metanool, atsetonitriil) ning statsionaarne faas mittepolaarne, tüüpiliselt silikageel, mille pinnale on seotud pikad süsivesinikahelad (C8-C18). Pöördfaaskromatograafias toimub lahutamine analüüdi molekulide polaarsuste alusel (komponendid elueeruvad polaarsuse kahanemise järjekorras). Olenevalt sellest, kuidas mobiilse faasi koostis mõjutab analüüsitavate ühendite lahutust kasutatakse vedelikkromatograafias kas isokraatilist või gradientelueerimist. Isokraatilise elueerimise puhul on mobiilse faasi koostis kogu analüüsi ajal konstantne. Isokraatilise elueerimise kasutamine on võimalik, kui piisavalt lühikese ajaga saavutatakse proovi komponentide aktsepteeritav lahutus. Gradientelueerimist kasutatakse segu analüüsimisel, mille komponentide polaarsus varieerub suurtes piirides. Gradientelueerimise korral muudetakse mobiilse faasi koostist ajas, kusjuures mobiilse faasi elueeriv jõud suureneb.
Proovi sisestamine · Uuritav segu viiakse ettevaatlikult kolonni lastes sel tasapisi täidisele tilkuda. · Kui proov on sisestatud, avatakse väljavool ja lisatakse kiiresti pipeti abil väike kogus eluenti. Seda tegevust korratakse kuni proov on täidisesse imbunud. Seejärel võib lisada suurema koguse voolutuslahust. · Kui esimene värviline riba hakkab lähenema kolonni alumisele osale hakatakse eluaati koguma valmispandud katseklasidesse. · Elueerimise võib lõpetada, kui väljuv eluaat on värvitu. Fraktsioonide analüüsimine · Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. · Täiesti värvusetute fraktsioonide absorptsiooni väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone pole vaja mõõta.
visuaalselt jälgitav. Senikaua, kuni kolonni alaossa pole veel jõudnud kõige kiiremini liikuv komponent, väljub kolonnist puhas vooluti, seda ei pea 2 ml fraktsioonidena koguma, kuna see poleks otstarbekas. Kui esimene värviline riba (sinine) jõuab kolonni põhja lähedale, jätkatakse eluaadi kogumist 2 ml kaupa fraktsioonidena. Oluline on, et kogu katse vältel oleks kolonni täidise kohal piisavalt eluenti ning et eluaati kogutaks täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise võib lõpetada, kui kõik värviribad on väljunud ja eluaat on värvitu. Aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis väljendatakse lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Värviliste segude puhul mõõdetakse vaid selliste fraktsioonide absorbtsiooni, milles võib silma järgi värvust täheldada, värvusetute absorbtsiooni väärtused võib lugeda võrdseks nulliga. Nb
peale segu umbes 2 ml voolutuslahust ja kordasin protsessi seni kuni, olin veendunud, et proov on täielikult täidises. Lõpuks kandsin geeli pinnale suurema koguse voolutit. · Kui sinine riba (dekstraansinine) hakkas lähenema kolonni põhjale, eemaldasin ühendatud fraktsiooni kolvi kolonni alt ja alustasin 2 ml mahuga fraktsioonide kogumist katseklaasidesse. Elueerimise ja fraktsioonide kogumise lõpetasin kui eluaat muutus värvituks. Fraktsioonide analüüsimine: · Mõõtsin kõikide fraktsioonide optilised tihedused, et teada saada ainete kontsentratsioonide mõõdud. Selleks kasutasin spektrofotomeetrit. Dekstraansinine: 670 nm Müoglobiin: 410 nm DNP-aspartaat: 360 nm · Eluaadi maht kolvis oli Vv=22,5 ml. Kuna fraktsioone koguti 2ml kaupa, siis iga
müoglobiinist ja 0,3 mg/mlDNP-aspartaadist. Kui proov oli liikunud täidisesse lisasin pipeti abil geeli pinnale väikese kogus voolutit ja lasin sellel sisse imbuda. Siis kandsin geeli pinnale suurema kogus voolutuslahust, lisasin seda pidevalt vastavalt vajadusele. Avasin väljavoolu ning hakkasin koguma voolutit, kuni kõige kiiremini liikuv lahuse komponent jõudis kolonni alaossa. Ühendatud fraktsiooni mahu mõõtsin pärast. Alustasin eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena. Elueerimise lõpetasin, kui väljus viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks. Fraktsioone analüüsisin spektrofotomeetri abil. Igal ainel oli oma neeldumismaksimum. Täiesti värvusetute fraktsioonide optilise tiheduse väärtused võrdusid 0-ga ja neid polnud vaja mõõta. Tulemused: · Kolonni täidiseks on Sephadex'i G-75, iseloomustav pundumistegur k on 0,1 · Geelisamba kõrgus L=33 cm ja diameeter d=1,6 cm
