lisamist ei inkubeeriks liiga palju. Jälgida, et etanooliga pesteks kogemata sadet kaasa ei võta! Kasvatada baktereid suuremas mahus. Praktiline töö nr. 8: Kontroll-restriktsioon Eesmärk: Lõigata puhastatud plasmiidset DNA’d restriktaasidega, et kontrollida tekkivate DNA fragmentide suuruste järgi, kas puhastatud plasmiid on õige. 5 µl Puhastatud plasmiidne Seda hakkame kontrollima DNA 3,9 µl MQ 1 µl Restriktaasi 10x puhver Luua sobiv keskkond restriktaasi töötamiseks 0,1 µl EcoRI restriktaas Lõikab DNA’d EcoRI saitidest. (lõppkontsentratsioon 0,1U/ µl) Agaroosgeel 2 µl 6x DNA värv Arvutused: Puhver: 10 x 1/10 = 1µl Restriktaas: 10U/ µl Tahame saada 0,1U/ µl ja meil on 10 µl. 0,1x10 = 1U 1/10 = x/1 ehk x=0,1 Vesi- 10-5-1-0,1 = 3,9 µl DNA värv: 10 / 5 = 2.
vigasest T/G paarist T väga väikese efektiivsusega) seega jääb alles väga väike osa CpG järjestustest. Seetõttu on CpG dinukleotiid evolutsiooniliselt säilunud ainult seal, kus tsütosiin ei ole metüleeritud, st ekspresseruvate geenide promootorpiirkondades. TSÜTOSIIN 5-METÜÜLTSÜTOSIIN TÜMIIN Selleks, et eraldada selliseid saari ülejäänud genoomi suuresti A-T rikastest piirkondadest oleks sobiv kasutada restriktaasi, mis hüdrolüüsib C-G järjestusi (näiteks Cfr42I (SacII), CCGC'GG; NotI GC'GGCCGC;). Need restriktaasid on reeglina tundlikud C metülatsioonile C mpG järjestuses, võimaldades restrikteerida seega aktiivseid geene (inaktiivsed võivad olla metüleeritud). Seega on antud töö eesmärgiks kloneerida CpG saarekestel paiknevaid geene, täpsemalt geenide regulaatoralasid ja saadud järjestuste kuuluvus teha kindlaks DNA järjestuste määramise (sekveneerimise) abil
spontaansele desamineerimisele, tekib tümiin (reparatsiooniensüüm tümiin-DNA-glükosülaas eemaldab vigasest T/G paarist T väga väikese efektiivsusega) seega jääb alles väga väike osa CpG järjestustest. Seetõttu on CpG dinukleotiid evolutsiooniliselt säilunud ainult seal, kus tsütosiin ei ole metüleeritud, st ekspresseruvate geenide promootorpiirkondades. Selleks, et eraldada selliseid saari ülejäänud genoomi suuresti A-T rikastest piirkondadest oleks sobiv kasutada restriktaasi, mis hüdrolüüsib C-G järjestusi (näiteks Cfr42I (SacII), CCGC'GG; NotI GC'GGCCGC;). Need restriktaasid on reeglina tundlikud C metülatsioonile C mpG järjestuses, võimaldades restrikteerida seega aktiivseid geene (inaktiivsed võivad olla metüleeritud). Seega on antud töö eesmärgiks kloneerida CpG saarekestel paiknevaid geene, täpsemalt geenide regulaatoralasid ja saadud järjestuste kuuluvus teha kindlaks DNA järjestuste määramise (sekveneerimise) abil
paljunemine on takistatud tüve K rakkudes ja vastupidi Restriktsiooni-modifikatsiooni süsteem bakterites Restriktaasid – endonukleaasid, mis fragmenteerivad DNA-d spetsiifilistest kohtadest Metülaasid – modifitseerivad nukleotiide restriktaaside poolt äratuntavatest 4 – 6 bp pikkustest DNA järjestustest, kaitstes DNA-d restriktaasi eest Rakus lagundatakse võõrast DNA-d, mis ei ole antud bakteritüve restriktaasi eest kaitstud E. coli tüves RI on kirjeldatud restriktaas EcoRI ja sellele vastav metülaas, mis metüleerib adeniini restriktaasi poolt äratuntavast
