Protsesseeritud pseudogeenid sisaldavad funktsionaalse geeni eksoneid ja omavad tavaliselt ühes otsas oligo (dA)/(dT) järjestusi. Tekkinud retrotranspositsiooni tagajärjel cDNA-dest (üle 2000 ribosomaalse valgu protsesseeritud pseudogeeni). Tavaliselt ei ekspresseeru. Ekspresseeritud protsesseeritud geenid ehk retrogeenid on samuti tekkinud retrotranspositsiooni teel, on muutunud valiku survel funktsionaalseks. Transpositsioonis on edukaimad RNA polümeraas III transkriptid. Alu kordusjärjestused on arvatavasti pärit 7SL RNA protsessitud pseudogeeni koopiatest. DNA järjestused, mis saavad ennast liigutada uude positsiooni ühe rahu genoomi piires. Mehhanism võib olla kas: ,,copy and paste" or "cut and paste". Võivad esile kutsuda fenotüübi mutatsioone ja muuta raku genoomi suurust. Transposoneid moodustab suur omsa C-väärtusi eukarüootses rakus. Kaks klassi posoneid: DNA transposonid ja retroposonid (jaotuvad LTR-e omavateks ja mitteomavateks). NB
30. Emasisendid sünteesivad Fn-et Sxl valku, mis represseeerib eksonite 3,2 spalisingut Sxl pre-mRNAs ja eksonite 1,2 spalisingut tra-mRNAs. Tra- tra2 kompleksi sidumine Dsx pre-mRNAle aktiveerib eksonite 34 splaisingu. Selle tulemusena sünteesitakse emas- ja isasembrüotes ernevaid Dsx valke. Dsx mees-vorm represseerib naissooliseks diferentseerumiseks vajalike geenide ekspres-siooni. 31. Inimese BDNFi geen on enam kui 80,000 aluspaari pikkune. BDNFi mazhoorsed transkriptid aga 1.8 ja 4.4 kb pikad. Millest selline geeni verdsus mRNAde pikkuse erinevus on tingitud? Kirjelda molekulaarseid protsesse, mis on selle pikkuste erinevuse taga. a. Lõigatakse erinevad introinid välja. Võib olla erinev 3' ots. Splaissimine: erinevate splaissaitide kasutamine; poly(A) saitide alternatiivne kasutamine; alternatiivsete promootorite kasutamine. 32. Mida näitab rakule antud ajahetkes iseloomulik mRNA tase? 33
taseme erinevates rakutüüpides Geeni transkriptsioon ja RNA protsessing Alternatiivne splaising Koepetsiifiline splaising esineb sageli eukarüootsetel geenidel: tekivad erinevad transkriptid ja valgud Transkriptsiooni faktorid Geenide ekspressiooniks on vaja transkriptsiooni faktoreid: – Üldised transkriptsiooni faktorid (GTF; general transcription factors) on vajalikud transkriptsiooni alustamiseks – aitavad RNA polümeraasil seonduda DNA-ga. – Spetsiifilised transkriptsiooni faktorid võimendavad ekspressiooni erinevates rakutüüpides või vastusena rakuvälistele signaalidele.
Intron on eukarüootse geeni mittekodeeriv piirkond, mis transkribeeritakse RNA molekuliks, ent seejärel lõigatakse sealt splaisingu tulemusena välja.Vahe on selles, et intronid lõigatakse välja ja eksonid (inteiinid) liidetakse kokku. 47. Peaagu kõik mRNAd sisaldavad järjestust AUAAA, mis asub polü(A) sabast 10-35bp ülavoolu. Kui see AUAAA ära muteerida, siis RNA transkriptide polüadenüülimist peaagu ei esine. Muteerimisel need polü(A)-sabata transkriptid kogunevad tuuma ning suunatakse lagundamisele. 360kDa lõikamis-ja polüadenüülimis-spetsiifiline faktor (CPSF), mis koosneb neljast erinevast valgust, moodustab kõigepealt AAUAAA järjestusest ülavoolu seonduva ebastabiilse kompleksi. Seejärel seonduvad sellele CPSF-RNA kompleksile vähemalt kolm valku: 1) 200 kDA heterotrimeer, mida nim lõikamist-stimuleerivaks faktoriks (CStF), mis interakteerub G/U rikka järjestusega; 2) 150kD lõikamisfaktor I (CFI) ja halvasti kirjeldatud
