hapniku toimel. Produktideks on vesinikperoksiid ja ,Dglükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe. GOx on liit- ehk konjugeeritud valk, flavoproteiin, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. GOx-i molekul on dimeerne valk.FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Tekib ekvimolaarses koguses D- glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Järgmises etapis kasutatakse rõika peroksüdaasi, mille süstemaatiline nimetus on doonor:H2O2-oksüdoreduktaas. POx on sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo- ehk kromoproteiin. See tähendab, et ka POx on liitvalk. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide dehüdreerumist, kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel moodustub H2O.
mis põhineb ensäämide glükoosi oksüdaas (GOD) ja peroksüdaas (POD) kasutamisel. See meetod võimaldab määrata glükoosi ka teiste teendavate suhkrute juuresolekul. Glükoosi oksüdaas katalüüsib glükoosi oksüdeerumist hapniku toimel glükohappeks. FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Peroksüdaas on koostisest ka liitvalk ja selle toimel leiab aset spetsiifiliste substraatide oksüdeerumine H2O2-lt pärineva hapniku abil. Oksüdeerides, mõned substraadid anaavad värvilisi produkte. Siis saab kasutada spektrofotomeetri ning jälgida värviliste ühendite kontsentratsiooni, mis on võrdilises sõltuvuses glükoosisisaldusest. Peroksüdaas
GOx on konjugeeritud valk (flavoproteiin).Sisaldab mittevalgulisi komponente FAD. FAD toimub koensüümina. GOx katalüüsib ,D-glükoosi oksüdeerimist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktid: - Vesinikperoksiid H2O2 - ,D-glükonolaktoon (hüdrolüüsi tulemusena moodustab D-glükoonhape FAD seob glükoosi molekulilt 2 vesiniku aatomit, ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Selle tulemuseks tekib vesinikperoksiid ja D-glükoonhape. Teine etap: Teisel etaapil kasutatakse rõika peroksüdaasi (süstemaatiline nimetus on doonor:H2O2- oksüdoreduktaas.) POx on hemoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina H2O2 (moodustub H2O). Kui substraati oksüdeerimisel tekib värviline produkt (kromogeenne substraat), siis saab POx reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt
Põhiained · Titrant ehk standardlahus peab olema kindla koostise ja kontsentratsiooniga · Titrandi kontsentratsiooni määramiseks on vajalik nn. esmane ehk primaarne standard ehk põhiaine · põhiaine kõrge puhtusega ühend, millest valmistatakse standardlahus või mida kasutatakse standardlahuse kontsentratsiooni määramiseks Nõuded põhiainetele · Kõrge puhtus; · Püsivus õhus ja lahuses; · Mitte hügroskoopne; · Odav; · Suure molaarmassiga; · Lahustuv antud reaktsioonikeskkonnas; · Kiire ja stöhhiomeetriline reaktsioon analüüdiga. Väga vähestel ühenditel on sellised omadused Sekundaarsed standardid · Alati pole võimalik leida sobiva tiitrimisreaktsiooni jaoks põhiainet · Sellisel juhul on titrandi standardiseerimiseks kasutusel nn. sekundaarne standard · See sekundaarne standard tuleb alati standardiseerida põhiaine ehk esmase standardi abil Standardlahuste omadused · Püsiv, et tema kontsentratsiooni peaks määrama ainult üks kord;
GOx katalüüsib ,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel, reaktsiooniproduktideks vesinikperoksiid ja ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe. GOx on liitvalk, flavoproteiin, mis sisaldab mittevalgulise osana flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. FAD seob glükoosi molekulilt 2 vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D- glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Selle meetodi järgmises etapis kasutatakse rõika peroksüdaasi, mis on koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise osana heemi. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel tekib H2O. Kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt, siis saab POx-i
Töö teoreetilised alused Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides kasutatakse ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi ja peroksüdaasi kasutamisel. Gox-i süstemaatiline nimetus näitab, et ta katalüüsib , D- glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. FAD seab glükoosi molekuli kaks vesiniku aatomit, redutseerib FADH 2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldab lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside esindajat, mille nimetus on doonor: H 202- oksüdoreduktaas. Kui kasutatakse substraadi, mille oksüdeerimisel tekib värviline produkt, siis saab POx-i reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektofotomeetriliselt. Reaktsiooni põhimõtteline skeem on järgmine: Taandatud substraat + H2O2 Oksüdeeritud substaat + 2 H2O POx-i toimel oksüdeeruva kromgeense substraadina kasutatakse bensidiini derivaate.
