mille alleelid erinevad üksteisest pikkuse osas, seega ei ole vaja määrata DNA nukleotiidide järjestust, vaid kopeeritud DNA lõikude pikkusi Selleks kasutatakse elektroforeesi DNA analüüs Kuna aga multipleks-PCR-i kaudu paljundatud DNA fragmendid on siiski küllalt lähedase pikkusega, kasutatakse nende täiendavaks eristamiseks fluorestseeruvaid värve, mis on ühendatud reaktsiooni läbiviimiseks kasutatavate praimeritega Kõik algselt matriitsilt kopeeritud DNA-lõigud muutuvad värviliseks ning visualiseeritakse värviliste piikidena elektroferogrammidel DNA analüüs Viimane etapp seisneb tulemuste interpereteerimises ja proovidest saadud DNA profiilide võrdlemises Kui proovidest saadud DNA profiilid on erinevad, siis ei saa need proovid pärineda samast allikast, st samalt inimeselt Kui DNA profiilid on samad, siis võib tegemist olla samalt inimeselt pärinevate proovidega DNA võrdlemise näide
Küll aga puuduvad selles teosest tuntud tegelased terane miss Marple ja ekstsentriline Poirot. Teatud mõttes on "Tuhkrul Hobusel" ja "Kelladel" sama peategelane, ühel juhul eluvõõras ja naiivne arheoloog Mark Easterbook, teisel juhul Briti 4 salaluurega seotud Colin Lamb. Tähelepanelik lugeja märkab, et need kujud on niiöelda trükitud samalt matriitsilt ning äravahetamiseni sarnased. Teosel "Tuhkur Hobune" puudub ka traditsiooniline probleemipüstitus: kes sooritas kurteod? siin on see kõrvaline küsimus. Peamine probleem on: kuidas sooritati kuriteod? Ladus ja loogiline on mehhanism, mis kirjeldab "Tuhkru Hobuse" teenuste meetodeid, sellega võrreldes on nõrgem ja vähem loogiline süüdlase paljastamine, kelleks võib muide eelneva põhjal osutuda ükskõik kes
Mittekromatiinne tuumamaterjal; 36% Histoonid; 16% Mittehistoonsed valgud; 28% RNA DNA Histoonid Mittehistoonsed valgud Mittekromatiinne tuumamaterjal 2. DNA replikatsioon Duplikatsiooniprotsess, mis leiab aset matriitsilt kopeerimise tulemusel. Näiteks DNA de novo süntees. Replikatsiooni etapid: ensüüm helikaas lõhub DNA biheeliksi, ensüüm DNA-polümeraas seondub DNA ahelaga, DNA-polümeraas sünteesib mõlema DNA ahelaga komplementaarsed uued DNA ahelad, replikatsioon lõppeb, kui DNA-ahelalt on sünteesitud uus DNA molekul. DNA replikatsiooni komponendid Replikatsioonikahvel (DNA ahelad lahus) DNA topoisomeraasid (muudavad DNA spiralisatsiooni) DNA helikaasid (teevad ahelad lahti)
On olulised geenide kloonimise seisukohalt. Nende avastamise eest said Hamilton Smith ja Daniel Nathans 1978 Nobeli preemia. 41. DNA kloonimise etapid Uuritava geeni isoleerimine Viimine isereplitseeruvasse geneetilisse elementi Amplifikatsoon ehk molekulide paljundamine Uuritava geeniga rekombinantsete kloonide selektsioon. 42. Mis on cDNA? cDNA ehk komplementaarrne DNA on RNA matriitsilt in vitro (katseliselt läbi viidud või katseklaasis toimunud) sünteesitud DNA-molekul. 43. Millised on kloonitud DNA-de kasutusalad tänapäeval? Geenide kloonimise abil saab luua suurt hulka geenide või DNA lõikude koopiaid. Seda kasutatakse Geenianalüüsiks a)geeni funktsiooni välja selgitamine b)geeni omaduste hindamine (nt suurus, kudede jaotus), c) jälgida mutatsioonide toimet geeni toimimisele
