registreerimiseks/identsifitseerimiseks X-Gal värvib sinisteks rakud, mis ei sisalda huvipakkuva järjestuse, valged on need, mis sisaldavad huvipakkuva järjestuse. Põhineb alfa-komplimentaarsusel 7. Selgita mõistet ja milleks seda kasutatakse? Polycloning site faagi või plasmiidse vektori regioon, mis sisaldab mitu restriktsiooni saiti, mis on reeglina unikaalsed kogu vektori piires. Kasutatakse selleks, et oleks lihtsam vektorisse mingi järjestuse sisse viia. 8. Kuidas saab identsifitseerida/selekteerida baktereid rekombinantse plasmiidiga, kui plasmiidil on geenid, mis vastutavad nii ampitsilliini kui ka tetratsükliini resistentsuse eest ja sisend asub järjestuses, mis kodeerib tetratsükliini resistentsust? Selleks, et tuvastada huvipakkuva järjestusega baktereid, tuleb nende kolooniate osad asetada
protektiivseid epitoope. Adjuvant Adjuvant - aine, mis stimuleerib organismi immuunvastust manustamisel komleksis antigeeniga. Freund'i täielik adjuvant, mille koostisse kuuluvad mineraalõli ja mükobakterite komponendid. Vaktsineerimisel kasutatakse laialt alumiinium hüdroksüüdi - Al(OH)3 ja mõningaid teisi ühendeid. Rekombinant-vaktsiinid Vaktsiinid, mis on saadud rekombinantse DNA tehnoloogia abil; Sisestatakse antigeeni kodeeriv DNA osa vektorisse, millega nakatatakse E.coli Imineste immuniseerimiskava Eestis 1) tuberkuloos; 2) B-viirushepatiit; 3) difteeria; 4) teetanus; 5) läkaköha; 6) poliomüeliit; 7) leetrid; 8) punetised; 9) mumps; 10) Hemofilus influenza b-tüüp.
iseseisvalt replitseeruvasse DNA järjestusse. Selline replikon viiakse sobivasse peremeesrakku ja paljundatakse seal. Varasemal ajal mõeldi kloonimise all just seda meetodit. Rakuline kloonimine koosneb neljast põhietapist: 1. Rekombinantsete DNA molekulide konstrueerimine in vitro Meile huvipakkuva geeni fragment, e. insert (võõr-DNA), sisestatakse ligeerimisel isereplitseeruva geneetilise elemendi (replikoni), enamasti plasmiidi või viiruse DNA genoomi e. vektorisse. 2. Transformatsioon. Selle tulemusel saadakse uus rekombinantne DNA molekul, mis on võimeline sisenema (näit. viirusena) või mida on võimalik sisestada e. transformeerida bakteri rakku. DNA repli-katsioon toimub seal sõltumatult peremeesraku kromosoomi(de)st. 3. Selektiivne paljundamine. Individuaalsete rakukolooniate (kloonide) saamiseks külvatakse transformeeritud rakud välja selektiivsele (agar)söötmele. Viiruse või plasmiidi replikatsioonil tekib rohkem kui 1012
või IX) ravi, mida regulaarselt tehes väheneb spontaansete verejooksude ja liigesekahjustuste risk Hemofiilia raskete vormide korral ja ka näiteks operatsioonide eelselt kasutatakse hüübimisfaktori manustamist profülaktiliselt, enne kui verejooks tekib Geeniteraapia 2011. aastal teatasid Briti ja Ameerika uurijate meeskond eduka ravi avastamisest B-hemofiilia vastu Uurijad sisestasid hüübimisfaktor IX geeni adeno- assotsieerunud viirus-8 vektorisse Muudetud viirus süstiti veeni Vältimaks keha kaitsereaktsiooni viirusevektori vastu, anti patsientidele steroide, et pärssida nende immuunvastust Alternatiivne meditsiin Hüpnoos Enesesisendus Maitsetaimed, mis tugevdavad veresooni ning aitavad veresoontel kontraheeruda Dieedid Ennetamine Hoidumine vere vedeldajate manustamisest (nt aspiriin) Ettevaatus vitamiinipreparaatidega, eriti K-vit Ei tohi teha i/m süsteid Tänan tähelepanu eest!
