Sama on täheldatud ka toga-, influentsa-, rabdo-, poks- ja herpesviirustel. Mõnedele viirustele on iseloomulik hilisem proteiini inhibitsioon, eriti mittetsütotsiidsetele viirustele (pesti- ja retroviirused). Need viirused ei põhjusta raku surma ja raku proteiinide sünteesi pidurdumist. Tsütopaatiline efekt Viiruse tsütopatogeense toime tagajärjel tekib rakus tsütopaatiline efekt. Tsütopaatiline efekt on nähtav väljaspool organismi kultiveeritavas rakukultuuris. Viirusega nakatatud rakkudes toimub spetsiifiline morfoloogiline destruktsioon ja funktsionaalne patoloogia. Polünukleaarsed hiidrakud (süntsüütiumid) on iseloomulikud paramüksoviirustele. Rakus tekib spetsiifiline TPE. Liituvate rakkude arv ja süntsüütiumide arv sõltub mitmesugustest teguritest nagu infitseerivate virionide arv, valgu süntees, temperatuur ja keskkonna pH. Multinukleaarseid süntsüütiumeid põhjustab hobuste morbilliviirus. Hobuste
läbimõõduga sõlmjad moodustised). Lahanguleid - perifeersed närvitüved paksenenud kuni kolm korda, tursunud, hallikad või kollakad. Haiguse ägeda kulu korral lümfomatoossed muutused siseorganites - väikesed difuussed, hallikad poolläbipaistvad kolded. Dif.diagnoos – lindude leukoos (kriteeriumid leukoosi eritastamiseks – leukoos on vanematel ja välistunnuseid pole, kasvajad maksas ja põrnas). Diagnoosimine – koeproovid, nõreproovid; viiruse isoleerimine rakukultuuris või kanaembrüos, IFM, PCR, ELISA, NR antikehade määramiseks. Herpesviridae -> Alamsugukond – Alphaherpesvirinae -> Perekond – Varicellovirus -> Liik – veiste herpesviirus-1 (BHV-1) (infektsioosse rinotrahheiidi viirus) -> Veiste infektsioosne rinotrahheiit/pustuloosne vulvovaginiit Viirus – poolsfääriline, lipiidse ümbrisega, diameetriga 150 nm, 2-ahelaline bihelikaalne DNA , paljuneb rakutuumas, intranukleaarsed eosinofiilsed inklusioonid, indutseerivad
Instituudis töötatakse ainult 1. klassi (madal risk) ja 2. klassi (mõõdukas risk) kuuluvate organismidega. Kõige ohutumad on inimesele hästi iseloomustatud inimese või primaatide rakuliinid, madala nakkusriskiga inimese patogeenide suhtes. Kõige ohtlikumad on endogeensete patogeenidega rakuliinid, tahtlikult nakatatud rakud, primaarsed vererakud, lümfoidsed rakud, inimese või poolahvide neuraalkude. 222 Mis kujutab endast töötaja jaoks kõige suuremat ohtu rakukultuuris? Miks? Rakukultuuri patogeensus, infektsioonilikkus, vähene informatsioon rakukultuuri kohta. Sest see on inimesele kahjulik. 222 Mida teha, et tagada ohutus töötamisel rakukultuuris? Loomses rakukultuuris kasutada min. II ohuklassi laminaari Kaitseb töötajat ja ka objekti samaaegselt Üldiste ohutusnõuete järgimine Töötamine aseptiliselt Üldnõuded Kõik raku(ja koe-)kultuurid on potensialsed ohuallikad,
väga konserveerunud mittetäiuslikest 28 bp palindroomidest. Hr elemendid toimivad geeniekspressioonil enhanseritena (seondavad viiruse trans-aktivaatoried) ja osalevad viiruse DNA replikatsioonis ”origin” struktuuridena. AcMNPV kodeerib kolme valku, millel on olemas homoloogia raku DNA replikatsioonis osalevate valkudega. Need on: 1. DNA polümeraas; 2. helikaas ja 3. PCNA (proliferating cell nuclear antigene). AcMNPV infektsioonitsükkel rakukultuuris Baculoviiruse elutsüklile in vivo on iseloomulik primaarne ja sekundaarne infektsioon. Sekundaarne infektsioon sarnaneb infektsioonile rakukultuuris ja seda on seetõttu rohkem uuritud: 1. infektsioon algab sellega, et BV gp64 seondab raku retseptorit (retseptor on siiani tundmatu, samas on teada, et gp64 seondab efektiivselt ka imetajarakke); 2. viirus tungib rakku retseptor-seoselise endotsütoosi teel; 3
