B-l ning olenemata Black GSP kogusest (üks või kaks tilka) eraldus elueerides sellel siiski võrdne hulk komponente. Kattuva tumelilla värvitooni liikuvustegurite võdluse põhjal võib näha, et Black GSP-l on Black B Black GPS 2x Black GPS sama liikuvustegur Black B-ga, kui seda on lisatud kaks tilka. Katsetulemusi vaadates võib öelda, et katse ühest küljest õnnestus, kuna Rf = 42/68=0,618 Rf= 48/68=0,706 Rf= 49/68=0,721 eraldunud komponente oli küllaltki palju. Siiski oleks paremal juhul Rf= 38/68=0,559 Rf= 45/68=0,662 Rf= 46/68=0,676 võinud komponendid jaotuda selgepiirilisteks laikudeks. Seda ei
M 36, 46 Teoreetilise saagise arvutamine: n 0, 05mol M atse tan iliid 135,17 g / mol m n M ; matse tan iliid 0, 05 135,17 6,76 g Saagis on ligikaudu 80% teoreetilisest. 6, 76 0,8 5, 4g Oodatav saagis on ligikaudu 5,4 grammi. 2.3.3.Liikuvustegurite arvutamine Kasutan valemit: a Rf 100% b Minu sünteesitud aniliini liikuvustegur: 1, 25 R f süntees 100% 80, 65% 1,55 Nitrobenseeni liikuvustegur: 4,5 R f nitrobenseen 100% 91,84% 4,9 Aniliini liikuvustegur: 1,1 R f aniliin 100% 73,33% 1,5 Minu sünteesitud aniliini liikuvustegur on mõnevõrra suurem. Ilmselt jäi osa
Järeldused Uuritava segu komponentidest oli kõige suurema molekulmassiga dekstraansinine, mis väljus minimaalse elueerumismahuga. Väikseima molekulmassiga DNP-aspartaat, mis difundeerus geeli pooridesse ning väljus seetõttu maksimaalse elueerimismahuga. Vxmin = 29 ml Vx = 43 ml Vxmax = 83 ml Arvutuste teel saadud Vxmax väärtus oli 83,6 langeb põhimõtteliselt kokku katse tulemusel saadud väärtusega. Järelikult töö on õnnestunud. Segus sisaldunud valgu (müoglobiini) liikuvustegur: 4
kiiremini, st et neil on minimaalne elueerimismaht V x min , see on võrdne vaba vedeliku mahuga. Vx min= Vv Need ained, mis on liiga väikse molekulmassiga, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aegaselt ja väljuvad kõige hiljem, need väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt. Seega Vx=Vt Juhul kui Vg on teada saab leida Vxmax i Vxmax= Vt-Vg Rf = (Vx-Vx min)/(Vxmax Vx min) kus Rf on liikuvustegur, mille väärtused jäävad vahemikku 0-1 Eluaadi frkatsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatograammiks. Antud ttöös koosasin käsitsi. Tüüpiline kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja automaatsest franktsioonikogust ehk kollektorist. Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutataksse käesolevas töös spektromeetrilist meetodit.
Eluaadi kohumaht kuni dekstransinnise kõrgema konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vxmin = Vv = 20,05 ml. Eluaadi kogumaht kuni müoglobiini kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx = 32,5 ml. Eluaadi kogumaht DNP- aspartaat kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vxmax = 68,5 ml. Arvutuslik eluaadi maht on Vxmax=68,84 ja mõõdetud on Vxmax = 68,5, erinevus ei ole liiga suur, see tähendab et töökaitse õnnetus hästi. Liikuvustegur Rf väärtus segus sisaldanud valgu (müoglobiin) jaoks: Rf = = Järeldus Antud töös mina tutvusin geelkromotograafia meetodiga. Töö õnnestus hästi, sest arvutuslik ja mõõdetud eluaadi mahud erinesid väga vähe. Mina kasutasin kolonni nr.1 mis lahutas segusid väga kiiresti. Kolonnis oli näha kolme värvi(sinine, pruun, kollane), see tähendab, et segus oli 3 erinevat ainet ja need lahutusid üksteisest erineva kiirusega Kõige madalama
on) Vxmin = Vv = 24,65 ml Eluaadi maht kuni valgu kõige kõrgema kontsentratsiooniga (kaasa arvatud) väljumiseni Vx=44,65 ml Eluaadi maht kolonnist viimasena väljunud kõrgeima kontsentratsiooniga (kaasa arvatud) fraktsiooni väljumiseni Vxmax= 70,65 ml Arvutuslik Vxmax ei erine väga oluliselt tegelikust mahust. Vahe võis sisse tulla ebatäpsest kolonni mõõtmisest, mis mõjutab arvutusi. Arvutan nende andmete põhjal R f väärtuse, kasutades arvutuslikku V xmax väärtust. Rf on liikuvustegur, mis iseloomustab aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda geeli pooridesse. Arvväärtus peaks jääma vahemiku 0....1. min V x -V x 44,65 ml-24,65 ml Rf = max V x -V x min = 79,8 ml-24,65 ml = 0,36
mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Suured molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse, väljuvad kolonnist esimesena ja on võrdsed kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Väikese molekulmassiga ained liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax. Maksimaalne elueerimismaht on võrdne kolonni kogumahuga Vt. Vxmax ~ Vt Liikuvustegur Rf iseloomustab aineid, mis on võimelikud difundeeruda geeli pooridesse. min Vx - Vx R f = max min Vx - V x Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vaheline graafiline sõltuvus. Töö käik Kolonni iseloomustramine ja ettevalmistamine: · Kontrollin kolonni vertikalsust. On vertikaalne.