ehk DST geen. Milleks kasutasime kloneerimisel pSTBlue-1 vektorit? Mis teeb selle eriliseks? See on meie vahevektor ja see on väga hea kuna võimaldab sini-valge skriinimist ja seal on mõlemal pool EcoRV saiti EcoRI sait, ehk seda oli väga lihtne restriktaasidega lõigata. Kas sini-valge selektsiooni kasutamisel võib õige koloonia olla ka sinine? Miks? Vahel ikka juhtub. Insert võib olla väga väike, seega lacZ jääb terveks ja koloonia värvub ikkagi siniseks. Kui tahame 5kb suurusesse vektorisse ligeerida 1000bp pikkust inserti, siis kui palju vektorit peame 50ng inserdi kohta võtma? Soovitud vektori:inserdi suhe on 1:5. Vektor : 5000bp Insert: 1000bp 10ng Kuna suhe peab olema 1:5 50ng Vektor on aga 5 korda pikem kui insert, seega on see ka 5x raskem massi poolest, ehk peame selle 10ng viiega korrutama, et saada reaalse massi. Peame võtma 50ng vektorit. Praktiline töö nr. 6: Transformeerimine
Teeb If-protseduuriga kindlaks, kas maatriksit ei ole või ristkülik - või ruutmaatriksiga, annab teate ning kui maatriks on olemas, siis vastavalt käivitab, kas ristkülik- ruutmaatriksi alamprotseduurid. RISTKÜLIKU ALAMPROTSEDUURID: Sub max_el_igas (A(),m,n,maks(),rida(),veerg()) Parameetrid: massiiv A(), ridade arv m, veergude arv n, vektror maks(), vektor rida(), vektor veerg() Leiab iga rea maksimaalse elemendi ning kannab selle väärtuse vektorisse maks() vastavasse ritta, leiab s asukoha ning kannab rea numbri vektori rida() ning veeru numbri vektori veerg() vastavasse ritta. Sub Summa_1(A(),m,n,s) Parameetrid: massiiv A(),m,n, summa s. Leiab kõikide maatriksi elementide arvude summa, mis on väiksemad etteantud arvust. Arvu saab ise valid kerimisnuppu töölehel. If -lausega teeb kindlaks, kas antud arv on suurem maatriksi elemendist, kui on siis väiksemad elemendid kokku. Sub Tee_Uus(A(), m, n, C(), k)
(üks kummaski suunas), ampitsilliini ja kanamütsiini resistentsusgeeni ja lacZ operoni, mille lugemisraami sisestame oma inserdi. See võimaldab sini-valge meetodil välja selgitada, millistes kolooniates on tühi, millistes meie inserti sisaldav plasmiid. Vektoril on T-overhangidega otsad, mis võimaldab A-overhangidega inserti sisestada. b) PCR-i produkti on võimalik vektorisse ligeerida, kuna vektoril on T-overhang otsad ning PCR-i produktil on A-overhang otsad. T ja A on omavahel komplementaarsed, seega vektori ja inserdi ,,kleepuvad otsad" ühendatakse komplementaarsusprintsiibi alusel kõigepealt vesiniksidemetega, seejärel saab ligaas sünteesida fosfodiestersidemed. Polümeraasi valikul tuleb silmas pidada, et tegemist oleks Taq