! 11. Millisteks uuringuteks ei sobi kasvajalised rakukultuurid? Miks? (М97) 60 ! Näiteks kui soovitakse uurida kindlat koe- või rakuliiki (neuronite või hepatotsüütide spetsiifilisi funktsioone ei saa uurida kartsinoomirakkudel). Või kui uuringus on oluline normaalne karüotüüp. Miks - mutatsioon muudab kogu raku elutegevust nii põhjalikult, et sealt ei saaks mingeid järeldusi teha. Normaalseid protsesse ei saa uurida, kuna ei ole olemas vajalikke geene. Kasvajalises rakukultuuris on enamasti ekspresseerunud paljunemisega seotud geenid ja normaalsed ei toimi. Umbes midagi sellist. ! 12. Mis on, kus ja kuidas tekib Okazaki fragment? (М104) 67 ! Okazaki fragment on DNA replikatsioonis mahajääval ahelal DNA polümeraasi poolt sünteesitud DNA lõik. Kui fragmendi sünteesimine on lõppenud, eemaldatakse RNA praimerid ja ensüüm DNA ligaas seob üksikud Okazaki fragmendid ühtseks DNA ahelaks. ! 13. RNA sünteesi keemilised inhibiitorid loomses rakus. (М128) 80 !
pole viiruse replikatsiooniks absoluutselt vajalik. Segmendi B kodeeriv ala sisaldab ühte lugemisraami, mis kodeerib VP1 valku. VP1 on dsRNA segmentide terminaalseks valguks (side RNA 5'-terminaalse G-jäägiga Ser-jäägi kaudu VP1-s), mille abil genoomi segmendid moodustavad stabiilseid rõnga kujulisi struktuure. Peale selle on VP1 multifunktsionaalne ensüüm RdRp (transkriptaas ja replikaas), GT ja MT. 1.2. Replikatsioon Ehkki nii IPNV kui ka IBDV replitseeruvad rakukultuuris on nende andmed nende replikatsioonist väga piiratud. Uurimist on takistanud raku poolsete biosünteeside foon, sest birnaviiruse infektsioon ei mõjuta oluliselt raku biosünteese ja on samas ka ise tundlik actinomycine D-le. Teadaolevalt ei ole birnaviirste replikatsioon seotud rakutuumaga. Birnaviiruste virionid (erinevalt reoviirustest) ei vaja transkriptsioon aktiveerimiseks kapsiidivalkude proteolüüsi. Nakatatud rakus ei toimu kapsiidi täieliku dissotsieerumist (nagu ka reoviirustel)
võivad diferentseeruda organi eri kudede rakutüüpideks Inimese rasvkoest on eraldatud tüvirakud, millel on leitud võime diferentseeruda luu-, kõhre-, rasva- ja lihasrakkudeks Tüvirakke on ka lihas- ja närvikoes Neuraalsed tüvirakud võivad diferentseeruda nii neuroniteks kui ka erinevateks gliiarakkudeks. Need tüvirakud on täiskasvanu ajus aga enamasti soikeseisundis ning tavaliselt ei jagune. Kuid rakukultuuris saab neid stimuleerida jagunema ning ühes või teises suunas diferentseeruma. Praegu tegeldakse väga paljudes laboratooriumides ja kliinikutes tüvirakkude eraldamise, nende diferentseerumisvõime ja -tingimuste uurimisega. Luuüdi siirdamine kiirgushaiguse ja mõne verevähi vormi puhul on tuntud asi. Nabaväädi vere tüvirakke on kasutatud mõne luuhaiguse ja leukeemia ravis. Neuraalsete tüvirakkude abil loodetakse jõuda raskete ajuhaiguste, nt. parkinsonismi ravini.
