Selle tulemusel saadakse DNA molekul. (Ühest-kaks ühesugust nukleotiidse järjestusega DNA molekuli). 3.Mis on transkriptsioon? translatsioon? a)Transkriptsioon: matriitssüntees. Toimub interfaasi ajal, saadakse RNA molekul. b)Translatsioon: matriitssüntees, saadakse valgu molekul. Toimib nii eel kui ka pristuumsetes rakkudes vastavalt vajadusele. 4.Mida nimetatakse geeniks? Geen: DNA lõik mis määrab ära ühe RNA molekuli sünteesi. 5.Millistest osadest koosneb geen? *Promootorist *RNA sünteesipiirkonnast *Terminaatorist 6.Mis on transkriptsiooni saadused? RNA molekulid 7.Mida nimetatakse geeni avaldumiseks? Kui geenilt toimub transkriptsioon, siis geen avaldub ning tekib vastav valk. 8.Mis on geneetiline kood? mRNA molekuli kolme järjestikkuse nukleotiidi esinemine vastavus ühele aminohappele valgu molekulis 9.Kuidas jaotatakse geenid avaldumise järgi?4.rühma. Geenid mis avalduvad: *üheaegselt organismi kõigis rakkudes *ainult ühe kindla koe rakkudes
Translatsioon e. valgusüntees on universaalne protsess, mis toimub peaaegu ühesuguselt kõigis organismides. Protsess toimub ribosoomides, kus mõtestatakse lahti geneetiline kood ning selle tulemusena sünteesitakse kindla aminohappelise järjestusega valgu molekul. 4. mida nimetatakse geeniks? Geen on DNA-molekuli lõik, mis kodeerib valku või määrab mingi RNA-molekuli sünteesi. 5. millistest osadest koosneb geen? Promootorist, RNA sünteesipiirkonnast ja terminaatorist. 6. mis on transkriptsiooni saadused? RNA molekulid 7. mida nimetatakse geeni avaldumiseks? Kui geenilt toimub transkriptsioon, siis geen avaldub ning tekib vastav valk. 8. mis on geneetiline kood? mRNA molekuli kolme järjestikkuse nukleotiidi esinemine vastavus ühele aminohappele valgu molekulis. 9. kuidas jaotatakse geenid avaldumise järgi? Geenid mis avalduvad:
Inimesel 24 genoomi. Molekulaargeneetika- teadusharu, mis uurib pärilikkuse seaduspärasusi molekulaarsel tasemel. Pärilikkus-looduse üldine seaduspärasus, mille kohaselt järglased sarnanevad ehituselt ja talituselt vanematega. 2. Kirjelda, kuidas geenist saab tunnus. * DNA koosneb geenidest * geen avaldub > Rna * RNA järgi tehakse valk * valk kujundab tunnuse 3.Transkriptsioon: RNA süntees * toimub rakutuumas * lähteaine on DNA lõik promootorist kuni terminaatorini * Mis toimub: üks DNA biheeliks keeratakse järkjärgult lahti ning sünteesitakse ühe ahela teatava lõiguga komplementaarne RNA molekul. * Mis tekib: mRNA, rRNA, tRNA molekulid 4.DNA molekuli järgi RNA molekuli moodustamine. G>C / T>A / A>U / C>G 5.Translatsioon e. valgu süntees * toimub ribosoomis * lähteained mRNA, aminohapped, tRNAd, mis viivad aminohapped ribosoomi * Mis toimub: tRNA toob kohale sobiva aminohappe