· Kaks peamist gruppi: · Pikad mitte-kodeerivad RNAd (oluline roll bioloogilistes protsessides, nt areng, paljunemine) · Lühikesed mitte-kodeerivad RNA (21-24 nukleotiidi). Funktsioon on geeni vaigistamine · microRNA (miRNAs) · short interfering RNA (siRNAs) · piwi-interacting RNA (piRNAs) Pikad ncRNAd Kolm kategooriat: loomulikud antisense transkriptid (natural antisense transcripts (NATs). Pikad intronites sisalduvad RNAd. Pikad geenidevahelises järjestuses asuvad RNAd (long intergenic noncoding RNAs (lincRNAs) Oluline roll bioloogilistes protsessides arengu regulatsioon stressi vastused paljunemine vastus patogeenidele jm taimedel. Geeni vaigistamise viisid: · mRNA translatsiooni mõjutamisega · Kromatiini epigeneetiliste modifikatsioonide kaudu
Baculoviiruste genoomi mõõtmed on vahemikus 90-180 kbp; genoom on tsirkulaarne. Sekveneeritud on üle 30 bakuloviiruse genoomi AcMNPV genoom on 133,894 bp pikkune ja sisaldab: 1. 337 OFR-i (pikkusega üle 150 bp), lugemisraamid paiknevad mõlemas ahelas; funktsionaalset klasterdumist ei ole. Geenid paiknevad teineteise lähedal (vahed enamasti 2-200 bp), need vahealad on AT-rikkad ja toimivad promooterite ja terminaatoritena. Introneid on väga vähe. Transkriptid (eriti hilised) on sageli struktuurselt polütsistroonsed. 2. Peale selle paikneb AcMNPV genoomis veel 8 homoloogilist kordusjärjestust (hrs, pikkusega 30-800 bp). Hr järjestus koosneb nn 60 bp kordustest, millest igaüks koosneb väga konserveerunud mittetäiuslikest 28 bp palindroomidest. Hr elemendid toimivad geeniekspressioonil enhanseritena (seondavad viiruse trans-aktivaatoried) ja osalevad
-35 -10 regioon sisaldab prokarüootset promootorit. DNA matriitsahel, mis on +1 ja terminaatori vahel transkribeeritakse RNA'sse, mis siis transleeritakse valku. Selles staadiumis DNA on kaksikheeliks (suletud). DNA põimub lahti üksikahelaks initsiatsiooni saidi lähedal (+1). RNA-polümeraas transkribeerib DNA'd (- alaühik initsieerib sünteesi), kuid toodab umbes 10 "värdjalikku" (lühike, mitteproduktiivne) transkripti. Need transkriptid ei saa polümeraasist väljuda, kuna väljapääs on blokeeritud -faktoriga. Lõpuks -faktor dissotseerub holoensüümist ja järgenb elongatsioon. Eukarüoodi transkriptsiooni initsiatsioon: Eukarüootide promootor on tavliselt 50 aluspaari ülavoolu transkriptisooni intsiatsiooni saidist. Koosneb see basaalsest transkriptsiooni-kompleksist ja RNA-polümeraas II-st. Edasine transkriptsiooni regulatsioon on teostatud ülavoolu kontrollielementidega, tavaliselt asuvad nad umbes 200
Prokarüoodi transkriptsiooni initsiatsioon: RNA polümeraas seondub ühega paljudest spetsiifilistes tranksriptsiooni faktoritest (-faktor) moodustades holoensüümi. Saab seonduda promootor-piirkonnaga DNA'l. -35 -10 regioon sisaldab prokarüootset promootorit.. Selles staadiumis DNA on kaksikheeliks. DNA põimub lahti üksikahelaks initsiatsiooni saidi lähedal. RNA- polümeraas transkribeerib DNA'd,kuid toodab umbes 10 "värdjalikku" (lühike, mitteproduktiivne) transkripti. Need transkriptid ei saa polümeraasist väljuda, kuna väljapääs on blokeeritud -faktoriga. Lõpuks -faktor dissotseerub holoensüümist ja järgenb elongatsioon. Eukarüoodi transkriptsiooni initsiatsioon: on keerulisem kui prokarüoodil, RNA polümeraas ei tunne otseselt ära promootor-järjestust, selleks on vajalikud transkriptsioonifaktorid, mis kinnituvad esmalt promootorjärjestusele ja seejärel saab seonduda alles polümeraas. Koos moodustavad nad transkriptsiooni initsiatsiooni kompleksi.