( väike molekul DNA-d) ja viirust ( genoom). Geenitehnoloogiat kasutadakse transgeensete organismide e GMO-de loomiseks, geeni raviks e geeniteraapias, sünnieelseks ja järgseks diagnostikaks ( DNA proov ), inimese tuvastamiseks ( DNA sõrmejälgede meetod ). Mis tahes transgeense organismi loomisel kasutadakse rekombinatse DNA loomise restritaas tehnikat. Restriktaas on ensüüm bakterites mis kaitseb neid viiruste eest. Ta lõikab viiruse genoomi (DNA) lõikudeks. Sama restriktaasi saab kasutada üldse DNA lõikamiseks. Tekivad kleepuvate otstega DNA lõigud. Need viiakse lahusesse, kus nad ühinevad komplement taarse alusel A=T; G=C. Ligaas on ensüüm, mis ühendab eri päritolu lõigud. Tulemuseks on rekombinantne DNA. Pöördtranskriptaas on ensüüm, mis leiab kasutamist siis kui mRNA pealt sünteesitakse komplementaas cDNA-d. G-moode loomisel kasutadakse kõige enam eesmärgiks rekombinantse viimine nendesse. Pakterid, viirused ja pärmseened paljunevad kiiresti
kindlas piirkonnas (loikepiirkond-ingl. k. restriction site), mille maarab ara antud piirkonna DNA NH-jarjestus (aratundmisjarjestused; ingl. k. recognition sequenceskoosnevad 4-8 nukleotiidipaarist), kusjuures iga ensuumi jaoks on see erinev. Vordluseks -nt DNA-aasid lohustavad DNA-d juhuslikult. Praegu tuntakse ule 100 restriktsiooni ensuumi ning praktiliselt on voimalik mistahes geen voi mistahes DNA fragment genoomist valja loigata. Alljargnevalt on toodud naitena viie enamkasutatava restriktaasi aratundmis-jarjestused ja loikepiirkonnad. Selliseid DNA molekule, mis on eeltoodud moel moodustatud nimetataksegi rekombinant- DNA molekulideks, millest ka nimi kogu tehnoloogiale. Lisaks eeltoodule saab restriktaasi abil lohustatud DNA molekuli uurida elektroforeetiliselt. Nimelt moodustub restriktaasi toimel DNA molekulist erineva pikkusega fragmente (restriktsiooni fragmendid), millel on ka erinev molekulmass. DNA lohustub nii mitmeks fragmendiks kui mitu vastavat loikepiirkonda temas on
2 mikromeetrilise poordiameeriga membraanfiltrit. Ainult faagid pääsevad läbi – neid oligi vaja just eraldada. 5. Kui suur on bakterirakk? Joonpikkus 1-10 mikromeetrit. 6. Milleks oli vaja kuumašokk kompetentsete rakkude transformeerimisel? Tsütoplasma membraan on laetud positiivselt, DNA on laetud negatiivselt Membraanid depolariseeruvad ja DNA transporditakse rakku. 7. Miks ei või 50% EtOH-ga pesta? Sest DNA hakkab siis lahustuma. 70% ei hakka veel lahustuma. 8. Miks on vaja Mg-d restriktaasi puhvris? Kahevalentne katioon, tavaliselt Mg++ on ensüümi tööks absoluutselt vajalik 9. Miks lahus 1? 2? 3? Lahus 1 sisaldab glükoosi, EDTA ja Tris-HCl. EDTA seob kahevalentseid metallioone, mis on vajalikud nt DNaasi tööks + EDTA aitab stabiliseerida DNA fosfaat selgrooga . Suspendeeritakse puhvris, sest vees võib DNA laguneda. Lahus 2 sisaldab SDS ja NaOH. Aluseline töötlus, mille käigus detergent SDS lõhub rakumembraani ja alus saab seonduda plasmiidse DNAga, mis seejärel
juppideks. · Bakterid omavad võõra DNA vastu nn R/M süsteemi · toimub kahe ensüümi koostöö : restriktaas(R) mis lõikab DNA tükkideks ja metüültransferaan(M) mis metüleerib ära oma DNA ja kaitseb seega oma DNA-d lõhkumise eest. · Restriktaasid tunnevad ära teatud järjestusega nukleotiidi paarid (4-8)DNA-s · teada erinevaid restriktaase üle 3500 · vastavalt restriktaasi toimele lõigatakse DNA lahti kas lõikuvalt või tömbilt. Kahe DNA kleepuvate otste liitumine toimub komplementaarsus printsiipide alusel ja ahelate aheald liituvad omakorda ligaasi abil. Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis on intronid( nukleotiidsed järjestused mis ei määravalgu ehitust) ja eksonid. (sisaldavad aminohapete järjekorra informatsiooni) · pärast transkriptsiooni lõigatakse intronid välja ja ainult kokkuliidetud eksonid moodustavad mRNA, mille alusel
