Tundmatu tüve identifitseerimine (0)

Tundmatu tüve identifitseerimine
1. Makromorfoloogilised tunnused
Visuaalselt hindasin tundmatu tüve kolooniaid , kui nad olid kasvanud kuus päeva toiteagaril toatemperatuuril.
Tunnused
Tundmatu tüvi
Koloonia:
kuju
profiil
servajoon
konsistents
värvus
ümar
kerkinud , kumer
sirge
limajas, läikiv
valkjas
2. Rakulised omadused
Gramreaktiivsuse määramiseks teostasin grami järgi värvimise . Kuigi mikroskoobis vaadates olid enamus lühikesed üksikud (agregeerumata) punased pulgad ( etanool pesi kristallvioleti-joodi kompleksi välja), leidus ka osa lillaka tooniga rakke, kes olid samuti lühikesed üksikud pulgad. Täiendavalt tegin KOHi lüüsi testi, mis näitas, et tegemist on siiski gramnegatiivsete rakkudega (tekkis iseloomulik limajas konsistents).
Tundmatu tüve liikuvuse uurimise jaoks kasutasin poolvedelat söödet ( Hugh -Leifsoni sööde ), millesse olin eelnevalt teinud pistekülvi. Külvijoone ümbrus söötmesambas oli häguseks muutnud ja liikuvust oli tuvastada.
Flouretseeruvaid pigmente – siderofoore – tuvastamiseks kasutasin rauavaest KingB söödet. UVs ei tuvastanud fluorestseeruvate pigmentide kogunemist külvijoone ümber.
3. Süsinikuallikad
Tegin joonkülvi Simmonsi agarile tsitraadi kasutamise tuvastamiseks. Agaril esines kasv ja indikaatorvärv broomtümoolsinine muutus rohelisest siniseks. Tsitraadi kasutamisega muutus söötme pH muutus aluselisemaks ja indikaatorvärv siniseks.
Käärimistüübi testimiseks viisin läbi Voges-Proskaueri testi, mis tuvastab käärimisprodukti 2,3-butaandiooli eellase atsetoiini akumulatsiooni söötmesse. Barritti reaktiivi lisades ilmus punane värvus. Seega käärimistüübiks on 2,3-butaandioolkäärimine.
Metabolismitüübi määramiseks kasutasin oksüdatsiooni/fermentatsiooni (O/F) testi, mille põhiliseks süsinikuallikaks on glükoos. Testi viisin läbi kahe paralleelse katsena kasutades kahte katseklaasi: üks agarikorgiga, teine ilma. Oksüdatsiooni test oli positiivne – glükoosi kataboliseeriti aeroobses keskkonnas. Fermetatsiooni test oli negatiivne – gaasilisi käärimisprodukte ei leidnud. Nende olemasolul oleks agarikork surutud üles. Indikaatorvärv muutus mõlemas katseklaasis.
Erinevaid suhkruid sisaldavate söötmetega tuvastasin mikroobi suhkrukasutamist aeroobses keskkonnas. Sahharoosi, D-fruktoosi, L-arabinoosi, D-ksüloosi, D-mannitool, maltoosi – kõikides nendes söötmetes oli indikaatorvärv muutnud.
4. ensüümid
Tsütokroomi c oksüdaasi test oli negatiivne. Katalaasi test seevastu tundus esmalt negatiivne, kuid mõne aja möödudes hakkas aeglaselt mulle ilmuma (küll vähe). Samuti tundus esmapilgul, et trüptofanaasne aktiivsus puudub minu uuritaval mikroobil. Siiski hakkas vaikselt tekkima veekihile õrnalt punakas alkoholkiht, kuigi see oli väga nõrk. Seega ei osanud täpselt hinnata, kas on olemas trüptofanaas või mitte. Indooltesti tuleks korrata, et veenduda täiesti ensüümi olemasolus.
Minu tundmatul tüvel ei tuvastanud amülaasi, proteaasi ega kaseiini .
β-glükosidaas (eskuliin) ja β-galaktosidaas andsid positiivse tulemuse. Arginiini dihüdrolaas, ureaas ja DNaasi testid olid negatiivsed.
5. kasv temperatuuril, NaCl kontsentratsioonidel ja pH-l
37 °C juures kasv puudus täielikult, kuid 42 °C juures esines. Maksimaalne soolataluvus oli 7% juures, kuid eelistas (kõige tugevam kasv) 0% juures kasvada. Kõige nõrgem kasv oli pH 3 juures ja tugevaim alates pH 9-st kuni 11-ni.
6. 16S rRNA geeni järjestus
Kasutades BLAST andmebaasi ja tundmatu tüve 16S rRNA järjestust, sain lõpuks tulemuseks Enterobacter aerogenes’i. Tüve 33 ja E. aerogenes’i 16S rRNA järjestuste samasus on 99%.
7. Antibiootikumide efektiivsuse testimine
Kasutades Kirby-Baueri meetodit, sain tulemuseks:
Resistentne
Keskmine
Tundlik
Tetratsükliin
Streptomütsiin
Amoksitsilliin+klavulaanhape, kloramfenikool
Liigitaksin enda bakteritüve, mille numbriks on 33, perekonda Enterobacteria ning arvan, et tegemist võib olla liigiga Enterobacter aerogenes.
8. Tundmatu tüve ja Enterobacter aerogenes’i tunnuste võrdlus