territooriumiteks (CT). Kromosoomide territooriumite pinnad ja nende vahelised alad moodustavad võrgustiku-laadse 3D tuuma sektsiooni geeniekspressiooniks, mRNA splaissinguks ja transpordiks mida nim interkromatiini kompartmendiks (IC). 10 nm fiiber ebakorrapärases olekus, mis on dünaamilise liikumisega või klasterdunud CT-tes avatud ja suletud kompartmentite gloobulites. Mudeli kohaselt asuvad aktiivsed geenid territooriumite pindadel ning mRNA transkriptid vabanevad IC ruumi. Kromatiini domeenid on kromosoomide territooriumite komponendid. Interkromatiinne kompartment esineb kromatiini domeenide vahel, see on DNA-vaba piirkond ning sisaldab splaissimise spekleid. Perikromatiinses ruumis toimub perikromatiini fibrillide tootmine. Iga fibrill kannab vastset transkripti erinevatelt geenidelt. Splaissimise speklid varustavad fibrille splaissimise faktoritega. 4
Leutsiini tõmbluku (Leu Zipper) motiiv. 4. mRNA transkriptsioonijärgen modifitseerimine. Prokarüootides mRNAd ei modifitseerita. Eukarüootides mRNA primaarne transkript modifitseeritakse küpseks mRNA-ks tuumas enne suunamist tsütoplasmasse. Sünteesi käigus modifitseeritakse mRNA primaarseid transkripte kovalentselt nii 5'- kui 3'-otsast, muutes nad erinevateks teiste polümeraaside poolt toodetud RNA-dest. Kapseldamine ja metüleerimine. Primaarsed transkriptid varustatakse kõigepealt 5'-otsast 7-metüülguanosiin- rühmaga, mis seotud ebatavalise 5',5'-trifosfaatsidemega. G-jääk seejärel metüleeritakse 7-asendis. Järgnevalt metüleeritakse 2'-O asendid järgmisel kahel jäägil ning esimese adeniini 6-aminorühm. 3'-polüadenüleerimine. Primaarne transkript 3'-ots modifitseeritakse samuti kovalentselt: kui RNA polümeraas II on lõpetanud, lõigatakse sünteesitud ahel polüadenülaadi
tsistroni ees. Translatsiooni initsiatsioon võib alata ükskõik milliselt neist paljudest ribosoomi sidumissaitidest, mille tulemusena üks mRNA võib kodeerida erinevaid valke. Enamike eukarüootsete mRNAde puhul määrab 5'-cap struktuur ära ribosoomi sidumiskoha ja translatsioon algab lähimalt AUG koodonilt. Selle tulemusena translatsioon saab alata vaid ühelt saidilt. Paljudel juhtudel eukarüootsed valku-kodeerivad primaarsed transkriptid protsessitakse üht tüüpi mRNAks, millelt sünteesitakse ühte tüüpi valk. Promootorid määravad ära transkriptsiooni initsiatsiooni koha ja suunavad RNA polümeraas II sidumist. Eukarüoodi DNAs on leitud kolme tüüpi promootorjärjestusi. TATAbox, kõige sagedasem, mis esineb tavaliselt kõrge transkriptsiooni tasemega geenide promootorites. Mõnedel geenidel on Initsiaatoriga promootorid ja teistele on iseloomulikud CpG (saarekestega) promootorid. 16. Mis on sigma faktori funktsioon
1. Millised on FACSi eelised võrreldes käsitsi pipeteerimise ees, kui uuritakse transkriptoomi ühe raku tasandil? FACSi eelistatakse, kui on vaja väga kõrge kvaliteeti saavutada puhastamisel, kui rakk ekspresseerib väga madalal tasemel uuritavat markerit. 2. Miks kasutatakse UMI-t ning ankurdatud polü-T praimerit? UMI – unique molecular identifier – märgistatud järjestus ja 5’ positsioon mRNAl moodustavad UMI. Ehk UMId märgistavad transkriptid ning võimaldab neid kvantitatiivselt detekteerida. polüT praimereid kasutatakse polüadenüleeritud mRNA pöördtranskriptsiooniks ja cDNA sünteesiks. Sünteesitud cDNA 3’ otsa lisatakse polüA saba terminaalse desoksünukleotidüül transferaasi vahendusel, et varustada cDNA mõlemad otsad universaalse, kuid omavahel erineva ankurjärjestusega. Teise cDNA sünteesiks kasutatakse polüT praimereid, mis kinnituvad polüA