E. coli trüptofaani (Trp) operon on kõige enam uuritud repressor operon Trp operon kirjeldas esmalt Charles Yanofsky et al.: Trp operon on ~7kb ja toodab 5 geeni produkti, mis vajalikud trüptofaani sünteesiks trpAE. Promootor ja operaator on üleval pool struktuursetest geenidest Juhtpiirkond (trpL) on trp AE kodeerivate ja operaatori vahel trpL sees on attenueeriv piirkond (att). TrpR (repressorvalgu geen) on promootorist eespool E. coli Trp operon'i skeem trp operoni regulatsioon: Kaks mehhanismi: 1. Repressor/operaator interaktsioon 2. Initseeritud transkripti terminatsioon 1. Repressor/operaator interaktsioon Kui trüptofaan olemas, siis see ühineb trpR geeni produktiga trpR valk ühineb trp operaatoriga ja takistab tarnskriptsiooni Repressioon vähendab trp operoni aktiivsust ~70x 2. Initseeritud transkriptiga termineerimine Transkriptsiooni kontrollib nn
Promootor- DNA järjestus, millele RNA polümeraas seondub. Selle abil saab reguleerida geeni ekspressiooni. Konstitutiivne promootor- ekspressioon toimub kogu aeg igas taime osas. Valikuline promootor- ekspressioon toimub teatud taime arengu faasis ja teatud taime kudedes. Sõltub välistest teguritest. Enhanser järjestus- DNA järjestus, millele regulaatorvalgud saavad seonduda, et omakorda reguleerida RNA polümeraasi tegevust ja seeläbi transkriptsiooni. Asub promootorist eespool või tagapool. Transkriptsiooni valgud- Spetsiaalsed regulaatorvalgud, mis määravad ära millist geeni ja millal aktiveerida. Neil on DNA-ga seonduv osa (domeen), mis võimaldab neil DNA järjestusega (enhanser, promootori elemendid) seonduda. Transkriptsioon toimub tuumas. Transkriptsioon faasid: 1. Initsiatsioon e. algus (initiation)- Nukleotiidi molekule lisatakse ükshaaval kuni 9 aluspaari on lisatud ja siis saab alata elongatsioon (RNA polümeraas saab liikuda). 2
Operoni kuuluvad geenid transkribeeritakse koos ühtse mRNA ahelana ning transleeritakse sellisena ka tsütoplasmas. Geenide operoni paigutumise eesmärk on vastavalt vajadusele kas nende koos avaldumine või kõigi nende ekspressiooni täielik üheaegne mahasurumine. 7.2 Kirjeldage lühidalt laktoosi operoni toimimist. Lac operon kodeerib laktoosi metabolismi geene. Koosneb promootorist, operaatorist ja terminaatoris. Lac operooni geenid: lacZ kodeerib B-galaksidaasi, mis lõhustab laktoosi glükoosiks ja galaktoosiks; lacY ja lacA. Üleval: Kui keskkonnas ei esine laktoosi (mis inhibeeriks repressorit), repressor seondub operaatoriga
Kõige tavalisemad GTF-id on TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF 1. Nad aitavad paigutada eukarüootide RNA polümeraasi täpselt promootorile. 2. Nad aitavad DNA ahelaid teineteisest lahti tõmmata, selleks et transkriptsioon saaks alata. 3. Nad aitavad vabastada RNA polümeraasi promootori küljest, selleks et viia transkriptsioon n.ö. pikendamise (ingl.k. elongation) etappi. * Mis on TBP funktsioon initisiatsiooni kompleksi tekkes? TBP on DNA ahela neljanukleotiidine järjestus Promootorist 25 nukleotiidi eespool Eukarüootse RNAP II-st sõltuv promootor sisaldab tavaliselt TATA-elementi, mille nukleotiidseks järjestuseks on TATAAA. Selle järjestuse tunneb ära TBP (TATA- binding protein). 11. Pre-mRNA põhilised modifitseerimise protsessid. Alternatiivne RNA splaissimine pre-mRNA võib saada splaissitud mitmetest erinevatest ühenduskohtadest, nii et tekivad erinevad küpsed mRNA-d, millel on erinevad eksonite kombinatsioonid
