritava raud(III) standardlahuse kogus oli minul 1,2 ml. Arvutada Fe(III) kontsentratsioonid mg/mL ja mg/L valmistatud mõõtelahustes. Andmed kanda järgnevasse tabelisse. Pipeteerida automaatpipetiga vajalik kogus Fe3+ standardlahust mõõtkolbi, lisada 4 mL 50% sidrunhappe lahust ja segada, edasi lisada 5 mL 10% sulfosalitsüülhappe lahust ja loksutada. Edasi lisada 10 mL kontsentreeritud ammoniaakhüdraati. Loksutada. Lõpuks täita kolb destilleeritud veega kriipsuni, sulgeda korgiga ning segada. Lahus on kollaka värvusega, ammoniaakhüdraadi lisamisel muutus soojaks, vee lisamisel toimus kerge kihistumine, mis mõne aja pärast kadus. Sidrunhapet
Tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi leitakse varemkoostatud kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse vedela ensüümipreparaadi korral mikrokatalites ensüümilahuse 1ml kohta. TÖÖ KÄIK: Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine. Töölahuse maht on 10 ml ning vedela preparaadi maht on 1:40 ehk 10/40=0.25 ml. Mõõtsin selle automaatpipetiga katseklaasi ning lisasin atsetaatpuhvrit pH väärtusega 4.8. Sulgesin katseklaasi korgiga ning loksutasin. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine. · Võtsin 50 ml mahuga katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml substraati, milleks on 7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4.8.Panin katseklaasile kile peale ja asetasin umbes 5-10 minutiks vesitermostaati 30+-1 kraadi juurde soojenema.
Tööreaktiivi tuleb säilitada külmkapi temperatuuril kuni tarvitamiseni. Meie reaktiiv oli juba laual valmis, kuna enne kasutamist pidi see taas soojenema toatemperatuurini. Meloni lahuse ettevalmistamine Minu katses oli tundmatuks prooviks naturaalne melonimahl. Mahla kättesaamiseks surusin viljaliha noaga ja tilgutasin mahla pisikesse keeduklaasi. Pidin tegema mahlast 250-kordse lahjenduse. Selleks pipeteerisin automaatpipetiga 1 ml melonimahla 250 ml koonilisse kolbi (mõõtkolbi, tähistatud oli 250 ml joon). Lahjendasin mahla destilleeritud veega. Vett lisasin kuni 250 ml kriipsuni. Mõõtmine toimus silma järgi. Kuna mahla lahus jäi hägune, filtreerisin osa sellest katseklaasi. Glükoosilahuste valmistamine Glükoosi kontsentratsiooni määramiseks tundmatus proovis tuleb koostada kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni mõõdetava optilise tihedusega.
Tallinna Tehnikaülikool Matemaatika-loodusteaduskond Geenitehnoloogia Instituut Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum YTM0012 MOLEKULAARBIOLOOGIA PRAKTIKUM Pipeteerimine Automaatpipetiga pipeteerimise põhitõed Pipeteerimisel on kõige olulisem võtta õige suurusega pipett Pipeteeritav vedelik peab olema homogeenne. Seintelt ja korgi küljest tuleks tilgad ja kondensaat põhja fuugida Enne pipeteeritavasse lahusesse viimist vajuta kolb esimese astmeni alla. Pipeti tühjenemiseks on vaja vajutada kolb teise astmeni. Viskoosse lahuse pipeteerimine
Kuumad kolvid võetakse pliidilt ja jahutatakse voolava kraanivee all. Jälgitakse, et kolvidesse ei pritsiks kraanivett, sest see rikub töö tulemuse (triloon-B komplekseerub kraanivees leiduvate metallidega). Pärast keetmist on esimeses, 0-prooviga kolvis sinine lahus. Teises kolvis on tumesinises lahuses veidi punast sadet. Kolmandas kolvis on punane Cu2O sade kõige märgatavam. Igasse kolvi lisatakse 0,2 ml ehk 200 l indikaatori mureksiidi vesilahust (automaatpipetiga). Kõikides kolvides omandavad lahused kerge violetse tooni. Seejärel toimub tiitrimine. Tiitrimiseks kasutatakse 0,02 M CuSO4 lahust. Tiitritakse, kuni kolvide sisu omandab püsiva roheka värvuse. Esimeses kolvis sain mererohelise värvuse. Tiitrisin veidi üle, seega lahutan mõõdetud 1,8 ml mahust ühe tilga mahu (0,025 ml). Teises kolvis kulus tiitrimiseks suurem hulk, samuti lahutan ühe tilga, mille lisasin püsiva värvuse kontrollimiseks (mõõdetud maht 10,1 ml). Kolmandas kolvis
TÖÖLAHUSE VALMISTAMINE: TÖÖLAHUSE MAHT 10 ml LAHJENDUSMÄÄR 40x lahjendus VEDELA PREPARAADI VAJALIK MAHT 10 ml/40 = 1/4= 0,25 ml ENSÜÜMREAKTSIOONIKS 0,5 ml KASUTATAVA ENSÜÜMI MAHT (Invertiin) 1. Doseerin vedelat preparaati automaatpipetiga gradueeritud katseklaasi 2. Lisan sobiva lahjendusmäära saamiseks vajalik kogus puhvrit. 3. Sulgen katseklaasi korgiga ja loksutan lahust kontsentratsioonide ühtlustamiseks ENSÜÜMREAKTSIOONI (SAHHAROOSI HÜDROLÜÜSI) LÄBIVIIMINE: 4. Võtan 50 ml mahuga katseklaasi 5. Pipeteerin sinna 25 ml substraati (7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvriga, mille pH=4,8) 6. Varustan katseklaasi korgiga ja asetan 5-10 minutiks vesitermostaati 30±1 °C juurde