Protsesseeritud pseudogeenid sisaldavad funktsionaalse geeni eksoneid ja omavad tavaliselt ühes otsas oligo (dA)/(dT) järjestusi. Tekkinud retrotranspositsiooni tagajärjel cDNA-dest (üle 2000 ribosomaalse valgu protsesseeritud pseudogeeni). Tavaliselt ei ekspresseeru, Ekspresseeritud protsesseeritud geenid ehk retrogeenid on samuti tekkinud retrotranspositsiooni teel, on muutunud valiku survel funktsionaalseks, Transpositsioonis on edukaimad RNA polümeraas III transkriptid. Alu kordusjärjestused on arvatavasti pärit 7SL RNA protsessitud pseudogeeni koopiatest. Klasterdatud geeniperekonnad sisaldavad sageli protsessimata pseudogeene või geenifragmente (HLA I perekond 6p21.3 koosneb 20 geenist). Protsesseeritud pseudogeenid ja retrogeenid tulenevad RNA transkriptide pöördtranskriptsioonist (LINE-1 elemendid) ja integratsioonist genoomi. 18. Tandeemselt kõrgeltkorduv mittekodeeriv DNA esineb tandemkorduste
See võimaldab metioniini formüleerimist. D-õlas paikneb Y11:R24 asemel R11:Y24 aluspaar. Antikoodon-heeliksis paikneb kolm G:C aluspaari, mille abil suunatakse initsiaator tRNA otse ribosoomi P-saiti. Eukarüootsel initsiaator-tRNA-l on N1:N72 aluspaardumine säilunud. Kuid T-lingus puudub TΨ-järjestus. Antikoodon-heeliksis paikneb kolm iseloomulikku G:C aluspaardumist. precursor-tRNA protsessimise etapid. tRNA geenide esmased transkriptid omavad 5'- ja 3'- otstes lisajärjestusi ja funktsionaalsete tRNA molekulide moodustumiseks peavad nad läbima protsessingu. tRNA transkripti 5’ otsas paikneva liigse järjestuse eemaldab endoribonukleaas RNaasP, mille variant on olemas kõikides organismides. RNaasP omab nii RNA komponenti kui ka valgulisi subühikuid. Üldiselt leiab 5’ otsa protsessing aset enne 3’ otsa protsessingut. tRNA geeni transkripti 3’ poolne protsessing on komplitseeritum
Valk jälitab polümeraasi, kui kätte saab - siis terminatsioon. Rho-sôltuva mehhanismi puhul seondub heksameerne rho valk RNA 5' otsast spetsiifilisele järjestusele ja jôuab järele RNA polümeraasile, mis on peatunud RNA sekundaarstruktuuri tôttu. Selle tulemusena dissotseerub RNA rho-sôltuva terminaatorjärjestuse kohal matriitsilt. 113. RNA protsessingu tüübid eukarüootidel??? mRNA mono- või multigeenne; I, II, III, polümeraasid; primaarsed transkriptid tuumas - heterogeense tuuma RNA (hnRNA). Enne nende transporti tsütoplasmasse neis 3 tüüpi: 1. 5'-otsa 7-metüülguanosiin müts. 2. 3'-otsa lisatkse polü(A) saba 3. Kui olemas, siis intronid lõigatakse pre-mRNA-st välja RNA on algselt kaetud RNA-seoseliste valkudega (kaitse nukleaaside eest). Eukarüootse geeni transkripti poolestusaeg 5 tundi, prokarüootidel 5 minutit. 114. RNA ahela initsiatsioon eukarüootidel. Cis-toimelised järjestused.