6. Kontroll-restriktsioon a. Kontroll-restriktsiooni on vaja, et kontrollida, kas saadud plasmiid on õige, see võimaldab ka näha, kas puhastamine oli efektiivne foreesipildilt on näha, kui proovis on lisaks saadud plasmiidile ka näiteks bakteriaalset DNA-d. Valides sobivad restriktaasid, on võimalik kontrollida, kas insert on plasmiidi sisenenud õiget pidi. b. Kasutasime restriktaasi EcoRI, mis lõikab kahelt poolt EcoRV lõikamissaiti, kuhu sisestasime oma inserdi. See võimaldab tükkide pikkuste järgi määrata, kas insert on vektorisse sisenenud või mitte. Protokoll: 1. Pipeteerida: i. 5,9 l vett ii. 3 l just puhastatud plasmiidset DNA-d iii. 1 l restriktaasi 10x puhvrit iv. 0,1 l EcoRI restriktaasi (hoida külmas!) 2. Segada, fuugida ja inkubeerida 37oC 30 min 3
ühine omadus: nad lõhkusid fosfodiestersidemeid järjestusest sõltumata. Seetõttu ei olnud võimalik katki lõigata spetsiifilisi lõike. Kuuekümnendate aastate lõpus Smith, Johns Hopkins (???) avastasid bakterirakkudest veel ühed desoksüribonukleaasid, mis erinesid senituntutest, sest need ensüümid lõhkusid DNA'd järjestus spetsiifiliselt. See tähendab seda, et kui me teame mingi geeni nukleotiidset järjestust, siis valides sobiva järjestuspetsiifikaga restriktaasi saab teha katkuse ühelt poolt geeni ja teiselt poolt teise restirktaasiga. Bakterite jaoks on tegemist sisuliselt kaitsemolekulidega: eukarüootses maailmas nukleiinhapete omavaheline vahetamine on sisuliselt võimatu ja ainuke viis on sugulisel paljunemisel, prokarüütses maailmas on tavaline, et prokarüootsed rakud vahetavad üksteisega DNA fragmente. Bakteritel on vaja mehhanismi, kuidas eristada üksteisest oma enda DNA'd ja võõr-DNA'd, selle jaoks ongi olemas restriktaasid.
vaadatakse elektroforeesil tekkinud DNA fragmentide suuruste järgi, kas soovitud DNA järjestus on plasmiidi sisestunud. Valitakse selliseid restriktaase, mis lõikavad nii inserdi kui vektori enda seest ning seejuures veel niimodi, et tekuksud erineva pikkusega jupid, mille suurust oleks hea võimalikult täpselt kasutatava DNA Ladderiga võrreldes kontrollida. 1. Kontroll-restriktsiooni teostamiseks esmalt pipeteerisin kokku 5,5 μl vett, 3 μl puhastatud DNA-d, 1 μl restriktaasi 10x puhvrit, 0,5 μl EcoRI restriktaasi, fuugisin ja inkubeerisin 37 °C 30 min jooksul 2. Kui 30 min on täis, fuugisin uuesti, kuna sooendamisel kaanele kondenseerus veeaur. Lisasin 2 μl 6x DNA värvi 3. Elektroforeesiks valasime 100 ml TAE geeli (1%) 4. Pipeteerisin kogu oma segu agaroosgeeli hambasse. 5. Tehtud pildist oli arusaadav, et ma ei saanud õige kõrgusega bändi. Nagu selgus, viga oli bakterite kasvamisel ja meil kasvanud bakterite kolooniad polnud tegelikult õiged
oleks võimalik visualiseerida. Ka Mg lisatakse kofaktorina. Praegu on see protsess automatiseeritud. Kasutatakse laserdetektori, mis määrab mis nukleotiidiga on tegemist ja vastavalt sellele saadab signaali arvuti peale, kus seda visualiseeritakse eri värvuste piikidega (Iga nukleotiidile vastab oma värvus). 20. Kuidas on võimalik sisestada restriktsioonikohad PCR-i produkt? Selleks võib kasutada spetsiifilisi praimereid, mis sisaldavad restriktaasi äratundmiskohad. 21. Selgita RT-PCR (reverse transcription) põhimõtet. Esimesena toimub revertaasi toimel cDNA esmase ahela süntees mRNA järgi, seda teostatakse dNTP ja oligonukleotiidset praimeri lisades puhvris, 37C juures ühe tunni jooksul. Seejärel toimub tavaline PCR. 22. Kirjelda meetodeid, kuidas on võimalik mõõta mRNA taset rakus? Mis on poolt ja vastu