Geneetiliselt muundatud taimedeks nimetatakse taimi, kuhu on lisatud võõrast geneetilist informatsiooni, kasutades geenitehnoloogia meetodeid. Lühidalt võib protsessi kirjeldada järgmiselt. Mõne organismi genoomist on eraldatud mõni geen või geeniosa, mida uurinud teadlased on jõudnud järeldusele, et see DNA lõik kannab bioloogilist tunnust, mis võiks näiteks teatud põllumajandussordile anda mingi lisaväärtuse. Siis viiakse (kloneeritakse) see DNA lõik nn. vektorisse. Vektorid on enamasti iseseisvad bakteriaalsed DNA molekulid, mille väikeste mõõtmetega hästi paljunev molekul muudab nad suurepärasteks geenitehnoloogia tööriistadeks. Olles meid huvitava geenijupi teatud ensüümide abil ,,kleepinud" sellise vektori koosseisu ning paljundanud saadud uudse molekuli bakterirakkudes, on meil olemas kõik vajalik GM taime tegemiseks. Selles kõigeolulisemas etapis võidakse kasutada eri meetodeid. Võõr DNA võib viia
kaugetelt liikidelt, näiteks bakteritelt, teistelt taimeliikidelt ja ka loomaadelt. Kõigepealt, GM-taime loomise protsessi toimub järgmiselt. Mõne organismi genoomist on eraldatud mõni geen või geeniosa, mida uurinud teadlased on jõudnud järeldusele, et see DNA-lõik kannab bioloogilist tunnust, mis võiks näiteks teatud põllumajandussordile anda mingi lisaväärtuse. Nüüd viiakse (kloneeritakse) see DNA- lõik niinimetatud vektorisse. Geenitehnoloogia võimalused on avaramad: niimoodi saab viia taimedesse või ka teistesse organismidesse suvalisest organismist pärit geene. Sordiaretus piirdus enamasti samasse sugukonda kuuluvate taimegeenidega. Kuid geenitehnoloogia tegeleb siiski looduses leiduvate geenide ülekandega. Kultuurtaimede muundamisel tähtsamad taotlused eesmärgid on parandada saaduste
a) Mutatsiooni analüüsimiseks uuritavas DNA-s - kasutatakse alleelspetsiifilist PCR-i b) Teatud geeni ekspressioonitaseme hindamiseks - eraldatakse mRNA ja tehakse Northern blot c) Ekspressiooni klonoteegi (raamatukogu) analüüsiks, et leida meid huvitavat valku kodeeriv kloon - tehakse nailonfiltrile kantud bakterikolooniate Western blot d) cDNA klonoteegi (raamatukogu) valmistamiseks - sünteesitakse mRNA pealt DNA ja sisestatakse vektorisse 16. Mutatsioonanalüüsil allele-spetsiifilise hübridisatsiooni abil asub alleeli eristav nukleotiid alleel- spetsiifilise oligonukleotiid proovi a) Keskel b) 3' otsas c) Ühe koodoni kaugusel 3' otsast d) 5' otsas 17. Kui soovite sisestada DNA-sse teatud mutatsiooni PCR-i reaktsiooni käigus, siis millises PCR-i praimeri otsas võite antud muudatuse teha: a) Praimeri 5' otsas b) Praimeri 3' otsas 18
Tekib pisike plasmiidse DNA sade, mille pealt eemaldasin supernatanti. 8. Pipeteerisin sademele 200 μl 70% EtOH, fuugisin 5 min jooksul, et vabaneda sooladest, ning eemaldasin jälle sademe pealt etanooli. 9. Asetasin sadet kuivatada, et vabaneda etanooli jääkidest. Pärast suspendeerisin 20 μl MQ-s. 58. Nüüd DNA on puhas kontrolliks. 59. 60. 61.Kontroll-restriktsioon 62. Eesmärgiks on kontrollida kas soovitud DNA järjestus on sisestunud vektorisse nii nagu plaanitud oli. Restriktsiooni analüüsi käigus lõigatakse saadud DNA-d restriktaasiga ja vaadatakse elektroforeesil tekkinud DNA fragmentide suuruste järgi, kas soovitud DNA järjestus on plasmiidi sisestunud. Valitakse selliseid restriktaase, mis lõikavad nii inserdi kui vektori enda seest ning seejuures veel niimodi, et tekuksud erineva pikkusega jupid, mille suurust oleks hea võimalikult täpselt kasutatava DNA Ladderiga võrreldes kontrollida. 1
