1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL Õppejõud: Priit Eek, Kaia Kukk Tallinn 2013 Sissejuhatus Viienda praktikumi (1. aprill 2013) jooksul sooritati laboratoorne töö 2.1, mille teemaks oli ainete lahutamine geelkromatograafia meetodil. Töö sisuks oli geelkromatograafia kolonni ettevalmistamine, uuritava proovi kolonni sisestamine ja kolonni voolutamine. Töö nõudis pidevat tähelepanu, kuna voolutuslahust tuli juurde lisada iga paari minuti tagant, et kolonn kuivaks ei jääks. Samuti tuli vahetada kalibreeritud katseklaase, et koguda fraktsioone täpselt 2 ml kaupa. Töö viimases faasis mõõdeti iga fraktsiooni optiline tihedus spektrofotomeetril. Järgnevalt on toodud geelkromatograafia teoreetiline osa, seejärel töö käik, tulemused ning järeldused. Teoreetiline osa
maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt - Vg · Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vxmax / 2. · Statiivi pannakse vajalik kogus kalibreeritud ja nummerdatud katseklaase. · Märgitakse üles voolutuslahus ja varustatakse end sobiva pipetiga, millega saab lahust kolonni lisada. · Varutakse väike keeduklaas, kuhu lastakse alguses täidise pinnal olev eluent. Segu komponentide lahutamine. · Avatakse kolonni väljavooluava ja kogutakse voolutuslahust kuni see jõuab täidise pinnani. Samal ajal reguleeritakse vooluiirus. · Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava ja kolonn on valmis proovi sisetamiseks. Proovi sisestamine · Uuritav segu viiakse ettevaatlikult kolonni lastes sel tasapisi täidisele tilkuda. · Kui proov on sisestatud, avatakse väljavool ja lisatakse kiiresti pipeti abil väike kogus eluenti. Seda tegevust korratakse kuni proov on täidisesse imbunud
7. Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega 8. n = Vxmax / 2. 9. Statiivi pannakse vajalik kogus kalibreeritud ja nummerdatud katseklaase. 10. Märgitakse üles voolutuslahus ja varustatakse end sobiva pipetiga, millega saab lahust kolonni lisada. 11. Varutakse väike keeduklaas, kuhu lastakse alguses täidise pinnal olev eluent. Segu komponentide lahutamine. 1. Avatakse kolonni väljavooluava ja kogutakse voolutuslahust kuni see jõuab täidise pinnani. Samal ajal reguleeritakse vooluiirus. 2. Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava ja kolonn on valmis proovi sisetamiseks. Proovi sisestamine 1. Uuritav segu viiakse ettevaatlikult kolonni lastes sel tasapisi täidisele tilkuda. 2. Kui proov on sisestatud, avatakse väljavool ja lisatakse kiiresti pipeti abil väike kogus eluenti. Seda tegevust korratakse kuni proov on täidisesse imbunud.
· Arvutasin geelmaatriksi mahu ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustava maksimaalse elueerimismahu . · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml. · Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastava hulga kindla mahu järgi (2 ml) kaliibritud katseklaase ja nummerasin. · Kolonni lähedusse paigutasin voolutuslahuse (eluendi) pudeli ja märkisin üles eluendi koostise. Varusin 25 ml pipeti, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varusin väikese (50 ml) keeduklaasi, kuhu kogusid kolonni täidise pinnal oleva eluendi, mis enne uuritava segu sisestamist kolonnist välja lasin. Segu komponentide lahutamine. · Avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt kolonni alla asetatud anumasse tilkuma. · Kui vedeliku tase kolonnis langes täidise pinnani, sulgesin kiiresti kolonni
seega n= Vxmax/2 = 57,6/2 =~29. o Katseklaasistatiivile asetasin fraktsioonide arvule (29) vastava hulga kindla mahu järgi (2 ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin. o Kolonni lähedusse paigutasin voolutuslahuse (eluendi) pudeli ning märkisin ülesse voolutuslahuse koositse tris HCl, 0,15 M NaCl, pH=7,5. Varusin sobiva mahuga pipeti (20 ml, 25 ml), millega voolutuslahust kolonni viia. o Varusin väikse keedukolvi (50 ml) enne uuritava segu sisestamist kolonnist välja lastava kolonni pinnal oleva eluendi jaoks. Lahutasin segu komponendid. Pärast ülalkirjeldatud ettevalmistuste tegemist avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja kolonni kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt kolonni alla asetatud anumasse tilkuma. Samal ajal reguleerisin kolonni voolukiiruse reguleerimisklambi abil piiridesse 0,7 1 mL