5. Kirjeldage, kuidas määratakse aine x elueerumismaht Vx. Aine elueerimismaht on sellise eluaadi maht, milles oleva aine kontsentratsioon on kõige suurem 6. Mida näitavad kolonni minimaalne ja maksimaalne elueerumismaht? Minimaalne võrdne graanulitevahelise vedeliku mahuga ja maht, mille juures väljub esimene aine maksimaalse kontsentratsiooniga Maksimaalne lähedane kolonni mahule ning maht, mille juures viimane aine väljub maksimaalse kontsentratsiooniga. 7. Mis on liikuvustegur Rf ja kuidas seda geelkromatograafia meetodi puhul arvutatakse? Millised on Rf piirväärtused? Liikuvustegur näitab aine liikumist kolonnis võrreldes teiste ainete liikumiskiirustega. Piirväärtused 0 ja 1. Rf = Vx Vxmin / Vxmax Vxmin 8. Mida mõistetakse neelduvuse ehk optilise tiheduse (A ehk D) all? Optiline tihedus näitab lahuse kontsentratsiooni, sest võrdleb proovile suunatava valguse intensiivust proovi läbiva valguse intensiivsusega
väljumiseni Vxmin = Vv = 14,5 ml. Eluaadi kogumaht kuni müoglobiini kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx = 26,5 ml. Eluaadi kogumaht DNP- aspartaat kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vxmax = 42,5 ml. Arvutuslik eluaadi maht on Vxmax=42,615 ja mõõdetud on Vxmax = 42,5 erinevus ei ole liiga suur, see tähendab et töökaitse õnnetus hästi. Liikuvustegur Rf väärtus segus sisaldanud valgu (müoglobiin) jaoks: min V x −V x 26,5−14 ,5 Rf = V max−V min = 42,5−14 ,5 =0,438 x x Järeldus Töö õnnestus hästi, sest arvutuslik ja mõõdetud eluaadi mahud erinesid väga vähe. Kolonnis oli näha kolme värvi(sinine, pruun, kollane), see tähendab, et segus oli 3 erinevat ainet ja need
mõjutada. Küll aga võis seda tulemust mõjutada väike erinevus fraktsioonide mahtudes. Paratamatult oli mõne fraktsiooni maht silma järgi mõõtes pisut suurem või väiksem kui 2 ml. Pigem oli mõni suurem ja rohkem väiksemaid. Liikuvusteguri Rf arvutamine Vx - Vxmin Rf = max Valem: Vx - Vxmin Arvutamisel kasutan Vxmax arvutuslikku väärtust 75,58 ml. 39 - 29 10 Rf = = = 0, 21 75,58 - 29 46,58 Müoglobiini liikuvustegur on 0,21. Järeldused Liikuvusteguri Rf väärtus müoglobiinile on 0,21, mis jääb nõutud vahemikku 0...1. Loen arvutuse ja katse õnnestunuks. Samuti jään rahule koostatud kromatogrammiga. Graafikute erinevad kõrgused on tingitud vaid erinevatel lainepikkustel mõõtmistest. Graafiku üleminekud on sujuvad. Loen ainete lahutamise õnnestunuks. Kasutatud kirjandus Malle Kreen, Terje Robal, Tiina Randla ,,Biokeemia laboratoorsed tööd" , Tallinn 2010 Joonised Joonis 1: http://cnx
33 91 0,1829 6. Kromatogramm 7. Kromatogrammi analüüs · Eluaadi maht kuni kõrgema kontsetratsiooniga dekstraalsinise fraktsiooni väljumiseni: Vxmin = 29 ml · Eluaadi maht kuni kõrgaima kontsentratsiooniga müoglobiini väljumiseni: Vx = 39 ml · Eluaadi maht kuni kõrgema kontsentratsiooniga DNP-aspartaadi väljumiseni: Vxmax = 85 ml · Liikuvustegur Rf valk müoglobiini jaoks: Järeldused · Esimesena väljus kolonnist dekstraalsinine. Selle aine osakesed on liiga suured et mahtuda selle geeli pooridesse. Dekstraalsinine on proovi kõige suurema molekulmassiga aine, seetõttu väljus dekstraalsinine kolonnist kõige kiiremini. · Teisena väljus kolonnist müoglobiin, mis osaliselt difundeerus geeli pooridesse. Müoglobiini molekulmass on väiksem kui dekstraalsinisel, kuid suurem kui DNP- aspartaadil.