Kui kahe seondumissaidi vaheline kaugus ei ole täispöördeline, ei pruugi valkudel transkriptsiooni aktivatsioonile efekti olla. Aktiveeritavatel promootoritel on -35 heksameer konsensusjärjestusest TTGACA märkimisväärselt erinev ja sel juhul soodustab aktivaator polümeraasi seondumist promootorile. Sama aktivaator võib erinevate promootorite transkriptsiooni aktivatsioonil toimida erinevalt. Aktivatsiooni mehhanism sõltub sellest, kui kaugele regulaator promootorist seondub. CRP (cAMP Receptor Protein), tuntakse ka nimetuse all CAP (Catabolite Gene Activator Protein), on dimeerne valk, mis koosneb 2-st identsest 22,5 kDa suurusest subühikust (209 aminohapet). Ta on aktiivne ainult cAMP juuresolekul. CRP dimeer seondub 22 bp pikkusele palindroomsele järjestusele, mõlemale poolsaidile üks subühik. Erinevate promootorite puhul seondub CRP promootorist erinevale kaugusele: 1) lac promootor seondumine regiooni -72 kuni -52
TATA box - TATA järjestus, paljude eukarüootsete geenide promootoralas olev konsensusjärjestus, mis seob üldist transkriptsioonifaktorit ja määrab seega ära transkriptsiooni alguskoha. 15. ,,Enhancer" ehk võimendav järjestus, mis stimuleerib transkriptsiooni ja mida vajatakse geeni maksimaalseks transkriptsiooniks. Paljude eukarüootsete promootorite aktiivsust mõjutavad need oluliselt järjestused, mis asuvad nende geenide proksimaalsest promootorist tuhandete aluspaaride kaugusel. Nende piirkondade asukoht struktuurgeeni suhtes pole tähtis ja nende funktsioon ei sõltu nende orientatsioonist geeni suhtes. Üldiselt asuvad promootori ees, pikkuseks on 50-150 np, mis omakorda koosnevad väiksematest alaosadest 18-20 np. Neid esineb sagedamini kui vaigistavaid piirkondi. Omadused: orienteeritud DNA molekulil igas suunas (5'-3' või vastupidi); seostub ühe või mitu regulatoorste valkudega;
koopias: H2A, H2B, H3 ja H4. Kõrvutiolevad nukleosoomid on ühendatud vaba DNA lõiguga, mida nimetatakse linker-DNA-ks (selle pikkus on 10–80 aluspaari, olenevalt liigist ja koetüübist). [12] Nukleosoome on võimalik elektronmikroskoobiga näha interfaasi ajal. 15. Operoni struktuur operon (ingl. Operon)- Grupp geene, mis moodustavad ühtse regulatoorse või kontrollüksuse. Üksus koosneb operaatorist, promootorist ja struktuurgeenidest. Omased prokarüootidele. Operoni üldine struktuur: Promootor – nukleotiidne järjestus, mis võimaldab geenide transkriptsiooni. Promootori tunneb ära RNA polümeraas, mis seejärel alustab transkriptsiooni. RNA sünteesi puhul näitavad promootorid, milliseid geene peaks kasutama mRNA sünteesiks, kontrollides seeläbi, milliseid valke rakk toodab.