Valgud Bcl-2 perekonna valgud jagunevad pro-survival ja pro-apoptotic valkudeks. Viimased jagunevad omakorda mutlidomain effektoriteks ja ainult BH3 valkudeks. Proapoptootilised valgud – Bax, Bak, Bok (multidomains) Bim, Puma, Noxa, Bik, Bmf, Bad, Hrk, Bid (ainult BH3) Antiapoptootilised valgud pro survival – Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1 93. Kirjelda rakusisest kaspaaside kaskaadi. Prokaspaas 9 (apoptosoomist) – kaspaas 9 – kaspaas 3 94. Millisel põhimõttel eristatakse rakukultuuris elus rakke surnud rakkudest? Elus rakud on kinnitunud pinnale, surnud rakud on ümarad, apoptoosis rakud on pisemad ja keevad sest nende DNA on lõhutud ja jupitatud. Seda saab kindlaks teha värviga (tuumamembraan on auklik
diferentseeruda luu-, kõhre-, rasva- ja lihasrakkudeks. Veel üsna hiljuti valitses üldine seisukoht, et täiskasvanu aju- ja lihasrakud ei jagune, s.t. hävinud rakud ei saendu. Nüüdseks on aga selgunud, et nii ajus kui ka lihastes on tüvirakke, mis võivad anda uusi küpseid rakke. Neutraalsed tüvirakud võivad diferentseeruda nii neuroniteks kui ka mitmesugusteks gliiarakkudeks. Need tüvirakud on aga täiskasvanu ajus enamasti soikeseisundis ja tavaliselt ei jagune. Kuid rakukultuuris saab neid stimuleerida jagunema ning ühes või teises suunas diferentseeruma. Nabaväädivere tüvirakke on kasutatud mõne luuhaiguse ja leukeemia e. verevähi ravis. Neuraalsete tüvirakkude abil loodetakse jõuda raskete ajuhaiguste, nt. Parkinsoni ja Alzheimeri tõve ravini. Rakuteraapial arvatakse olevat tähtis koht meditsiini arengus. KOKKUVÕTE Koostatud õpimapis on ülevaatlikult välja toodud bioloogiateaduste kasutamisvõimalused
immuniseerimisel kasutatud antigeeni vastaseid antikehi tootvad B rakud. Ainult tekkinud hübriidsed rakud e. hübridoomid suudavad kasvada selektiivsel söötmel ning neil säilivad vanemrakkude kasulikud omadused võime piiramatult jaguneda ja samas toota kindlate omaduste ja spetsiifilisusega antikehi ehk monokloonseid antikehi. Soovitud spetsiifikaga antikehi produtseerivad hübridoomide kloonid on võimalik isoleerida ning kasvatada rakukultuuris antikehade tootmiseks. Kasutatakse haiguste raviks, kuid ei olnud eriti edukas, sest esiteks ei käivitanud hiire antikehad inimese Fc retseptorite ja komplemendivalkudega seotud efektormehhanisme, samuti oli antikehade poolväärtusaeg lühike. Teiseks, inimestel tekkis hiire antikehade vastane immuunvastus (HAMA - human anti mouse antibody), mis vähendas terapeutiliste antikehade toimet veelgi ja võis olla seotud kahjulike kõrvaltoimetega. 57
mittespetsiifiliseks (söötmetest sõltuv); aeganõudev (tuberkuloosibakter kasvab 1,5 2 kuud); nõuab samastamist (kasvatame üles, peame veel kinnitama, et on see bakter DNA hübridisatsiooniga); inimest on juba ravima hakatud ja alles siis võetakse proov kasv on pärsitud juba; saastamine transpordil. 3. Biotestid 1. rakukultuur kliiniline proov, millega neid rakke nakatame. Kõige tuntum on klamüüdia diagnostika. Rakukultuuris kasvatatud organism ei tohi olla transpordil või ravi tõttu surnud. 2. Loomkatsed katkupisiku diagnostika. Eetikaküsimus. Loomad on väga kallid. Loomakaitsjad võitlevad selle vastu. 4. Kiirmeetodid (molekulaardiagnostika) 1. nukleiinhapete määramine 2. antigeeni/antikeha määramine antigeen ja antikeha peavad omavahel väga hästi sobima (steeriliselt ja laenguliselt), kui ainult laengud sobivad, tekib palju