Omapärased ensüümid, mis lõikavad DNA kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt nii, et tekivad kleepuvate otstega DNA lõigud. Eri päristolu lõigud viiakse lahuses kokku ja nad ühinevad komplementaarsuse alusel, kleepuvate otste vahele tekivad vesiniksidemed. Ensüüm ligaasi abil ühendat eri päritolu lõigud kovalentsete sidemetega, tekib rekombinantne DNA molekul. Bakterid kaitsevad end sedasi viiruste eest. 46. DNA kloneerimise etapid. 1)DNA lõigatakse restriktaasi abil fragmentideks ja segatakse bakterite plasmiididega, mis on lahti lõigatud sama restriktaasiga 2)Iga plasmiid ühineb võõra fragmendiga. Ligaasi toimel ühinevad ahelate otsad 3)Bakterid võtavad rekombinantsed plasmiidid endasse, saadakse kloonbakterite kogumid 4)Kolooniad eraldatakse. Siiratud fragment(DNA) paljuneb koos bakteritega, saadakse DNA-pank. 47. Mis on cDNA? Kodeeriv DNA e eksonid. Paiknevad eukarüootide geenis
lõikamise tulemusena tekivad erineva pikkusega DNA fragmendid, mida on võimalik geelelektroforeesil üksteisest lahutada. Kui mõnes ensüümi lõikamiskohas on toimunud muutus, ei lõika ensüüm sealt ning sel juhul tekivad võrreldes algse DNA lõikusega erineva pikkusega DNA fragmendid. RFLP analüüsi kasutatakse näiteks inimese neljandas kromosoomis asuva Huntingtoni tõve põhjustava alleeli läheduses paikneva lookuse D4S10 (funktsioon teadmata) uurimisel. DS410 on polümorfne restriktaasi HindIII lõikekohtade suhtes. Sellel lookusel on kirjeldatud neli erinevat HindIII poolt tekitatud fragmentide mustrit. Iga muster vastab ühele haplotüübile (alleeli sünonüüm), seega on üksteisest eristatavad haplotüübid A, B, C ja D. Kuna homoloogilisi kromosoome on kaks, on igal indiviidil neist kaks haplotüüpi, mis kombineeruvad kümnel erineval viisil AA, BB, CC, DD, AB, AC jne. Mutatsioone DNA järjestuses on tuvastatud ka Huntingtoni tõbe põhjustava HD alleeli puhul
) Kuivatasin DNA sade läbipaistvaks, et vabaneda ka etanooli jääkidest Suspendeerisin 20 µl MQs 6.2 Praktikum – Kontroll – restiktsioon Kontroll teostatakse selleks, et kontrollida DNA juppide suuruste järgi, et aru saada, kas välja puhastatud plasmiid on õige. Selleks lõikame restriktaasiga inserdi vektorist. Pipeteerisin kokku 5,5 µl vett, 3 µl puhastatud plasmiidset DNA-d, 1 µl restriktaasi x10 puhvrit ja 0,5 µl EcoRl restrikaasi Segasin, fuugisin ja inkubeerisin 30 min 37 C juures, ning pärast fuugisin veel kord, et koguda kogu kondansaat Lisasin 2 µl 6x DNA värvi ja pipeteerisin segu agaroosgeelile ja sain järgmist pilti: Kui vaadata Vektori DNA jupp geelipilti, siis on
k. restriction site), mille määrab ära antud piir- konna DNA NH-järjestus (äratundmisjärjestused; ingl. k. recognition sequences- koosnevad 4-8 nukleotiidipaarist), kusjuures iga ensüümi jaoks on see erinev. Võrdluseks - nt DNA-aasid lõhustavad DNAd juhuslikult. Praegu tuntakse üle 100 restriktsiooni ensüümi ning praktiliselt on vôimalik mistahes geen vôi mistahes DNA fragment genoomist välja lõigata. Alljärgnevalt on toodud näitena viie enamkasutatava restriktaasi äratundmis-järjestused ja lõikepiirkonnad. 49 Joonis. Restriktsiooniensüümid Kasutades erinevaid restriktaase, võime saada DNA fragmente, millel on kas tömbid (Hpa I) või siduvad otsad (ingl. k. cohesive ends). Viimased kujutavad endast lühikesi ühekordse ahela fragmente. Siduvate otsadega fragmente vôib omavahel taas liita, s.t teoreetiliselt võib mistahes geene omavahel liita.