molekulaarbioloogia põhilistest töömeetoditest. Iga üliõpilane esitab pärast töö teostamist protokolli (kas paberil või elektroonselt), milles toob ära põhilised tulemused ja lisaülesannete vastused. Kirjelduses märgib, millised etapid läbis edukalt ja millised olid probleemsed kohad. Töö nr 1: Inimese genoomse DNA restriktsioon Cfr42I restriktaasi abil. Saadud fragmentide ligeerimine "Bluescript" pBS SK+ plasmiidi ehk vektorisse. Lähteained: Inimese genoomne DNA (<300 kb fragmentidena), mis on eraldatud adenokartsinoomi (HeLa) või teratokartsinoomi (NT2) kasvajarakkude lüüsil mitteioonse detergendi (NP40) abil. DNA on lahustatud TE* lahuses (TE*, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na 2) kontsentratsiooniga 5-10 nanogrammi/mikroliiter (ng/l). HeLa ja NT2 rakuliini kohta vaata - http://www.lgcstandards-atcc.org/ Bluescript pBS SK+ plasmiid 10 ng/l lineariseeritud Cfr42I abil (~3h restriktsioon, puhastatud
ruutudeks-piksliteks. Iga piksel omab oma värvikoodi, vastavalt aluspinnale. Rasterkaart on värviliste ruutude maatriks. 20. Digitaalsete ruumiandmete allikad (kuidas neid saadakse). Vektorandmed saadakse: digimisel( spets tark- ja riistvara, kursoriga liigitakse müüda kaardi salvestamist vajava punktikohal klõpsates, nõuab aega ja koolitust); vektoriseerimisel (digimise erijuh, spetsiaalse tarkvara abil automaatne teisendus rastrilt vektorisse) Rasterandmed saadakse: skaneerimisel ( vajalik skänneri olemasolu); vektorandmete rasterdamisel (trükkimine rasterdraiverisse, spetsiaalne konverteerimistarkvara); kaugserje (satelliitpildistus, aerofoto kamerad) 21. Tärkandmete tüübid. Kvalitatiivse andmed (piiratud väärtusega: alternatiivsed (jah, ei, 0,1) ja mittealternatiivsed (loend võimalikest kvalitatiivsest väärtusest); piiramata väärtusega (inimeste nimed)).
sellisesse DNA järjestusse, mis on võimeline iseseisvalt replitseeruma. Selline replikon viiakse sobivasse peremeesrakku ja paljundatakse seal. Varasemal ajal mõeldi kloonimise all just seda meetodit. Rakuline kloonimine koosneb neljast põhietapist: 1. Rekombinantsete DNA molekulide konstrueerimine in vitro. Meile huvipakkuva geeni fragment, e. võõr-DNA, sisestatakse ligeerimisel isereplitseeruva geneetilise elemendi (replikoni), enamasti plasmiidi või viiruse DNA genoomi e. vektorisse. 2. Transformatsioon ehk sisestamine. Selle tulemusel saadakse uus rekombinantne DNA molekul, mis on võimeline sisenema (näit. viirusena) või mida on võimalik sisestada e. transformeerida bakteri rakku. DNA repli-katsioon toimub seal sõltumatult peremeesraku kromosoomi(de)st. 3. Selektiivne paljundamine. Individuaalsete rakukolooniate (kloonide) saamiseks külvatakse transformeeritud (muundatud) rakud välja selektiivsele (agar)söötmele.