artikliks vajalikku infot võltsinud. Hilisema uurimuse käigus selgus, et Teresa oli andmeid võltsinud 19 juhul ning karistuseks keelati tal 10 aastat riiklikult finantseeritavates uuringutes osaleda. Kuigi Baltimore ei olnud andmete võltsimises isiklikult süüdi, kahjustas juhtum pikaks ajaks ka tema mainet. Veel üks 1980. aastate skandaale oli seotud AIDSi uuringutega. Teadlane Robert Gallo avaldas artikli teatades, et Prantsuse versioon viirusest ei kasvanud rakukultuuris, kuid tema poolt loodud versioon oli igati edukas. Hilisem analüüs selgitas välja, et tegelikult olid mõlemad versioonid viirusest ühtemoodi hästi kasvanud ning teadlast süüdistati oluliste andmete varjamises omakasu eesmärgil. Siinkohal toodud näited uuringute käigus toimunud võltsingutest ja pettustest on eriti olulised, kuna skandaali keskmes on olnud enamasti juhtiv või lootustandev teadlane. Seega tekib
3C on kemotrüpsiini – tüüpi proteaas, mille katalüütiline aminohappe jääk on mitte seriin vaid tsüsteiin. 3C ja tema eelvalk 3CD teostavad enamuse polüproteiini lõikamisest, peale selle omab 3C ka rakulisi sihtmärke. 3D on RdRp katalüütiline subühik. Erinevalt enamikest tuntud RdRp-dest on polioviiruse 3D praimerist sõltuv ensüüm. Polioviiruste infektsioonitüskkel Poliovirus nakatab looduses vaid inimesi ja simpanseid, kuid rakukultuuris paljuneb ta edukalt ka teiste primaatide rakkudes. Kogu polioviiruse replikatsioonitsükkel toimub nakatatud rakkude tsütoplasmas: Infektsioon algab seondumisega retseptoritele ja sisenemisega rakku. Esimese etapina toimub mRNA translatsioon. Järgneb raku translatsiooni mahasurumine ja viiruse RNA replikatsioon. Uute genoomide ja struktuursete valkude kogunedes toimub uute virionide moodustamine , mis vabanevad nakatunud raku purunemisel. Kokku kestab
(re-fold). Nende geenide ekspressiooni regulatsiooni mehanism on evolutsiooniliselt kujunenud selliseks, et ekstremaalsetes tingimustes on transkriptsiooniks kõik olemas, st pole vaja kromatiini lahti pakkida ega transkriptsiooni preinitsiatsiooni kompleksi kokku panna. 38. Mida tähendab väljend "kasutades lacZ reporterina" ja mis analüüsimeetodiga on tegu? Transgeenne analüüs. Reporter geen on geen, mida lisatakse teise huvipakkuva geeni uurimiseks geeni sisse (rakukultuuris, loomadesse või taimedesse). Neid lisatakse sellepärast, et tunnused, mida nad end ekspresseerivates loomades tekitavad, on kergelt äratuntavad ja mõõdetavad. Üldjuhul kasutatakse, et uurida, kas huvipakkuv geen ekspresseerub. LacZ on geen, mida ekspresseerides hakkab organism tootma laktoosi. Rekombinantse DNA meetod DNA jupid saadakse restriktaasidega, mis lõikavad tömbid otsad. · Kasutatakse saamaks teada teatud geenide funktsiooni