Proovi sisestamine 1. Uuritav segu viiakse ettevaatlikult kolonni lastes sel tasapisi täidisele tilkuda. 2. Kui proov on sisestatud, avatakse väljavool ja lisatakse kiiresti pipeti abil väike kogus eluenti. Seda tegevust korratakse kuni proov on täidisesse imbunud. Seejärel võib lisada suurema koguse voolutuslahust. 3. Kui esimene värviline riba hakkab lähenema kolonni alumisele osale hakatakse eluaati koguma valmispandud katseklaasidesse. 4. Elueerimise võib lõpetada, kui väljuv eluaat on värvitu. Fraktsioonide analüüsimine 1. Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. 2. Täiesti värvusetute fraktsioonide absorptsiooni väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone pole vaja mõõta. 3. Koostatakse 3-veeruline katseandmete tabel, mis on aluseks kromatogrammi
visuaalselt jälgitav. Senikaua, kuni kolonni alaossa pole veel jõudnud kõige kiiremini liikuv komponent, väljub kolonnist puhas vooluti, seda ei pea 2 ml fraktsioonidena koguma, kuna see poleks otstarbekas. Kui esimene värviline riba (sinine) jõuab kolonni põhja lähedale, jätkatakse eluaadi kogumist 2 ml fraktsioonidena. Oluline on, et kogu katse vältel oleks kolonni täidise kohal piisavalt eluenti ning et eluaati kogutaks täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise võib lõpetada, kui kõik värviribad on väljunud ja eluaat on värvitu. Aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis väljendatakse lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Värviliste segude puhul mõõdetakse vaid selliste fraktsioonide absorbtsiooni, milles võib silma järgi värvust täheldada, värvusetute absorbtsiooni väärtused võib lugeda võrdseks nulliga
imbuda. Korratakse veel kord sama. · Kui proov on täielikult geeli imbunud kantakse geeli pinnale suurem hulk voolutit. · Kui esimene värviline riba on kolonnis lähenemas põhjale, eemaldatakse kolb ning hakatakse eluaadti koguma 2 ml mahu kaupa katseklaasidesse. · Kogu voolutamise vältel jälgitakse, et geeli kohal oleks piisavalt eluenti ja seda lisatakse vajadusel pidevalt juurde. · Elueerimise võib lõpetada, kui eluaat muutub värvituks ja eluaadi summaarne maht ei ole väiksem kui kolonni kogumaht. Kogutavate fraktsioonide üldarv peab vastama varem väljaarvutatule. Fraktsioonide analüüsimine · Aine kontsentratsiooni väljendatakse optilise tiheduse väärtusena, mis mõõdetakse vastaval lainepikkusel spektrofotomeetris. · Spektrofotomeetris mõõdetakse segude optilist tihedust järgmistel lainepikkustel:
Kolonni voolutamine: · kui proov on sisestatud, avatakse väljavooluava ning lisatakse vähehaaval eluenti, kuni proov on täidisesse imbunud · pärast seda võib kolonni lisada juba suurema koguse eluenti · puhtasse kuiva kolbi hakatakse koguma ühendatud fraktsiooni · kui dekstraansinine on jõudnud kolonni alaossa, eemaldatakse kolb ja hakatakse katseklaasidesse koguma fraktsioone 2 ml kaupa · elueerimise võib lõpetada, kui eluaat on muutunud värvituks Fraktsioonide analüüsimine: · aine kontsentratsiooni väljendatakse igas fraktsioonis lahuse absorptsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel · absorptsiooni mõõdetakse spektrofotomeetril · värviliste segude puhu mõõdetakse vaid selliste fraktsioonide
7. Proovis sisalduvad ained andsid kolonnis erineva värvuse- sinine, pruun ja kollane, mida kogusin 2 ml fraktsioonidena kaliibritud katseklaasidesse. Katseklaase sain kokku 38. 8. Kui uuritavad ained mööda kolonni allapoole liikusid, lisasin ülevalt pidevalt eluenti, et eluendi nivoo oleks kolonni peas koguaeg sama, sest see tagab uuritav lahuse ühtlasema kiirusega läbivuse kolonnist. 9. Lõpetasin elueerimise, kui eluaadi summaarne maht oli sama, mis arvutuslik kogumaht. Proovide analüüsimine Selleks, et teada saada aine kontsentratsiooni mõõtu, mõõtsin kõikide proovide (va täiesti värvusetute) optilise tiheduse ehk absorbtsiooni. Optilist tihedust määratakse aine neeldumis- maksimumile vastaval lainepikkusel spektrofotomeetri abil. Ainete lainepikkused: · Sinine (Dekstraansinine) 670nm · Pruun (Müoglobiin) 410nm · Kollane (DNP- aspartaat) 360 nm