DNA kloneerimise etapid. Peremeesorganismi ja kloonimisvektori valik Vektor-DNA ettevalmistamine Kloonitava DNA ettevalmistamine Rekombinantse DNA sünteesimine ligatsiooni abil Rekombinantse DNA sisendamine peremeesorganismi Rekombinantide selekteerimine Rekombinantide analüüsimine Etapp 1. Valitud DNA tükk lõigatakse päritoluorganismist restriktsiooniensüümide abil. Etapp 2. DNA tükk „kleebitakse“ vektorisse ja DNA otsad liidetakse vektori DNA-ga ligeerimise teel. Etapp 3. Vektor sisestatakse peremeesrakku, sageli bakterisse või pärmi. Peremeesrakud kopeerivad vektori DNA koos oma DNA-ga, luues sisestatud DNA-st mitu eksemplari/koopiat. Etapp 4. Vektor-DNA eraldatakse peremeesraku DNA-st ja puhastatakse. Mis on rekombinantne valk, selle tootmise võimalused? Rekombinantne valk on valk, mida kodeerib rekombinantne DNA. On DNA kloneerimise teel saadud valk
vaja tüüp II restriktsiooni endonukleaase. Restriktaasid tunnevad ära kindlaid palindroomseid (järjestus on mõlema ahela 5’-3 suunas sama) DNA järjestusi ja on võimelised neid kindlas piirkonnas kindlas suuruses (tüüpiliselt 4-8 kb pikk) lõikama, tekitades ülekattuvate otstega fragmente, mis on samaaegselt identsed ja kompelmentaarsed, et saaks komplementaarselt paarduda. Lõigatud DNA fragmente saab sisestada sarnaselt lõigatud vektorisse, mis kannab replikatsioon origini, et rakus iseseisvalt replitseeruda. Saadakse hübriid-DNA molekulid ehk rekombinantsed DNA molekulid, mis transformeeritakse sobivasse peremeesrakku. Iga peremeesrakk võtab ühe rekombinantse DNA molekuli sisse. Transformeeritud rakud pannakse kasvama ning rekombinandid paljunevad peremehest eraldiseisvalt. Paljunemisega tekivad kloonid ehk identsed rakud. Väljaplaatimisega saab kloonid eraldada
molekulaarbioloogia põhilistest töömeetoditest. Iga üliõpilane esitab pärast töö teostamist protokolli (kas paberil või elektroonselt), milles toob ära põhilised tulemused ja lisaülesannete vastused. Kirjelduses märgib, millised etapid läbis edukalt ja millised olid probleemsed kohad. Töö nr 1: Inimese genoomse DNA restriktsioon Cfr42I restriktaasi abil. Saadud fragmentide ligeerimine "Bluescript" pBS SK+ plasmiidi ehk vektorisse. Lähteained: Inimese genoomne DNA (<300 kb fragmentidena), mis on eraldatud adenokartsinoomi (HeLa) kasvajarakkude lüüsil mitteioonse detergendi (NP40) abil. DNA on lahustatud TE* lahuses (TE*, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na 2) kontsentratsiooniga 5 nanogrammi/mikroliiter (ng/l). HeLa rakuliini kohta vaata - http://www.lgcstandards-atcc.org/ Bluescript pBS SK+ plasmiid 10 ng/l lineariseeritud Cfr42I abil (~3h restriktsioon, puhastatud
DNA- järjestus. Moodustuv hübriidne valk on sel juhul rakus UV valguses helenduv ja kvantitatiivselt mõõdetav. GFP valku saab kasutada ka valkude uurimisel elusrakus in situ tingimustel. 53. Kuidas konstrueerida üht transgeenset looma? 1. Rekombinantse DNA mikrosüstimine viljastatud munarakku haploidse tuuma naabrusse. 2. Embrüote nakatamine viirustega, kasutades tavaliselt rekombinantsete DNA- molekulide viimist retroviiruse või lentiviiruse vektorisse, mis inertseeruvad peremeesraku kromosoomi koosseisu. 3. Rekombinantse DNA viimine embrüonaalsetesse tüvirakkudesse enne nende injektisooni varase arengujärgu embrüosse. 4. Tuuma transplatsioon, kus vähem või rohkem diferentseerunud somaatilise raku tuum inserteeritakse munarakku, kust viimase enda tuum on varem eemaldatud. 54. Mis on embrüonaalsed tüvirakud?