külvatakse transformeeritud (muundatud) rakud välja selektiivsele (agar)söötmele. Viiruse või plasmiidi replikatsioonil tekib rohkem kui 1012 identset viiruse või plasmiidi DNA molekuli. Sama koefitsendiga paljundatakse ka rekombinantset DNAd. 4.Rekombinantsete DNA kloonide eraldamine. Selektiivsöötmel kasvatatud kloonidest eraldatakse rekombinantne (milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA fragmendid) DNA. 41. Mis on cDNA? RNA matriitsilt in vitro (katseklaasis kunstlikult loodud ja kindlalt määratletud tingimustes) sünteesitud DNA-molekul. 42. Millised on kloneeritud DNAde kasutusalad tänapäeval? Luuakse mudelhiired, et nende peal katsetades leida ravimeid erinevatele haigustele, võimalik on säilitada hävimisohus olevaid liike, toodetakse valke, uuritakse geeni struktuuri, huvipakkuvaid DNA fragmente saab uurimiseks lõputult paljundada, kloonitakse aiasaaduseid ja taimi, kloonitakse tüvirakke ravieesmärgil. 43
Vajalik teminatsiooni siho sõltumatu terminatsion. G-C rikas piirkond, millele järgneb 6 või rohkem A:T paari, kus A-d on matriitsahelas. G:C rikas piirkonda transkriptsioonil moodustub sisemise homoloogsusega RNA, mis moodustab sekundaarseid kaksikahelaid e. juuksenõela struktuure. See struktuur aeglustab RNA polümeraasi liikumist ja viib A:T rikkas piirkonnas transkriptsiooni terminatsioonini. Pärast juuksenõela struktuuri on U-järjestus ja A:U paarid on nõrgad. RNA matriitsilt lahti! Rho-sôltumatu terminatsiooni mehhanismi korral on terminaatoriks järjestus, mis kodeerib stabiilset G-C rikast juuksenôelastruktuuri ning sellest 3' suunas jääb mitu U-d. Terminatsioon toimub pärast U-de lülitumist. Rho sõltuv - Rho-valgud, erinevad. Terminatsioonijärjestus 50-90 aluspaari, palju C-sid, pole G-sid. Valk jälitab polümeraasi, kui kätte saab - siis terminatsioon. Rho-sôltuva mehhanismi puhul seondub heksameerne rho valk RNA 5' otsast spetsiifilisele
RNA polümeraasid I sünteesib ainult pre-rRNAd, II sünteesib mRNAsid ja mõnesid väikseid tuuma RNAsid, mis osalevad mRNA splaisingus ja III sünteesib tRNAsid, 5S rRNAsid ja mitmeid suhteliselt lühikesi stabiilseid RNAsid. RNA polümeraas II alaühiku C-terminaalne domään (CTD). Transkriptsiooni initsiatsiooni käigus fosforüülitakse RNA polümeraas II suurima alaühiku karboksüterminaalne domeen (CTD), korduv heptapeptiidne järjestus, mis jääb fosforüülituks kuni matriitsilt transkriptsiooni lõpuni. 4. Võrdle prokarüootsete ja eukarüootsete RNA polümeraaside struktuuri ja funktsiooni. Prokarüootidel ainult üks, eukarüootidel kolm polümeraasi. Kõik kolm polümeraasikompleksi sisaldavat kahte suurt ja kahte väiksemat kompleksivalku, millel on suur homoloogia prokarüoodi RNA polümeraasi , ' ja alaühikutega. Sarnaselt bakteri RNA polümeraasiga initsieerib RNA polümeraas II geeni transkriptsiooni DNA matriitsilt teatud nukleotiidipaari