polümeraas II on võimeline alustama RNA sünteesi 4. Kui polümeraas lõpetab mRNA sünteesi, tema saba defosforüleeritakse ja ta on uueks tsükliks valmis 45. Pre-mRNA põhilised modifitseerimise protsessid eukarüootides: cap struktuur, polüadenüleerimine, splaissing Primaarne transkript- RNA polümeraasi sünteesi produkt. Tüüpiliselt ei ole primaarsed transkriptid 100% aktiivsed. Selleks, et RNA võtaks küpse vormi, on vajalikud spetsiifilised modifikatsioonid RNA struktuuris, mis sõltuvad konkreetsest RNA klassist: Capping – mütsistruktuur mRNA 5’ otsa lisatakse cap struktuur – 7-metüülguanosiin – mRNA kõige esimese nukleotiidi otsa. CAP-struktuur kaitseb mRNA 5’ otsa nukleaaside eest ning on seondumiskoht CAP-struktuuriga seonduvale valgukompleksile CBC (cap binding complex)
järjestusega geenis ning algab transkriptsioon. Kontroll RNA protsessingu tasandil reguleerib mRNA produkti pre-mRNA-st. Kaks üksteisest sõltumata mehhanismi: Alternatiivne polüadenüleerimine lisatakse polüA saba. Alternatiivne splaissing millised eksonid splaissitakse. Mõlemad protsessid võivad toimuda üheaegselt. mRNA transpordi kontroll: Eukarüoodil reguleeritakse mRNA transporti tuumast tsütoplasmasse. Eksperimendid näitavad, et peaaegu pooled tuumas sünteesitud transkriptid ei jõua sealt välja ja degradeeritaksegi tuumas. Küps mRNAs läheb tsütoplasmasse läbi tuumamembraanisolevate pooride. mRNA kontroll translatsioonil: Heaks näiteks on viljastamata munarakk, milles mRNA-d küll sünteesitakse ja säilitatakse, kuid ei transleerita. Intensiivne translatsioon algab kohe pärast viljastamist. Taoline säilitatav mRNA on kaetud vastavate valkudega, mis kaitsevad seda degradatsiooni eest ja inhibeerivad translatsiooni. Polü(A) terminaalne järjestus viib
Integratsiooniks on vaja, et rakk kasvaks, aga HIVi ja teiste lentiviiruste cDNA võib tuuma ja tsütoplasmasse integreerimata rõngas-DNAna jääda, kuni rakk aktiveerub. Pärast integreerumist transkribeeritakse viiruse DNAlt kui raku geenilt peremehe RNA polümeraas II poolt, tekib täispikkusega RNA, milles lihtsatel retroviirustel on gag, gag-pol või env geenijärjestused. Täispikkusega genoomi transkriptid võivad assambleeruda uuteks virionideks. Kuna viirus käitub raku geenina sõltub tema replikatsioon viiruse DNA metüleerituse astmest ja raku kasvukiirusest, peamiselt aga raku võimest ära tunda LTRregiooni enhancereid ja promootoreid. Raku stimulatsioon vastusena teistele infektsioonidele, tsütokiinide või mitogeenide toimel toodab transkriptsioonifaktoreid, mis seostuvad LTRiga, võivad viiruse transkriptsiooni aktiveerida
HIV infitseerib T-rakke, makrofaage ja dendriitrakke. Viiruse partikkel seostub CD4 ja koretseptoriga T-rakul Viiruse ümbris sulandub rakumembraaniga, lastes viiruse genoomil rakku siseneda Pöördtranskriptsioon kopeerib viiruse RNA genoomi topeltahelaliseks cDNA-ks Viiruse cDNA siseneb raku tuuma ja integreerub peremeesraku DNA-ga T-raku aktivatsioon indutseerib madalatasemelist proviiruse transkriptsiooni RNA transkriptid paljundatakse ja seotakse, saab toimuda varajaste geenide tat ja rev translatsioon Tat amplifitseerib viiruse RNA sünteesi, rev indutseerib üksikult seotud või mitteseotud viiruse RNA transporti tsütoplasmasse Hilised valgud Gag, Pol, ja Env transleeritakse ja viiakse viiruse partiklitesse, mis rakust välja punduvad IS kontrollib HIV hulka, kuid ei suuda viirust lõplikult elimineerida. HIV nakatunud inimestel esineb 4 perioodi haiguse kulus:
seondumine RNA-le. Sellest tulenevalt on bakterites kirjeldatud 2 erinevat terminatsioonimehhanismi: 1) rho-sõltuva mehhanismi puhul seondub heksameerne rho valk RNA 5´ otsast spetsiifilisele järjestusele ja jõuab järele RNA polümeraasile, mis on peatunud RNA sekundaarstruktuuri tõttu. Selle tulemusena dissotseerub RNA rho-sõltuva terminaatorjärjestuse kohal matriitsilt. Näiteks faag lambdal termineeruvad promootoritelt pL ja pR algavad transkriptid järjestustel tL1 ja tR1. 2) rho-sõltumatu terminatsiooni mehhanismi korral on terminaatoriks järjestus, mis kodeerib stabiilset G-C rikast juuksenõelastruktuuri ning sellest 3' suunas jääb mitu U-d. Terminatsioon toimub pärast U- de lülitumist. Juuksenõela moodustumine viib RNA:DNA hübriidi lahutamisele U-rikkast järjestusest. rU::dA RNA-DNA hübriid võib olla piisavalt ebastabiilne, et RNA vabaneks transkriptsioonikompleksist
annaabi.ee 