Mittesugulisel paljunemisel lÜhikese aja jooksul saadakse vanematega geneetiliselt sarnane arvukas jÄrglaskond. Sugulisel paljunemisel jÄrglased kannavad edasi mÕlema vanema geneetilisi omadusi. Kloon on ühe raku või hulkrakse organismi mittesugulisel paljunemisel arenev geneetiliselt identne järglaskond. Geeni kloneerimise põhilised etapid on järgmised: Lineaarne DNA fragment, milles asub gloneeritav keen, isoleeritakse või sünteesitakse in vitro; See DNA lõik viiakse vektorisse, milleks on tavaliselt plasmiidi või bakteriofaagi DNA. Sinna vektorisse viidav geneetiline info on märgistatud nii et seda oleks võimalik ära tunda uues kombinantses molekulis.; Kombinantne DNA viiakse vektori abil bakteri või pärmi rakku, kus see replitseerub ja jaguneb koos peremeesorganismiga; Peremeesraku jagunemisel ja paljunemisel tekib geneetiliselt identsete rakkude kloon, mille igas rakus on üks või mitu kombinantse DNA koopiat. Rakke paljundatakse selektiivsel söötmel;
Mikrosatelliidid on väga head markerid tüpiseerimiseks, sest: Polümorfsed (kiiresti tekivad ja muteeruvad); Ühes lookuses; Neutraalsed, sest ei kodeeri midagi; Sarnased praktiliselt kõikides oragnismides. DNA Kloneerimine - Eesmärk on saada piisaval hulgal analüüsimiseks spetsiifilist ja puhast DNAd. Kloneerimise etapid: Isoleerida ja puhastada DNA organismist või rakkudest. Lõigata DNA sobiva suurusega tükkideks kasutadas restriktsiooni ensüüme. Viia need DNA tükid kloneerimis vektorisse luues rekombinantse DNA molekuli. Kloneerimise vektor kunstlik DNA molekul, mis on võimeline mingis organismis paljunema (tavaliselt vektor plasmiid, organism aga mikroob). Viia rekombinantne DNA vektoriga organismi kus ta antakse edasi paljunemise käigus järglaspõlvkonnale. Plasmiidid: Plasmiid on bakteritele iseloomulik ekstrakromosomaalne rõngasjas, kahe- ahelaline DNA molekul, mis on võimeline ise autonoomselt rakus replitseeruma. Plasmiidseid
1 Paljude kloneerimisvektorite konstrueerimisel on kasutatud bakteriofaagide genoomi ja bakterite kromosoomiväliseid elemente - plasmiide. Need võimaldavad huvipakkuvat DNA-d paljundada ja selles sisalduva geneetilise informatsiooni avaldumist uurida bakterirakus. Lisaks on konstrueeritud hulgaliselt ka eukarüootseid vektoreid, mis põhinevad enamasti eukarüoodi viiruste genoomidel. Huvipakkuvat DNA lõiku on võimalik vektorisse viia sel viisil, et nii vektorit kui ka seda DNA-d, millest soovitakse paljundada huvipakkuvaid geene, töödeldakse restriktaasidega. Restriktaasid on ensüümid, mis teevad DNA ahelatesse katked kindla nukleotiidse järjestuse kohalt. Seejärel liidetakse huvipakkuva DNA lõigu ja vektori DNA ahelate otsad ensüümiga DNA ligaas. Saadakse rekombinantsed DNA molekulid, mida on võimalik paljundada kas siis bakteri või eukarüoodi rakus.
4) geenitehnoloogia Paljude kloneerimisvektorite konstrueerimisel on kasutatud bakteriofaagide genoomi ja bakterite kromosoomiväliseid elemente - plasmiide. Need võimaldavad huvipakkuvat DNA-d paljundada ja selles sisalduva geneetilise informatsiooni avaldumist uurida bakterirakus. Lisaks on konstrueeritud hulgaliselt ka eukarüootseid vektoreid, mis põhinevad enamasti eukarüoodi viiruste genoomidel. Huvipakkuvat DNA lõiku on võimalik vektorisse viia sel viisil, et nii vektorit kui ka seda DNA-d, millest soovitakse paljundada huvipakkuvaid geene, töödeldakse restriktaasidega. Restriktaasid on ensüümid, mis teevad DNA ahelatesse katked kindla nukleotiidse järjestuse kohalt. Seejärel liidetakse huvipakkuva DNA lõigu ja vektori DNA ahelate otsad ensüümiga DNA ligaas. Saadakse rekombinantsed DNA molekulid, mida on võimalik paljundada kas siis bakteri või eukarüoodi rakus.
annaabi.ee 