organisatsioonitaseme tõusuga. 14.Valgu süntees Ribosoom – 2 alaüksust – keha ja pea – seal vahel käib läbi info RNA ehk mRNA - Tuumas on DNA, sellelt sünteesitakse mRNA ja viakse tuumast välja tsütoplasmasse - Tsütoplasmas on ribosoomid mis mRNA püüavad ja mis hakkavad mRNA info alusel valkusid sünteesima Valgu süntees e translatsioon – mRNAlt kui matriitsilt koodi vahendusel süntees. Järgneb RNA sünteesile. Vaja läheb ribosoome, mRNAd, tRNAd, aminohappeid, energiat, ensüüme. Tulemuseks valgu molekul 15.Modifikatsioonid Prokarüooid – bakterid - Geenid kompleksis – liitgeenid (operon), mitu struktuuri järjest mille juurde käivad regulaatorgeenid - Transkriptsioon ja translatsioon samaaegselt Eukarüoodid - RNA protsessing (tuumas)
bakterikromosoomist eraldi. Etapid: Uuritava geeni isoleerimine, fragmentatsioon- valitud lõigu eraldamine DNAst Viimine isereplitseeruvasse geneetilisse elementi (kloonimisvektor), ligeerimine Amplifikatsioon- DNA molekulide paljundamine Uuritava geeniga rekombinantsete kloonide selektsioon 42. Mis on cDNA? cDNA ehk komplementaarne DNA on RNA matriitsilt in vitro sünteesitud DNA molekul. In vitro on bioloogilise protsessi katseline läbiviimine või vaatlus organismiväliselt, katseklaasis. Isoleeritakse avalduvate geenid mRNA ning sünteesitakse pöördtranskriptaasiga komplementaarne DNA koopia ehk cDNA, selle kogu sisaldab vaid funktsioneerivate geenide kodeerivaid järjestusi. Viiakse läbi enne kloneerimist. 43. Millised on kloneeritud DNAde kasutusalad tänapäeval?
RNA polümeraas I sünteesib ainult pre-rRNAd. RNA polümeraas II sünteesib mRNAsid and mõnesid väikseid tuuma RNAsid, mis osalevad mRNA splaisingus. RNA polümeraas III sünteesib tRNAsid, 5S rRNAsid, and mitmeid suhteliselt lühikesi stabiilseid RNAsid (U6, splaisingus; 7S, transpordis). Trankriptsiooni initsiatsiooni käigus fosforüülitakse RNA polümeraas II suurima alaühiku karboksüterminaalne domään (CTD), korduv heptapeptiidne järjestus, mis jääb fosforüülituks kuni matriitsilt transkriptsiooni lõpuni. Sarnaselt bakteri RNA polümeraasiga, initseerib RNA polümeraas II geeni transkriptsiooni DNA matriitsilt teatud nukleotiidipaari (lämmastikaluste) juurest või alternatiivina naabernukleotiidipaari juurest. 5' nukleotiid, mis vastab matriitsahela sellele nukleotiidile, millelt transkriptsioon algas, mRNAs cap'takse (lisatakse 7'-metüülguanolaat). 20. Joonista tüüpilise PolII promootori struktuur ja kirjelda faktoreid, mis sinna transkriptsiooni
Komplementaarsus on oluline geneetilise informatsiooni ülekandel. Nukleiinhapetes on komplementaarsed lämmastikalused: adeniinile vastab DNA-s tümiin, RNA-s uratsiil, guaniinile mõlemas nukleiinhappes tsütosiin. Antiparalleelsus- DNA komplementaarsed ahelad on vastassuunalised, keemiliselt erineva polaarsusega (3´→5´ ja 5´→3´). 10. DNA replikatsiooni (sünteesi) põhimõtted Duplikatsiooniprotsess, mis leiab aset matriitsilt kopeerimise tulemusel. Näiteks DNA de novo süntees. Replikatsiooni etapid: ensüüm helikaas lõhub DNA biheeliksi, ensüüm DNA-polümeraas seondub DNA ahelaga, DNA-polümeraas sünteesib mõlema DNA ahelaga komplementaarsed uued DNA ahelad, replikatsioon lõppeb, kui DNA-ahelalt on sünteesitud uus DNA molekul. 11. DNA replikatsiooonikahvel, osalevad ensüümid Replikatsioonikahvel: Replikatsioon toimub alguspunktist lähtuvalt