· Kui vedeliku tase langes geeli pinnani sulgesin kiiresti väljavooluava. · 1ml pipetiga sisestasin ühtlaselt geeli pinnale uuritava proovi, mis koosnes: 1. Dekstraansinisest 3mg/ml 2. Müoglobiinist 6mg/ml 3. ONP aspartaadist 0,3mg/ml · Kolonn oli eelnevalt täidetud elueerimislahusega mille pH = 7,5 ja koosnes: 1. 20mM Tris/HCl 2. 0,15M NaCl · Kandsin pipeti abil proovile umb. 1ml voolutuslahust ja lasin sellel täidisesse imbuda, sama protsessi kordasin veel korra. · Voolutasin kolonni 1ml/min ja kogusin fraktsioonid 2ml kaupa katseklaasidesse. · Mõõtsin kõigi fraktsioonide neeldumismaksimumid spektrofotomeeril. Eelnevalt oli kolonnist jõdnud läbi voolata 17,5ml eluaati, alates millest hakkasin fraktsioone koguma. Fraktsioonides 1-4 mõõtsin neelduvusmaksimumi sinise värvi lainepikkusel 625nm
ja õhk ei tungiks geelikihti). Sisestasin 0,5 ml uuritavat proovi «DB+Lysozyne+DnAsp» kolonni, jättes umbes 5 mm kaugusele geeli pinnast. Proov lastakse tilkuda geeli pinnale nii, et see seal võimalikult ühtlaselt jaotuks. Kui proov on sisestatud, avasin väljavool ja lisasin kiiresti pipeti abil väike kogus eluneti (NaCl). Seda tegevust korratakse kuni proov on täidisesse imbunud. Seejärel lisasin suurema koguse voolutuslahust. Kui esimene värviline riba hakkas lähenema kolonni alumisele osale alustasin eluaati koguma valmispandud katseklasidesse. Elueerimist lõpetasin, kui väljuv eluaat on värvitu. Analüüsisin võetud proovid spekrofotomeetriga, tegin vastavaid arvutusi ja kõveraid. Mõõtmised Sephadex'i mark = G75 k = 0,1 l = 24 cm d = 2 cm Vt = r2l = 75,4 cm3 Vg = k * Vt = 7,54 cm3 Vx max = Vt - Vg = 67,86 cm3 n = Vx max / 2 = 33,93 Katseandmed
Pärast ettevalmistuste tegemist avada ettevaatlikult kolonni voolutusava ning kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, siis taas sulgeda kolonni väljavooluava. Kolonn on valmis proovi sisestamiseks. Proovi lisada 0,5 ml ning lisada ettevaatlikult, nii et proov voolaks geeli pinnale nii, et see seal võimalikult ühtlaselt jaotuks. Avada väljavool kolonnist ning hakatakse eluaati koguma. Kui proov on täidisesse sisenenud, viiakse geeli pinnale kiiresti väike kogus voolutuslahust, sama korratakse paar korda ning alles siis võib geeli pinnale kanda suurema koguse lahust. Uuritavas segus on kõik komponendid värvilised, seega segu komponentide lahutumine on ka visuaalselt jälgitav. Senikaua, kuni kolonni alaossa pole veel jõudnud kõige kiiremini liikuv komponent, väljub kolonnist puhas vooluti, seda ei pea 2 ml fraktsioonidena koguma, kuna see poleks otstarbekas.
· Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti), selle kogusin 100 ml kuiva kolbi. Mõõtsin selle, sest see moodustab osa dekstraansinise elueerimismahust Vxmin. Ühendatud fraktsiooni maht: 22,5 ml. · Selleks, et uuritav proov siseneks täidisesse täielikult kandsin geeli pinnale kiiresti peale segu umbes 2 ml voolutuslahust ja kordasin protsessi seni kuni, olin veendunud, et proov on täielikult täidises. Lõpuks kandsin geeli pinnale suurema koguse voolutit. · Kui sinine riba (dekstraansinine) hakkas lähenema kolonni põhjale, eemaldasin ühendatud fraktsiooni kolvi kolonni alt ja alustasin 2 ml mahuga fraktsioonide kogumist katseklaasidesse. Elueerimise ja fraktsioonide kogumise lõpetasin kui eluaat muutus värvituks. Fraktsioonide analüüsimine:
voolata kolonni kuni vedeliku tase langes täidise pinnani. Samal ajal reguleerisin kolonni voolukiirus umbkaudu kiiruseni 0,7-1,0 ml/min. Segu doseerisin kolonni 0,5 ml. Segu koosneb 2 mg/ml dekstraansinisest; 1,5 mg/ml müoglobiinist ja 0,3 mg/mlDNP-aspartaadist. Kui proov oli liikunud täidisesse lisasin pipeti abil geeli pinnale väikese kogus voolutit ja lasin sellel sisse imbuda. Siis kandsin geeli pinnale suurema kogus voolutuslahust, lisasin seda pidevalt vastavalt vajadusele. Avasin väljavoolu ning hakkasin koguma voolutit, kuni kõige kiiremini liikuv lahuse komponent jõudis kolonni alaossa. Ühendatud fraktsiooni mahu mõõtsin pärast. Alustasin eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena. Elueerimise lõpetasin, kui väljus viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks. Fraktsioone analüüsisin spektrofotomeetri abil. Igal ainel oli oma neeldumismaksimum.