· Selleks, et uuritav proov siseneks täidisesse täielikult kandsin geeli pinnale kiiresti peale segu umbes 2 ml voolutuslahust ja kordasin protsessi seni kuni, olin veendunud, et proov on täielikult täidises. Lõpuks kandsin geeli pinnale suurema koguse voolutit. · Kui sinine riba (dekstraansinine) hakkas lähenema kolonni põhjale, eemaldasin ühendatud fraktsiooni kolvi kolonni alt ja alustasin 2 ml mahuga fraktsioonide kogumist katseklaasidesse. Elueerimise ja fraktsioonide kogumise lõpetasin kui eluaat muutus värvituks. · Fraktsioonide analüüsimine: · Mõõtsin kõikide fraktsioonide optilised tihedused, et teada saada ainete kontsentratsioonide mõõdud. Selleks kasutasin spektrofotomeetrit. Dekstraansinine: 670 nm Müoglobiin: 410 nm DNP-aspartaat: 360 nm · Eluaadi maht kolvis oli Vv=23 ml. Kuna fraktsioone koguti 2ml kaupa, siis iga järgmise fraktsiooni maht suureneb sellest 2ml võrra.
voolutit, et moodustuks 4 5 cm kõrgune vedeliku kiht. Elueerimislahus: 20 nM Tris/HCl 0,15 M NaCl pH 7,5 · Samal ajal jälgisin, kuidas liikus kolonnis esimene värviline riba (dekstraansinine). · Kui see lähenes kolonni põhjale, siis eemaldasin kolonni alt kolbi ühendatud fraktsiooniga ja jätkasin eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena kaliibritd ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse. · Elueerimise lõpetasin, kui eluaat muutub värvituks. Fraktsioonide analüüsimine. · Aine kontsentratsiooni väljendasin igas fraktsioonis lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. · Absorptsiooni mõõdsin spektrofotomeetril. Katseandmete tabel. Lainepikkus, nm Fraktsiooni nr Elueerimismaht V, ml Optiline tihedus, A Ühendatud
nii palju eluenti, et moodustus u 5 cm kõrgune kiht. Kuna minul oli kolonn ühendatud eluendi pudeliga, siis rohkem enam käsitsi ma eluenti kolonni kandma ei pidanud. Kolonnis tekkis kolm värvilist riba sinine, pruun ja kollane. Kui sinine riba jõudis kolonni alla äärde, siis eemaldasin ühendatud fraktsiooni kogumise jaoks mõeldud kolvi ning edasi kogusin eluaati juba 2 mL fraktsioonidena. Lõpetasin elueerimise kui eluaat oli pärast kollase riba kogumist muutunud uuesti värvituks ning ka eluaadi summaarne maht oli enam-vähem võrdne arvutatud kogumahuga Vt. Samuti vastas kogutud fraktsioonide üldarv varem väljaarvutatule, kui võtsin arvessse seejuures ka kolbi kogutud ühendatud fraktsiooni mahtu. Ühendatud fraktsiooni mahuks oli: 26 mL Fraktsioonide analüüsimine Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorptsiooni ehk
vedeliku kiht. Jälgisin, kuidas kolonnis liikus esimene värviline riba-sinine- ning kui see lähenes põhjale, eemaldasin kolonni alt kolvi ühendatud fraktsiooniga ja jätkasin eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena kaliibritud ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse. Kogu voolutamise vältel jälgisin, et kolonni täidise kohal oli piisavalt eluenti, vajadusel lisasin ja et vahetaksin õigel ajal katseklaase täpse 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise lõpetasin, kui silma järgi polnud enam lahuses näha kollast värvust. Fraktsioonide analüüsimine Selles töös väljendame aine kontsentratsiooni igas lahuses selle optilise tiheduse väärtusena. Optilist tihedust mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel, spektrofotomeeriga elektromagnetilise kiirguse visuaalses piirkonnas. Siniseid fraktsioone mõõtsin lainepikkusel 670
Kui see lähenes kolonni põhjale, siis eemladasin kolonni alt kolvi ühendatud fraktsiooniga ja jätkasin eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena kaliibritud ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse. Kogu voolutamise vältel jälgisin, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja lisasin seda vastavalt vajadusele juurde. Samuti vahetasin õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise lõpetamise üle otsustasin eluaadi summaarse mahu järgi, mis ei tohi olla väiksem kui kolonni kogumaht Vt. Fraktsioonide analüüsimine Et väljendada aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Absorbtsiooni mõõtsin spektromeetril. Mõõtmist alustasin kui olin saanud praktikumi juhendajalt loa.