molekulid on reeglina üheahelalised, kuid ta võib võtta erinevaid konfiguratsioone (ei ole alati lineaarne). Tal on endal eksonukleaalne võime. Võib ise toimida kui ensüüm. Vahe selles, et kui lahtikeerudunud matriitsile moodustub komplementaarne RNA molekul, mis saavutades teatud pikkuse (kindlaks määratud) irdub ise DNA pealt lahti. Kuidas RNA sünteesitakse? Sünteesi reguleerib iga geeni regulatoorne element. DNA keerdub geeni kohalt lahti. RNA transkribeeritakse 5' 3' suunas matriitsilt (3' 5'). Sarnane DNA sünteesiga va: NTP, mitte dNTPs ( deoksü), Ei ole vaja praimerit, Ei ole korrektuuri (proofreading), Uratsiil, mitte tümiin, RNA polümeraas. Transkriptsiooni kolm staadiumi: 1. Initsiatsioon 2. Elongatsioon 3. Terminatsioon Ühesugune pro- ja eukarüootidel. Elongatsioon on konserveerunud kogu elusas looduses. Initsiatsioon ja terminatsioon on erinevad pro-ja eukarüootidel. 1-Initsiatsioon
lõpu. ● Paljud koodonid on sünonüümsed, ehk mitu eri koodonit võib määrata sama aminohappe. ● Olemas on algus- (AUG (metioniini sünteesikoodon)) ja lõpukoodonid (UGA, UAA, UAG (neile ei vasta ükski aminohape ning nendeni jõudes kukub ribosoom mRNA molekulilt maha, nad on stop-koodonid)). 30. Kirjelda valgupeptiidi sünteesi etappe ja tRNA liikumist ribosoomis Translatsioon on protsess, mille käigus sünteesitakse mRNA kui matriitsilt koodi alusel aminohapetest valgu polüpeptiidahel. RNA molekulil on 3 erinevat funktsiooni translatsioonis - mRNA kui geneetilise informatsiooni kandja, tRNA kui translatsiooni protsessi läbiviija, rRNA kui ribosomaalse struktuuri ja funktsiooni osa. Translatsioon jaguneb 3 osaks: 1. Translatsiooni initsiatsioon ehk peptiidahela alustamine Translatsioon algab AUG koodoniga. tRNA seondub vastava aminohappega. mRNAs olevale koodonile vastab tRNA antikoodon
laguneb. Terminatsiooni võib põhjustada ka spetsiifilise terminatsioonifaktori seondumine RNA-le. Sellest tulenevalt on bakterites kirjeldatud 2 erinevat terminatsioonimehhanismi: 1. rho-sõltuva mehhanismi puhul seondub heksameerne rho valk RNA 5' otsast spetsiifilisele järjestusele ja jõuab järele RNA polümeraasile, mis on peatunud RNA sekundaarstruktuuri tõttu. Selle tulemusena dissotseerub RNA rho-sõltuva terminaatorjärjestuse kohal matriitsilt. 2. rho-sõltumatu terminatsiooni mehhanismi korral on terminaatoriks järjestus, mis kodeerib stabiilset G-C rikast juuksenõelastruktuuri ning sellest 3' suunas jääb mitu U-d. Terminatsioon toimub pärast U-de lülitumist. Juuksenõela moodustumine viib RNA:DNA hübriidi lahutamisele U-rikkast järjestusest. Eukarüootsetes (päristuumsetes) rakkudes toimub transkriptsioon põhiliselt sama skeemi kohaselt nagu
struktuuri ning funktsiooni vahelisi seoseid. 2. Molekulaarbioloogia põhidogma Geneetilise informatsiooni ülekande suunda DNA RNA valk nimetatakse oma keskse tähtsuse tõttu molekulaarbioloogia põhidogmaks. Kuni 1969. aastani oli molekulaarbioloogia põhidogma DNA RNA valk. 1969. aastal avastati uus ensüüm - RNA-sõtuv DNA polümeraas ehk pöördtranskriptaas ehk revertaas, mis katalüüsib DNA sünteesi RNA matriitsilt ja seega sai selgeks, et DNA'd sünteesitakse nii DNA kui RNA alusel. Revertaas leiti esialgu imetajate RNA viirustest (retroviirustestest), aga hiljem selgus, et see ensüüm on looduses väga laialt levinud nii eu- kui prokarüootides. Geneetilise informatsiooni ülekande kolm põhilist protsessi on: 1. Replikatsioon - päriliku materjali (mis võib olla nii DNA kui RNA) kahekordistumine. Elusorganismide geneetiline informatsioon on säilitatud kaheahelalise DNA kujul