Treponema Üldist. Sale vedrukujuline mikroorganism, regulaarsete loogete, teravate tippude ja sirgete otstega. Aktiivselt liikuv, kummaski otsas periplasmilised flagella. 13 liigist on inimpatogeensed T. pallidum 3 alaliigiga ja T. carateum. Liigid on morfoloogiliselt identsed, põhjustavad sama seroloogilist vastust, on tundlikud penitsilliinile. Ei värvu Grami ega Giemsa järgi, uuritakse pimeväljamikroskoopial. In vitro kasvab ainult rakukultuuris. Elastse rakuseinaga, G- bakteritele sarnase rakuseinaga. Epidemioloogia. Inimesed on ainsad looduslikud peremehed. Veneeriline süüfilis levib sugulisel kontaktil või kongenitaalselt. Riskipopulatsioon moodustub suguliselt aktiivsetest noorukitest, täiskasvanutest, aktiivse haigusega emade lastest. Teiste Treponema-infektsioonide transmissioon toimub limaskestade kontaktil infektsioossete kolletega, kongenitaalsed
Raskete ja kergete ahelate suhe, leiame keskmise. Leiame valgu suhte nendes kahes proovis. Sarnast märkimist võib teha kasutades AH keemilisi omadusi (aminorühm, millel eriline reaktsioon mingi kindla ainega, mida teistel AH pole). Ensümaatiline märkimine (karboksüterminaalse AH märkimine mingi kemikaaliga). SILAC märkimine, pSILAC valgusünteesi dünaamikma uurimisel. SILAC Valgud märgitakse stabiilsete isotoobidega. Rakukultuuris märgitakse valgud lisades söötmele raskeid aminohappeid. Harilikult lüsiin, arginiin või leutsiin, mis sisaldavad 2H, 13C 15 või N aatomeid. Valgud lõigatakse peptiidideks ja peptiidid eraldatakse kromatograafiliselt. Kindla väärtusega m/z ioonide kvantitatiivne suhe näitab peptiidide ja seega ka valkude suhet. Trüpsiin lõikab valguahelat positiivselt laetud
materjali omaduste kvantitatiivne kirjeldus nukleoom? Raku nukleiinhapete kogum operoom? Operonide kogum bakterirakus ORFeoom? Avatud lugemisraamide summa genoomis translatoom? Translatsiooniproduktide kogum rakus transportoom? Membraanitransporterid ja kanalid rakus. RAKKUDE MANIPULEERIMINE JA KASUTAMINE EKSPERIMENTAALSES TÖÖS 1. Rakukultuuride eelised - homogeensed võrreldes koerakkudega; eksperimenditingimused on selgelt defineeritud; rakukultuuris saab isoleerida huvipakkuva raku ja sellest kasvatada geneetiliselt homogeense koloonia rakkude kloonimine; geneetiliselt homogeenne rakutüvi - kloon ja puudused ei saa jälgida kuidas uuritav käitub tervikorganismis või kuidas organism seda mõjutab võrreldes in vivo mudelitega. 2. Mikroorganismide kasvatamine kultuuris - Escherichea coli, Saccaromyces cerevisiae: kiire kasv ja väga lihtne kasvukeskkond. 3
(näiteks statsionaarse faasi rakkudes suureneb negatiivne superspiralisatsioon) ja DNA kompaktsuse astmes mõjutab transkriptsiooni regulaatorite seondumisefektiivsust DNA-le ka spetsiifiliste DNA regioonide lokaalne konformatsiooni muutus. Järgnevalt on toodud detailsem informatsioon nukleoidi valkude kohta. CbpA (curved DNA-binding protein A) seondub DNA-ga mittespetsiifiliselt ja on detekteeritav alles hilises statsionaarses faasis. 36 tunni vanuses rakukultuuris on seda valku 3% totaalvalgust, mis teeb ligikaudu 15000 valgumolekuli raku kohta. 29 CbpB (Rob) (curved DNA-binding protein B, right origin binding protein) ekspresseerub maksimaalsel tasemel eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes, kus teda on üle 10000 molekuli raku kohta. Statsionaarse faasi rakkudes väheneb CppB hulk 60%-le maksimaalsest tasemest. Selle valgu osalust on näidatud nii
annaabi.ee 