peroksüdaasi (POx) kasutamisel. GOx-i süstemaatiline nimetus β,D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas näitab, et ta katalüüsib β,D- glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja δ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D- glükoonhappe. FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerides FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaasrses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Meetodi järgmises etapis kasutatakse rõika peroksüdaasi, mille süstemaatiline nimetus on doonor:H2O2-oksüdoreduktaas. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel moodustub H2O. Kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt, siis saab reaktsiooni
Tänu GOx-i substraadispetsiifilisusele , D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juureolekul. GOx katalüüsib glükoosi oksüdeerimist molekulaarse hapniku toimel. GOx on liitvalk e flavoproteiin, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniinnukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Vaadeldava meetodi järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside perekonna üht esindajat, rõika peroksüdaasi, mille süstemaatiline nimetus on doonor:H2O2-oksüdoreduktaas. Ka POx on koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo- ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide(elektronide doonorite)
toimib koensüümina. Glükoosi oksüdaasi molekul on dimeerne valk (kaks subühikut, mis joonisel on eritooniliste siniste värvustega näidatud). Roosaga on joonisel näidatud FAD-i molekulid. Ensüümivalku stabiliseerivad polüsahhariidi ahelad, mis on tähistatud rohelisega. Glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit seob FAD, redutseerides -ks ja kannab need molekulaarsele hapnikule, mis on lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Ka peroksüdaas on koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo- ehk kromoproteiin. Peroksüdaas katalüüsib spetsiifiliste substraatide (elektronide doonorite) oksüdeerumist (ehk dehüdreerumist), kasutades elektronide aktseptorina vesinikperoksiidi, mille redutseerumisel moodustub vesi.
vesinikperoksiid ja ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsides moodustab D- glükoonhappe. GOx kujutab endast liitvalku, täpsemalt flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponentina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. GOx-i molekul on dimeerne valk. Ensüümivalku stabiliseerivad polüsahhariidi ahelad. FAD seob glükoosi molekulilt 2 vesiniku aatomit, redutseerides FADH 2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükooshapet ja vesinikperoksiidi. Järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside perekonna esindajat, rõika peroksüdaasi (EC 1.11.1.7), mille süstemaatiline nimetus on doonor:H 2O2-oksüreduktaas. Pox on samuti liitvalk, mille mittevalguline komponent on heem, olles seega hemo- ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina teist
Tänu GOx-i substraadispetsiifilisusele β, D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juureolekul. GO x katalüüsib glükoosi oksüdeerimist molekulaarse hapniku toimel. GO x on liitvalk e flavoproteiin, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniinnukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH 2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Vaadeldava meetodi järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside perekonna üht esindajat, rõika peroksüdaasi, mille süstemaatiline nimetus on doonor:H2O2-oksüdoreduktaas. Ka POx on koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo- ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide(elektronide doonorite)
väike,loetakse kulunud titrandi maht tiitrimise lõppedes. Indikaator-lisatakse analüüsitavale lahusele,et näha muutusi silmaga,see on tiitrimise lõpppunkti väärtuse leidmiseks. Tiitrimisviga-Et=Velp-Vep. Põhiaine: Põhiaine õrge puhtusega ühend, millest valmistatakse standardlahus või mida kasutatakse standardlahuse kontsentratsiooni määramiseks Nõuded põhiainetele-Kõrge puhtus;Püsivus õhus ja lahuses;Mitte hügroskoopne;Odav;Suure molaarmassiga;Lahustuv antud reaktsioonikeskkonnas;Kiire ja stöhhiomeetriline reaktsioon analüüdiga. Tiitrimismeetodid: Otsene tiitrimine-meetod,kus titrant reageerib kohe analüüsitava ainega. Tagasitiitriminekui-meetod,kus analüüsitavale lahusele lisatakse liias standartlahust.Toimub keemisreaktsioon,standardlahuse ülejääk tiitritakse tagasi büretis oleva standardlahuse abil.Seda kasutame kui reaktsioon analüüdi ja titrandi vahel on aeglane või titrant pole püsiv.
Värvus 1 Värvus 2 Viimane aste ei tähenda et kogu indikaator on reageerinud, vajalik ainult mõni %, et näha värvi muutust. Tiitrimisviga- Tuleneb ületiitrimisest, Et= Vlp- Vep Põhiaine ja nõuded põhianele- Põhiaine:kõrge puhtusega ühend, millest valmistatakse standardlahus või mida kasutatakse standardlahuse kontsentratsiooni määramiseks. Nõuded: Kõrge puhtus;Püsivus õhus ja lahuses;Mitte hügroskoopne;Odav;Suure molaarmassiga; Lahustuv antud reaktsioonikeskkonnas;Kiire ja stöhhiomeetriline reaktsioon analüüdiga. Väga vähestel ühenditel on sellised omadused! Tiitrimismeetodid- otsene:teatud kogusele tiitritavale lahusele (A) lisatakse titrandi (T) lahust kuni reaktsiooni lõpp-punkti fikseerimiseni. skeem: A + T=P tagasi:Tagasitiitriminekui reaktsioon analüüdi ja titrandi vahel on aeglane või titrant pole püsiv; kaudne:kui titrant ei reageeri analüüsitava ainega.