Valkude proteolüüs: 1. Pidev, konstitutiivne 2. Reguleeritud Reguleeritud proteolüüs trans-translatsiooni kaudu Protsessis osaleb tmRNA ssrA valgu poolt kodeeritud väike stabiilne RNA, hübriid millel on tRNA ja mRNA omadused, on transleeritav. Alaniiniga laetud tmRNA liigub kompleksis teiste valkudega ribosoomi, kui valgusüntees on peatunud, tekkinud on viga ja ribosoom enam edasi ei liigu. Originaalne mRNA vabaneb ning valgusüntees jätkub tmRNA matriitsilt. Valgu C-terminaalsesse otsa liidetud SsrA peptiidi tunneb ära SspB ja valk degradeeritakse proteaaside (näiteks ClpXP) poolt. tmRNA võimaldab jätkata mRNA transleerimist teiste ribosoomide poolt. Kui üks stopib, siis teised jäävad ka seisma kokkuvõttes oleks hulk poolikuid valke. Stoppavasse ribosoomi seotakse tmRNa, vabastatakse mRNAlt ja ülejäänud saavad järkata. Valgud, mis natiivset str ei säilita või translatsiooniviga, kuumashokk, toksiliste kemikaalidega kokkupuude,
dsDNA (double stranded) d – 50 A ribosoomide, valgumolekulide d – 200-300 A DNA aluspaaride vahe – 3,4 A vesiniksideme pikkus – 3 A nukleosoom – 60x110x110 A bakteri ribosoom – 200x200x230 A tuumapoorid – 120x120x75 A bakteriaalne RNA polümeraas – 90x90x60 A Molekulaarbioloogia põhidogma DNA↔ RNA →valk DNA sünteesitakse nii DNA kui RNA alusel! RNA-sõltuv DNA polümeraas – pöördtranskriptaas – revertaas – katalüüsib DNA sünteesi RNA matriitsilt, leiti algselt retroviirustelt. Dogma evolutsiooniline aspekt: looduslik valik toimub organismide mitte geenide tasemel. Valik toimub geeniproduktide tasemel. Ühte „head“ geeni võib ümbritseda „halvad“ geenid ja teda ei valita. Mutatsioonid toimuvad juhuslikult. Epigeneetiline pärilikkus - on seotud genoomi ekspressiooni mustrite kordumisega uues põlvkonnas (DNA metüleerimine), ei ole seotud muutustega genoomis. Geneetilise info 3 põhilist ülekandeprotsessi: 1
elongatsioonikompleks laguneb. Terminatsiooni võib põhjustada ka spetsiifilise terminatsioonifaktori seondumine RNA-le. Sellest tulenevalt on bakterites kirjeldatud 2 erinevat terminatsioonimehhanismi: 1) rho-sõltuva mehhanismi puhul seondub heksameerne rho valk RNA 5´ otsast spetsiifilisele järjestusele ja jõuab järele RNA polümeraasile, mis on peatunud RNA sekundaarstruktuuri tõttu. Selle tulemusena dissotseerub RNA rho-sõltuva terminaatorjärjestuse kohal matriitsilt. Näiteks faag lambdal termineeruvad promootoritelt pL ja pR algavad transkriptid järjestustel tL1 ja tR1. 2) rho-sõltumatu terminatsiooni mehhanismi korral on terminaatoriks järjestus, mis kodeerib stabiilset G-C rikast juuksenõelastruktuuri ning sellest 3' suunas jääb mitu U-d. Terminatsioon toimub pärast U- de lülitumist. Juuksenõela moodustumine viib RNA:DNA hübriidi lahutamisele U-rikkast järjestusest.
annaabi.ee 