2·106, ning müoglobiini molekulmass on 16800 ja DNP- aspartaadi mass on kõige väiksem. Kui dekstraansinine jõuab kolonni põhjale siis hakatakse eluaadi kogumist 2ml mahuga fraktsioonidena kaliibritud ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse. Kogu voolutamise vältel tuleb · jälgida, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja seda vastavalt vajadusele juurde lisada, · vahetada õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise lõpetamise üle otsustasin eluaadi värvituks muutumise järgi (värviliste proovide korral). Sain koguda 26 katseklaasi 2ml-ga eluendiga. Ka mõtsin vooluti osa (nn ühendatud fraktsiooni) maht 23 cm3 Kogutavate fraktsioonide üldarv peab vastama varem väljaarvutatule, võttes seejuures arvesse ka kolbi kogutud ühendatud fraktsiooni mahtu Fraktsioonide analüüsimine Antud töös väljendasin aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk
mass on kõige väiksem st 294,301. Kui dekstraansinine jõuab kolonni põhjale siis hakatakse eluaadi kogumist 2ml mahuga fraktsioonidena kaliibritud ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse. Kogu voolutamise vältel tuleb · jälgida, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja seda vastavalt vajadusele juurde lisada, · vahetada õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise lõpetamise üle otsustasin eluaadi värvituks muutumise järgi (värviliste proovide korral). Sain koguda 26 katseklaasi 2ml-ga eluendiga. Ka mõtsin vooluti maht st Vv = 23 cm3. NB! See ei ole kolonni vaba maht, vaid nn ühendatud fraktsioon, mis moodustab vaid osa Vv- st! Kogutavate fraktsioonide üldarv peab vastama varem väljaarvutatule, võttes seejuures arvesse ka kolbi kogutud ühendatud fraktsiooni mahtu Fraktsioonide analüüsimine
ainete segule; hea lahutuvus terve kromatogrammi ulatuses; parem tundlikkus hiljem elueeruvatel piikidel. Kuid kromatograaf vajab binaarseid pumbasüsteeme ja meetodi väljatöötamine nõuab aega. 29. Normaalfaasi kromatograafia põhimõte Statsionaarne faas on polaarne ja mobiilne faas on mittepolaarne. Lahutamise mehhanism: analüüdi ja mobiilse faasi molekulid on ineraktsioonis silikageeli hüdroksüülrühmadega ja konkureerivad omavahel adsorptsioonitsentrite hõivamisel. Analüütide elueerimise järjekord toimub polaarsuse kasvu järgi. => Esimesena väljub MITTEPOLAARNE aine. + Töötab seal kus teised lahutamise mehhanismid ei tööta, sobib preparatiivseks analüüsiks - Retsensioon võib olla liiga tugev Nõrga eluendi puhul: madala polaarsusega eluent. Tugeva eluendi puhul: keskmise polaarsusega eluent. 30. Pööratud faasi kromatograafia põhimõte Mobiilne faas on polaarne ja statsionaarne faas on mittepolaarne. (vastupidi normaalfaasi krom. põhimõttele).
Kui see läheneb kolonni phjale, siis eemaldatakse kolonni alt kolb ühendatud fraktsiooniga ja jätkatakse eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena kaliibritud ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse. Kogu voolutamise vältel tuleb ¾ jälgida, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja seda vastavalt vajadusele juurde lisada, ¾ vahetada õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise lõpetamise üle võib otsustada kas eluaadi värvituks muutumise järgi (värviliste proovide korral) või eluaadi summaarse mahu järgi, mis ei tohi olla väiksem kui kolonni kogumaht Vt. Kogutavate fraktsioonide üldarv peab vastama varem väljaarvutatule, võttes seejuures arvesse ka kolbi kogutud ühendatud fraktsiooni mahtu. Fraktsioonide analüüsimine Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk
annaabi.ee 