poorsusega dekstraangeeliga Sephadex´i markidega, mis on mehaaniliselt tugevamad ja võimaldavad kolonni kiiret voolutamist. Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsiooni kogumine toimub käsitsi. Valemid ja nendes kasutatavad lühendid Täidise maht (Vt) Kolonni vaba maht, s.o graanulitevahelise vedeliku maht (Vv) Graanulitesisese vedeliku maht (Vs) Geelmaterjali (maatriksi) maht (Vg) Valem täidise mahu arvutamiseks: Vt=Vv+Vs+Vg Liikuvustegur Rf: Töö käik Pärast kolonni vertikaalsuse kontrollimist märgitakse üles täidiseks oleva Sephadex´i mark ja tegur k ning uuritava lahuse ja voolutuslahuse koostis. Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja diameeter d. Arvutatakse täidise kogumaht Vt, geelmaatrikis maht Vg = k·Vt ning maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt Vg. Arvutatakse fraktsioonide üldarv n (võttes ühe fraktsiooni mahuks 2 ml) n = Vxmax/2. Nummerdatakse vajalik arv (n) kalibreeritud katseklaase.
aeglasemalt. DNP-aspartaat on nendest kolmest ainest kõige suurema molekulmassiga. Arvutuslikult tuli kolonnist viimasena väljunud komponendi kõrgeima kontsentratsioonida fraktsiooni eluaadi maht , mis on veidi suurem, kui katseliselt saadud tulemus. Tulemuste erinevus arvutusliku ja katselise vahel võis tulla kas arvutustel tehtud ümardustest või kogenematusest antud katse meetodi läbiviimisel. Liikuvustegur : Järeldused: Antud laboratoorse töö käigus lahutasin kolmekomponentse uuritava lahuse geelkromatograafia meetodit kasutades. Uuritav segu koosnes dekstraansinisest, müoglobiinist ja DNP-aspartaadist. Kõige väiksema molekulmassiga neist oli dekstraansinine, mis väljus kolonnist esimesena, ja kõige suurema molekulmassiga neist oli DNP-aspartaat, mis väljus kolonnist viimasena. Liikuvusteguri väärtus tuli arvutuslikult 0,185, mis jääb ilusti ettemääratus vahemikku .
molekulmassiga aine. Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni on esimesele ,,kõrgeimale tipule" vastav elueerimismaht kromatogrammil ja see on: Vxmin=30 mL Eluaadi maht kuni valgu kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni: Vx= 44 mL Eluaadi maht kolonnist viimasena väljunud komponendi (DNP-aspartaat) kõrgeima kontsentratsiooniga fratsiooni väljumiseni: Vxmax=86 mL Liikuvustegur: , kusjuures kasutama peab kolonni arvutuslikku Vxmaxväärtust. Järeldus Arvutuslikult sain maksimaalseks elueerimismahuks Vxmax =99,7 cm3. Katse tegemisel selgus, et tegelik maksimaalne elueerimismaht oli hoopis Vxmax=86 mL. Katse viga tuleb: . See on küllatki suur erinevus, mis võis tulla näiteks sellest, et mõõtsin geelisamba kõrguse või kolonni diameetri ebatäpselt. Erinevus võib tulla sisse ka sellest, et
üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga.
Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis võib maksimaalse elueerimismahu ka arvutada
Kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja kaht parameetrit:
· kolonni vaba mahtu Vv ), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud
geeli pooridesse ei mahu
· maksimaalset elueerimismahtu , s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid,
mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad
LIIKUVUSTEGUR (Rf): ---> Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0...1 (0
Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, 15 milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt. 7. Mis on liikuvustegur Rf ja kuidas seda geelkromatograafia meetodi puhul arvutatakse? Millised on Rf piirväärtused? Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf, mis arvutatakse vastavalt valemile: Rf = Vx Vxmin / Vxmax Vxmin Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0....1 (0 < Rf < 1). 8. Mida mõistetakse neelduvuse ehk optilise tiheduse (A ehk D) all?
Kontrollküsimused 1. Mis on kromatograafia, millel see põhineb ja milliseid kromatograafia liike teate? 2. Selgitage geelkromatograafia meetodi põhimõtet. 3. Milline ühine omadus iseloomustab kõiki geelkromatograafia kolonnide täidisena kasutatavaid materjale? 4. Miks ei tohi kolonnist eluaati koguda liiga kiiresti? 5. Kirjeldage, kuidas määratakse aine x elueerumismaht Vx. 6. Mida näitavad kolonni minimaalne ja maksimaalne elueerumismaht? 7. Mis on liikuvustegur Rf ja kuidas seda geelkromatograafia meetodi puhul arvutatakse? Millised on Rf piirväärtused? 8. Mida mõistetakse neelduvuse ehk optilise tiheduse (A ehk D) all? 9. Millistest teguritest sõltub teatava lainepikkuse juures mõõdetud optilise tiheduse väärtus (avaldis vastavalt Beer'i seadusele)? 10. Mis on kromatogramm ja millist informatsiooni see annab uuritava segu koostise kohta? 57 2
annaabi.ee 