(väljavooluava endiselt suletud) Proov geeli pinnale viidud, avati välja vool ja vooluti suunati 100 ml kolbi (kuhu kogutakse nn ühendatud fraktsioon, mida kogutakse seni, kuni kõige kiiremini liikuv lahuse komponent jõuab kolonni alaossa). Kui proov oli liikunud täidisesse viidi kiiresti pipeti abil geeli pinnale väike kogus voolutit ja lasti sellel sisse imbuda. Seda korrati seni, kuni oldi veendunud, et kogu uuritav proov on kolonni sisenenud. Siis kanti geeli pinnale suurem kogus voolutuslahust. Ja lisati seda pidevalt vastavalt vajadusele Kui esimene värviline riba (dekstraansinine) lähenes kolvi põhjale, siis eemaldati kolb ja alustati eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena. Ühendatud fraktsioonis olev eluaat on osa dekstraansinise elueerimismahust, seega tuli see ära mõõta. Elueerimine lõpeteti kui väljus viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks.
kolbi, kuhu kogutakse nn ühendatud fraktsioon, mida kogutakse niikaua, kuni kõige kiiremini liikuv lahuse komponent jõuab kolonni alaossa. Ühendatud fraktsiooni maht mõõdetakse. Kui proov oli liikunud täidisesse, viiakse kiiresti pipeti abil geeli pinnale väike kogus voolutit ja lastakse sellel sisse imbuda. Seda korratakse seni, kuni ollakse veendunud, et kogu uuritav proov on kolonni sisenenud. Siis kantakse geeli pinnale suurem kogus voolutuslahust. Kui esimene värviline riba (dekstraansinine) läheneb kolvi põhjale, siis eemaldatakse kolb ja alustatakse eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena. Kogu voolutuse käigus tuleb jälgida, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja seda vastavalt vajadusele lisada ning vahetada õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimine lõpetatakse kui väljub viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks.
kiiremini liikuv komponent dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti), selle kogusin 100 ml kuiva kolbi. ( hakkasin koguma fraktsiooni, kui sinine värv oli alt kuskil 3-4 cm kaugusel) Mõõtsin selle, kuna see moodustab osa dekstraansinise elueerimismahust Vxmin. Ühendatud fraktsiooni maht: 20 ml. · Selleks, et uuritav proov siseneks täidisesse täielikult kandsin geeli pinnale kiiresti peale segu umbes 2 ml voolutuslahust ja kordasin protsessi seni kuni, olin veendunud, et proov on täielikult täidises. Lõpuks kandsin geeli pinnale suurema koguse voolutit. · Kui sinine riba (dekstraansinine) hakkas lähenema kolonni põhjale, eemaldasin ühendatud fraktsiooni kolvi kolonni alt ja alustasin 2 ml mahuga fraktsioonide kogumist katseklaasidesse. Elueerimise ja fraktsioonide kogumise lõpetasin kui eluaat muutus värvituks. · Fraktsioonide analüüsimine:
Viisin 0,5 ml uuritavat proovi kolonni, juhtides pipeti otsa vastu kolonni seina. Proovil lasksin voolata geeli pinnale nii, et see jaotuks võimalikult ühtlaselt. 1.5 Uuritavad segud Uuritav segu koosnes järgnevatest ainetest: Dekstraansinine ( 6 mg/ml ) Müoglobiin ( 6 mg/ml ) DNP aspartaat ( 0,6 mg/ml ) 2.4 Kolonni voolutamine Kui proov on täidisesse sisenenud, viin pipetiga geeli pinnale väikse koguse voolutuslahust ja lasen täidisesse imbuda. Kordan seda nii kaua, kuni kogu uuritava proov on kolonni sisenenud ja siis võib geeli pinnale kanda suurema hulga voolutit. Kui esimene värviline riba ( dekstraansinine ) läheneb kolonni põhjale, siis eemaldab kolonni alt kolvi ühendatud fraktsiooniga ja hakkan koguma eluaati 2ml kaupa katseklaasidesse. Mõõdan ühendatud fraktsiooni mahu: 22 ml . 1.6 Fraktsioonide analüüsimine