fragmendid, mida on võimalik geelelektroforeesil üksteisest lahutada. Kui mõnes ensüümi lõikamiskohas on toimunud muutus, ei lõika ensüüm sealt ning sel juhul tekivad võrreldes algse DNA lõikusega erineva pikkusega DNA fragmendid. RFLP analüüsi kasutatakse näiteks inimese neljandas kromosoomis asuva Huntingtoni tõve põhjustava alleeli läheduses paikneva lookuse D4S10 (funktsioon teadmata) uurimisel. DS410 on polümorfne restriktaasi HindIII lõikekohtade suhtes. Sellel lookusel on kirjeldatud neli erinevat HindIII poolt tekitatud fragmentide mustrit. Iga muster vastab ühele haplotüübile (alleeli sünonüüm), seega on üksteisest eristatavad haplotüübid A, B, C ja D. Kuna homoloogilisi kromosoome on kaks, on igal indiviidil neist kaks haplotüüpi, mis kombineeruvad kümnel erineval viisil AA, BB, CC, DD, AB, AC jne. Mutatsioone DNA järjestuses on tuvastatud ka Huntingtoni tõbe põhjustava HD alleeli puhul
polymorphisms, RFLP) kui geenimarkereid. Nende polümorfsete markerite pärandumise analüüsil saab koostada erinevate RFLP-ide aheldatuse kaarte ning analüüsida siis neid juba teadaolevate geenide asukohtade suhtes. Näiteks võiks tuua autosomaalse retsessiivse haiguse tsüstilise fibroosi (CF), mille geen lokaliseeriti aheldatuse analüüsil 7. kromosoomi. Kasutades mõlemal pool geeni paiknevaid RFLP-e kloneeriti geen, mille produkt oli siis veel tundmata Kui mutatsioon DNA-s on tekkinud restriktaasi lõikesaiti, siis seda järjestust restriktaas enam ei lõika. Mutatsioonid võivad muuta DNA järjestust ka nii, et tekivad uued restriktaaside lõikesaidid. Seega põhjustavad mutatsioonid DNA restriktsioonifragmentide mustris erinevusi, kuna võrreldes algse DNA-ga tekib mutatsioone sisaldava DNA lõikamisel mingi kindla restriktaasiga teistsuguse pikkusega fragmente. Nii võib erinevatest isolaatidest pärinev DNA olla DNA restriktsioonanalüüsi
Restriktsioon - modifikatsiooni süsteem bakterites Restriktsiooniensüümid tunnevad ära kindlaid järjestusi ja lõikavad DNA selle koha pealt lahti → tekivad kaheahelalised katked DNA-s. Vajalikud bakteriofaagide jaoks. Bakterites sama DNA järjestuse tunnevad ära nii restriktaas kui metülaas. Restriktaas ei lõika metüleeritud DNA-d. Restriktaas lagundab metüleerimata DNA (võõra DNA) sptesiifilistest kohtadest. Restriktaas ja metülaasi äratundmiskohad kattuvad. GATC on restriktaasi (kindla) äratundmisjärjestused, mis on vanas DNA-s kõik metüleeritud, ei lõigata katki. Kui rakku tuleb faagi DNA, siis see ei ole sellelt kohalt metüleeritud st lõigatakse katki. Erinevus metüleerimisel tuleneb erinevustest bakteri ja faagi DNA replikatsiooni mehhanismides. Modifikatsioonide alusel eristatakse bakteri ja faagi DNA, metüleerimata DNA tunneb ära restriktaas – lagundatatakse. Reparatsioon – parandamine pole ainult valepaardumiste ja replikatsioonivigade
annaabi.ee 