madalam, siis milline on sobiv temperatuur antud PCR reaktsiooniks? T7 ja T3 praimerite sulamistemperatuurid on : ( 8*4+12*2)=56 oC. Kui "annealing" või hübridisatsiooni temperatuur peab praimeri sulamistemperatuurist olema ~5 oC madalam, siis sobiv temperatuur antud PCR reaktsiooniks on 56-5=51 oC. 4.2) Millise osa PCR produktist moodustab plasmiidi järjestus? Tee see kindlaks kasutades pBS KS+ plasmiidi kaarti (eelnevalt antud), nn. "multiple cloning site" järjestust kasutades. T7 promootorist SAC2 ni ja SAC2-st T3 promootorini. 4.3) Arvuta Wallace reegli abil praimerite X: 5'-AAGATGCCATGAAGATGCCA-3' ja Y: 5'- TGGCATCTTCATGGCATCTT-3' sulamistemperatuurid. Milline näeb välja PCR profiil, kui nende praimeritega amplifitseerida 250 bp pikkust fragmeti. Arvesse tuleb võtta, et Taq polümeraasi kiirus on ligikaudu 1000 nt/min. Praimerite X ja Y sulamistemperatuurid on : (9*4+2*11) =58 oC. 4.4) Kui 100 l PCR mastermix kohta panna 8 l 25 mM MgCl2, 10 l 2 mM dNTP ja 5 l mõlemat
DNA sidumissait on igasugune regioon DNA'l, kuhu teised molekulid võivad seonduda. Ka TATA-box on sidumissait, mis on alati promootor-regioonis ja on sidumissaidiks RNAPolII'le. 15. Defineeri enhancer ja loetle enhanceri omadused. Missuguseid analüüsimeetodeid kasutatakse enhanceralade tuvastamiseks? Enhancer on lühike DNA lõik, kuhu saavad seonduda valgud, et võimendada geenide transkriptsiooni taset geeniklastris. Asetsevad nad geenide proksimaalsest promootorist tuhandete aluspaaride kaugusel, võivad asuda intronites või isegi viimasest eksonist veel allavoolu. Enhancerid on eukarüootidele väga iseloomulikud, samas prokarüootides peaaegu puuduvad. Nad võivad käituda regulaatoritena ka ümberkeeratult (inverted) ja on tihti rakutüüp-spetsiifilised, omades aktiivsust vaid teatud rakutüüpides. Enhanceralade tuvastamiseks kasutatakse ilmselt samasuguseid analüüsimeetodeid nagu teiste valku siduvate saitide uurimiseks
Enamikul neist geenidest on ca 100bp kaugusel start-saidist 20-50bp pikkune GC-jada. Proksimaalne promootor. Regulaatorelemendid, mis asuvad 100-200bp start-saidist, moodustavad koos TATAboxi või initsiaatoriga promootori proksimaalsete elementide kogumi ehk proksimaalse promootori. Distaalne promootor. Kaugemal asuvad elemendid moodustavad koos TATAboxi või initsiaatoriga distaalse promootori. 6. Defineeri enhancer ja loetle enhanceri omadused. Enhancer on promootorist kaugelasuv transkriptsiooni regulaatorala. Tavaliselt 100-200bp pikad, sisaldavad hulgaliselt 8-20bp regulaatorelemente. Need võivad asuda 200bp kuni kümnete kbp kaugusel promootorist üles- või allavoolu, asuda nii intronis kui geeni viimasest eksonist veel allavoolu, on tihti rakutüüp-spetsiifilised, omades aktiivsust vaid kindlates rakutüüpides. Missuguseid analüüsimeetodeid kasutatakse enhanceralade tuvastamiseks? Linker-skaneerivat mutatsioon- ja 5'-deletsioonanalüüsi. 7
Alles induktori seostumine repressoriga inaktiveerib viimase ja võimaldab ekspressiooni. • regulatsioon toimib läbi paljude cis-acting elementide ja trans-acting faktorite vaheliste seoste. • mitte-kovalentsed 35. Lac ja Trp operonid, nende reguleerimise sarnasused ja erinevused Lac operon oli esimesena avastatud operon, selle põhjal saab kirjeldada tüüpilise operoni funktsioone. See koosneb kolmest järjestikusest struktuurgeenist, promootorist, terminaatorist ja operaatorist. lac operoni reguleeritakse mitmete faktoritega, seal hulgas glükoosi ja laktoosi esinemisest keskkonnas. See on näide derepressioonist ehk negatiivselt indutseeritava operoni mudelis Trp-operon - trp operon on konstitutiivne, ekspresseerub pidevalt. - trp operon kodeerib Trp (aminohape trüptofaan) sünteesiraja 5 ensüümi - trp repressor avaldub, kuid ei seostu ise operaatoriga.