suhkrute sisaldus mg-des 1 ml-s reaktsioonisegus võetud proovis. Seda kasutades saan arvutada ensüümi preparaadi aktiivsuse. · Töö käik etappide kaupa Ensüümpreparaadi töölahuse valmistamine Praktikumi juhendaja näpunäidete järgi valmistasin vajaliku koguse sobiva ensüümi kontsentratsiooniga lahust (nn töölahust). Lahustina kasutasin atsetaatpuhvrit pH väärtusega 4,8. Vedelat invertaasi lahust lahjendasin puhvriga 50 korda, ehk pipeteerisin automaatpipetiga gradueeritud katseklaasi 0,2 ml invertaasi lahust ja seejärel täitsin katseklaasi kuni 10 ml-ni puhverlahusega. Sulgesin katseklaasi korgiga ja loksutasin lahust kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine Kõigepealt võtsin 50 ml mahuga katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml substraati, milleks oli 7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH-väärtusega 4,8. Katseklaasi varustasin korgiga ja
Ensüümide kokkuhoiu eesmärgil ei valmista iga üliõpilane tööreaktiivi ise, vaid töötab ettevalmistatud tööreaktiiviga. Tööreaktiiv säilitatakse külmkapi temperatuuril. Uuritava lahuse ettevalmistamine Antud töös määrasin sidruni glükoosisisaldust. Selleks pressisin sidrunist natuke mahla välja. Praktikumi juhendajalt sain lahjendusmäära: 1 ml sidrunimahla 25 ml lahuses. Lisasin 25 ml-sesse mõõtekolbi 1 ml sidrunimahla (automaatpipetiga) ning täitsin kolvi sisu destilleeritud veega kriipsuni. Sain sidrunimahla 25x-se lahjenduse. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Glükoosi kontsentratsiooni tundmatus proovis kindlakstegemiseks tuleb esmalt koostada kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga (A) e optilise tihedusega (D) lainepikkusel λ=410 nm. Graafiku x-telg näitab glükoosi
vabaneda surnutest rakkudest ja seerumi- ja söötmijaakidest ja valmistada rakud trüpsiiniga töötlemiseks Imesin vaakumiga PBS Lisasin 0,2 ml trüpsiin-EDTA 5 min-ks. Trüpsiin on proteaas, mis lõikab katki rakuadhesiooni valgud selleks, et rakud plastiku küljest lahti saada. Lisalin 1 ml söödet (DMEM + 10% FBS + PEST) selleks, et inhibeerida proteaasi. Suspendeerisin rakud automaatpipetiga tassi küljest lahti. Tassile peab jääma rakkude tihedus 10%. Meie hinnatud rakkude tihedus on 20%, seega tassile peab jääma 600 μl rakususpensiooni. Ülearustest rakkudest (600 μl) tehakse lüsaati, seega tõstsin rakud pipetiga uue epsi. Lisasin 3,4 ml söödet, tegin 8-kujulisi liigutusi ning panin tass CO2 inkubaatorisse. 3. Praktikum - rakkudest lüsaadi valmistamine (2014): Genoomse DNA eraldamine imetajarakkudest
transfektsioonisegu kohe klaasile ning alles seejärel inkubeerisime 15 minutit. Rakkude külvamine 24-augulisele plaadile 6. Rakkude vaatlemine mikroskoobis. Rakkude tihedus umbes 100% 7. Rakkudelt imeda vaakumiga sööde, pesta 1 ml PBSiga , PBS ära imeda. 8. Lisada trüpsiin-EDTA lahust 0,2 ml, inkubeerida mitte rohkem kui 5min. 9. Lisada 1ml söödet (DMEM + 10% FBS NB! antibiootikumideta), suspendeeri rakud 1ml automaatpipetiga tassi küljest lahti. 10. Teha söötmega sobiv lahjendus, et rakkude lõpptihedus 24-augulisel plaadil oleks 33,3%. Arvestada 0,5 ml rakususpensiooni augu kohta. Selleks võtta 40 µl rakususpensiooni ja 410 µl söödet augu kohta. 11. Pipeteeri rakususpensioon klaasidel olevatele transfektsioonisegudele, loksuta. 12. Aseta rakud inkubaatorisse: 37°C, 5% CO2 13. 2-4h möödudes pesta rakke 1xPBS-ga ja lisada rakkudele värske sööde (nüüd võib sisaldada ka antibiootikume).
I RAPD-PCR REAKTSIOONI ETAPP – DNA ERALDAMINE PCR reaktsiooniks on vaja DNA vabastada bakerirakust. See kehtib nii puhaskultuuri kui vahetult kliinilise materjali korral. Üks lihtsamaid DNA vabastamise meetodeid on bakterite termiline töötlemine. Kuumuse mõjul bakteri sein puruneb ja DNA vabaneb ümbritsevasse keskkonda. 1) Valmistada kuumutamiseks bakterite suspensioon 1,5 ml Eppendorfi katsutis. Selleks pipeteerida automaatpipetiga Eppendorfi katsutisse 10 µl steriilset destilleeritud vett. Lisada steriilse pulgaga Petri tassilt 1 koloonia, segada vorteksil kuni kaovad kõik nähtavad tükid. 2) Mikroobisuspensiooni kuumutamine DNA vabastamiseks. Asetada valmistatud bakterite suspensioon PCR masinasse, kuumutada suspensioone 950 C juures 10 min jooksul (spetsiaalne programm). II RAPD-PCR REAKTSIOONI ETAPP – VAHETU PCR REAKTSIOONI TEOSTAMINE 3) PCR segu valmistamine
annaabi.ee 