kaetud. Uuritav segu Uuritav segu koosnes kolmest erineva molekulmassiga komponendist. Uuritava segu koostisosad: 1) Dekstraansinine, 3 mg/mL 2) Müoglobiin, 6 mg/mL 3) DNP-aspartaat, 0,3 mg/mL Kolonni voolutamine Kui olin proovi viinud geeli pinnale, siis avasin väljavoolutoru ja hakkasin eluaati koguma alguses ühendatud fraktsioonina kuiva kolbi. Niipea kui proov oli täidisesse sisenenud, viisin pipeti abil geeli pinnale väikese koguse voolutuslahust ja lasin sellel täidisesse imbuda. Kordasin sama asja väikese eluendi kogusega veel teinegi kord ja siis viisin juba geeli pinnale nii palju eluenti, et moodustus u 5 cm kõrgune kiht. Kuna minul oli kolonn ühendatud eluendi pudeliga, siis rohkem enam käsitsi ma eluenti kolonni kandma ei pidanud. Kolonnis tekkis kolm värvilist riba sinine, pruun ja kollane. Kui sinine riba jõudis kolonni alla äärde, siis eemaldasin ühendatud fraktsiooni kogumise jaoks mõeldud kolvi ning edasi
See osa eluaadist kogutakse ühendatud fraktsioonina. Enne voolutamise algust asetatakse kolonni väljalaskeava alla 100 ml kuiv kolb. Ühendatud fraktsiooni maht tuleb mõõta, sest see moodustab osa kogu elueerimismahust ja tuleb kromatogrammi koostamisel arvesse võtta. Kui proov oli geeli pinnale kantud, avasin kolonni väljavooluu ja hakkasin eluaati koguma. Kui proov sisenes täidisesse, viisin kiiresti pipeti abil geeli pinnale väikese koguse voolutuslahust ja lasin täidisesse imbuda. Kordasin seda teist korda ka ja siis kui veendusin, et uuritav proov on kolonni sisenenud, kandsin geeli pinnale suurema hulga voolutit, nii et moodustus 4-5 cm kõrgune vedeliku kiht. Jälgisin, kuidas kolonnis liikus esimene värviline riba-sinine- ning kui see lähenes põhjale, eemaldasin kolonni alt kolvi ühendatud fraktsiooniga ja jätkasin eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena kaliibritud ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse.
maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg: Vg = 0,1 · 78.88 = 7,87 cm3 Vxmax = 78,74 7,87 = 70,87cm3 · Arvutasin fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2 = 70,99 / 2 = 35,44 · Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin. · Märkisin voolutuslahuse koostis. Varusin sobiva mahuga (20 ml, 25 ml) pipett, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varusin väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist tuli kolonnist välja lasta. Segu komponentide lahutamine. Kui eelnevad ettevalmistused olid valmis, avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluala ning kolonnis olev voolutuslahus hakkas tilkuma. Sellel ajal reguleesin kolonni voolukiirus, et tilkus 0,7-1ml lahust minutis.
maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg: Vg = 0,1 · 78.88 = 7,89 cm3 Vxmax = 78,88 7,89 = 70,99cm3 Selline täpsus pole õigustatud! · Arvutasin fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2 = 70,99 / 2 = 35,45 · Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin. · Märkisin voolutuslahuse koostis. Varusin sobiva mahuga (20 ml, 25 ml) pipett, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varusin väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist tuli kolonnist välja lasta. Segu komponentide lahutamine. Kui eelnevad ettevalmistused olid valmis, avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluala ning kolonnis olev voolutuslahus hakkas tilkuma. Sellel ajal reguleesin kolonni voolukiirus, et tilkus 0,7-1ml lahust minutis.
maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg. · Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2. · Katseklaasistatiivi asetatakse fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdatakse. · Kolonni lähedusse paigutatakse voolutuslahuse (eluendi) pudel ja märgitakse üles voolutuslahuse koostis. Varutakse sobiva mahuga (20 ml, 25 ml) pipett, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varutakse väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogutakse kolonni täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist tuleb kolonnist välja lasta. Segu komponentide lahutamine. Kui ülalkirjeldatud ettevalmistused on tehtud, avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkab aeglaselt kolonni alla asetatud anumasse tilkuma
annaabi.ee 