Tunnused
Tundmatu tüvi 33
Enterobacter aerogenes
Koloonia:
kuju
profiil
servajoon
konsistents
värvus
Koloonia:
ümar
kerkinud, kumer
sirge
limajas, läikiv
valkjas
Koloonia [1]:
väike ja ümar
kumer
sirge
läikiv
beež
fluorestsents KingB-l
ei esinenud
NIA
gramreaktiivsus (preparaat ja KOH test)
gramnegatiivne
gramnegatiivne [2]
raku kuju, agregatsioon
lühike pulk, agregeerumata
coccobacillus [3]
endospoor
ei
ei [2]
liikuvus
väga hästi liikuv
liikuv [2]
C-allikad ( hape + gaas ):
glükoos (O/F test)
+/-
+/+ [2]
sahharoos
+ [2]
D- fruktoos
+ [4]
L-arabinoos
+ [2]
D-ksüloos
+ [2]
D-mannitool
+ [2]
C-allikad
tsitraat
+ [2]
käärimistüüp (Voges-Proskaueri test)
+ [2]
denitrifikatsioon
- [2]
Ensüümid
cyt c oksüdaas
- [2]
katalaas
+ [2]
trüptofanaas (indooltest)
+
- [2]
amülaas (tärklis)
- [4]
proteaas (kaseiin)
- [5]
proteaas (želatiin)
- [2]
β-glükosidaas (eskuliin)
+ [2]
β-galaktosidaas
+ [2]
arginiini dihüdrolaas
- [2]
ureaas
- [2]
DNaas
- [2]
Kasv temperatuuril ja NaCl kontsentratsioonidel
37 °C
optimum 30 – 37 °C [6]
42 °C
max NaCl
7%
7% [7]
9. Lisaks testisime:
Kasv maltoosil oli olemas. E. aerogenes kasvab samuti maltoosil. [4]
Kõige parem kasv oli pH 9-11, kuigi E. aerogenes’i pH optimum on 9 juures. [8]
10. Ebakõlad E. aerogenesi ja tuvastatava 33 tüve juures
Ebakõlasid olid minu teostatud testide juures kolm: O/F test ja indooltest ning E. aerogenes on resistentne kloramfenikoolile [4]. Pigem arvan, et indooltest oli negatiivne, kuigi vajab ülekordamist täpse tulemuse saamiseks. Võttes arvesse nii genotüübilisi kui fenotüübilisi iseärasusi, arvan, et suure tõenäosusega tüve 33 puhul tegemist Enterobacter aerogenesiga.
11. Enterobacter aerogenes’i süstemaatika
Domeen
Bacteria
Hõimkond
Proteobacteria
Klass
Gammaproteobacteria
Selts
Enterobacteriales
Sugukond
Enterobacteriaceae
Perekond
Enterobacter

12. Kasutatud allikad:
[1] http://www.syracusebiotechnology.com/wp-content/uploads/2013/07/Notes-Bact-Cell-Shape-Colony-Morphology.pdf (vaadatud 22.12.2013)
[2] Don J. Brenner , Noel R. Krieg , George M. Garrity, James R. Staley, James T. Staley. 2007. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology . Volume 2: The Proteobacteria, Part B: The Gammaproteobacteria.
[3] http://modmedmicrobes.wikispaces.com/Enterobacter+aerogenes (vaadatud 23.12.2013)

[4] http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3697-starch-agar (vaadatud 23.12.2013)
[5] http://scialert.net/fulltext/?doi=ajbs.2011.77.83&org=12 (vaadatud 23.12.2013)
[6] http://filebox.vt.edu/users/chagedor/biol_4684/Microbes/Enterobacter.html (vaadatud 23.12.2013)
[7] http://journals.tubitak.gov.tr/agriculture/issues/tar-10-34-4/tar-34-4-7-0902-9.pdf (vaadatud 23.12.2013)
[8] http://www.brenda-enzymes.info/php/result_flat.php4?ecno=2.7.1.61&Suchword=&organism%5B%5D=Enterobacter+aerogenes&show_tm=0 (vaadatud 23.12.2013)