Lõpp-punktis on piisavalt palju indikaatorit muutnud vormi; Viimane aste ei tähenda, et kogu indikaator on reageerinud, vajalik ainult mõni %, et näha värvi muutust tiitrimisviga Et =Vlp Vep 8. Põhiaine ja nõuded põhiainetele. põhiaine kõrge puhtusega ühend, millest valmistatakse standardlahus või mida kasutatakse standardlahuse kontsentratsiooni määramiseks Kõrge puhtus; Püsivus õhus ja lahuses; Mitte hügroskoopne; Odav; Suure molaarmassiga; Lahustuv antud reaktsioonikeskkonnas; Kiire ja stöhhiomeetriline reaktsioon analüüdiga. Väga vähestel ühenditel on sellised omadused 9. Tiitrimismeetodid (otsene, tagasi, kaudne). otsene tiitrimine - teatud kogusele tiitritavale lahusele (A) lisatakse titrandi (T) lahust kuni reaktsiooni lõpp-punkti fikseerimiseni (skeem: A + T = P) tagasitiitrimine kui reaktsioon analüüdi ja titrandi vahel on aeglane või titrant pole püsiv;
dehüdreerumist), kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel moodustub H2O. Peroksüdaas Oksüdeeritud substraat + H2O2 Taandatud substraat + 2 H2O 3. Millist koensüümi vajab GOx ja milles seisneb koesüümi roll? FAD mis toimib koensüümina. FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH 2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. 4. Kuidas avaldub ensüümi substraadispetsiifilisus antud töö puhul? Tänu GOx-i substraadispetsiifilisusele ,D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul 5. Selgitage lahuse lahjendamise põhimõtet ja kirjeldage, kuidas tuleb toimida, et lahusest, mis sisaldab 1,5 g/l glükoosi valmistada 25 ml lahust kontsentratsiooniga 0,3 g/l? Lahjendamise põhimõte: lahjendamiseks võetud lahuse (standardlahuse) mahus ja lahjendatud
k2 (ehk kcat) katalüütiline kiiruskonstant, s-1, Km Michaelise konstant, mis võtab kokku kõik kolm reaktsiooniskeemis toodud kiiruskonstanti, mis mõjutavad ES kompleksi tekke- ja lagunemise kiirust: Km = k-1 + k+2 / k+1. Km dimensiooniks on kiiruskonstantide dimensioonidest tulenevalt mol/l ehk M Vmax maksimaalne kiirus, mis väljendab maksimaalselt võimalikku reaktsiooni kiirust juhul, kui kogu reaktsioonikeskkonnas olev ensüüm on ES kompleksis, st substraadiga küllastatud. Seega kuna ES kompleksi maksimaalne kontsentratsioon on määratud reaktsioonikeskkonnas oleva ensüümi kontsentratsiooniga [ES] [E], siis Vmax avaldub katalüütilise konstandi k2 ja ensüümi kogukontsentratsiooni [E] korrutisena Vmax = k+2 [E]. Michaelis-Menten'i võrrand näitab, et ensüümireaktsiooni algkiirus v on ära määratud
Jooned on allapoole kõverad: Fikseeritud mõõteprioodi kasutamine algkiiruse asemel Reaktsioonisegus esineb limiteeriv komponent Pöörduva inhibiitori esinemine ensüümpreparaadis [E]0 Mõõtmismeetodi piiratus Jooned on ülespoole kõverad: v Kõrvalekalle - üles Mittespetsiifiline seondumine Väikese koguse toksilise ühendi esinemine reaktsioonikeskkonnas Pöörduva aktivaatori esinemine ensüümpreparaadis (E+AEA Mida rohkem ens võtame, seda rohkem ensüümi kompleksis aktivaatoriga) [E]0 Ensüüm on aktiivne multimeersena E+EE2 Produkti moodustumine erinevatel ensüümi kontsidel võime mõõta keskmisi kiirusi ja paneme teljestikku ja näeme, et 1 min tagant võtud lineaarne ens kontentratsiooniga, aga 30 min läheb alla, st et peame lähtuma algkiirusest.
Võimendatud kemoluminestsentsmeetodil on kõrge analüütiline tundlikkus tänu enhanceri kasutamisele. Immuundifusioon-meetod. Immuundifusioon viiakse läbi geelis (agargeel Petri tassis). Antigeenid ja antikehad liiguvad geelil soojusliikumise ja kontsentratsiooni gradiendi tõttu, moodustades kohtudes immuunkomplekse. Immuunkomplekside suurused sõltuvad anitgeenide ja antikehade kontsentratsioonide suhtest reaktsioonikeskkonnas. Suuremad immuunkompleksid murravad valgust oluliselt rohkem. On topeltimmunodifusioon (Ouchterlony meetod), mis võimaldab kvalitatiivselt määrata antigeene või antikehi (st vastab küsimusele jah/ei, üks või teine). Radiaalse immunodifusiooniga (Mancini meetodiga) saab kvantitaviiselt määrata antigeene või antikehi, st nende kontsentratsioonide määramist. Radiaalse immuunodifusiooni puhul on üks komponent valatud geeli
annaabi.ee 