Operoni promootorilt lähtuvalt sünteesitakse üks mRNA, mis on seega polütsüstroonne. (Tsüstron on ühte valku kodeeriv osa DNA-st). Polütsüstroonne mRNA sisaldab infot mitme erineva valgu sünteesiks. Translatsioon selliselt mRNA-lt algab erinevatest kohtadest ja annab erinevad valgud. Mutatsioon operonis võib põhjustada kõikide kodeeritud valkude defektsust või puudumist. Transkriptsiooni regulatsioon toimub regulaatorvalkude vahendusel. Repressorid seostuvad DNA lõiguga promootorist DNA 3' otsa poole mida nim operaatoriks ja RNA polümeraas ei saa sünteesida mRNA-d (negatiivne kontroll). Aktivaatorvalkude seostumine DNA-ga tagab RNA polümeraasi seostumise promootoriga ja transkriptsiooni algamise. Aktivaatorid võivad seostuda DNA piirkonnaga, mis paikneb vahetult geeni kodeeriva osa kõrval 5' otsa pool, aga samuti kodeerivast osast kaugemal 5' otsa pool ja soodustada transkriptsiooni algamist (positiivne kontroll).
- Viiruse dsDNAlt sünteesitakse viiruse ssRNA mis liigub peremeesraku tsütoplasmasse kus teda transleeritakse ja kasutatakse uute viirusoskaeste assambleerimisel - Viirusosakesed väljutatakse rakust ja kaetakse rakumembraaniga 54.Operoni struktuurkomponendid - Operon – grupp geene mis moodustuvad ühtse regulatoorse või kontrollüksuse. Üksus koosneb operaatiorist, promootorist ja struktuurgeenidest. Omased prokarüootidele Struktuurkomponendid - Promootori 2 osa - Promootor ja operaator kattuvad osaliselt - Operaatorijärgsed piirkonnad - Terminaatorjärjestused 55.Positiivne geneetiline kontroll 1) Promootori tasemel (ees) - Süsteemi algolek suletud - Regulaatorgeen aktivaatori 2) Pidrudatud süsteemid
alternatiivseid sigma faktoreid, nagu S, H , F. Nendel sigma faktoritel on peale aminohappelise järjestuse suhteliselt sarnane ka DNA järjestus, mida nad ära tunnevad. Tavaliselt on bakterites 1 või 2 sigma faktorit, mis on sigma70 perekonnast erinevad. E. coli's on selleks N, mis on vajalik N-metabolismi geenide ekspressiooniks. Erinevalt sigmaD-tüüpi sigma faktoritest vajab sigmaN transkriptsiooni initsieerimiseks alati aktivaatoreid, mis võivad seonduda DNA-ga promootorist ebatüüpiliselt kaugel. Eraldi alternatiivsete sigma faktorite rühma moodustavad sigmaD superperekonda kuuluvad ekstratsütoplasmaatilise funktsiooniga sigma faktorite alamperekond ECF (inglise keeles extracytoplasmic function). Need alternatiivsed sigma faktorid reguleerivad raku ümbrisega seotud funktsioone, nagu sekretsioon, ekstratsellulaarsete faktorite süntees, toitainete omastamine ja transport. Pseudomona areuginosa's on leitud 19 ECF sigma faktorit, Bacillus
2) muutuva tasemega (induktsioon ja repressioon) mõnede geenide ekspressiooni tase muutub vastavalt vajadusele: vastavalt välistele signaalidele või raku enda arengulisele programmile. Regulatoorsed elemendid geeni ekspressiooni reguleeritakse mitmel eri tasandil. Transkriptsiooni initsiatsioon on üks tähtsamaid Transkriptsiooni reguleerivad: Kindlad DNA järjestused-prokarüootidel : operon koosneb struktuurigeenidest, promootorist (DNA järjestus, millele RNA polümeraasseostub ja initsieerib transkriptsiooni), operaatorist (DNA järjestus, millele seostub repressorvalk, et kõrvalpaiknevate struktuurgeenide transkriptsiooni inhibeerida) ja muudest regulatoorsetest järjestustest. DNA järjestusi, mis mõjutavad oma läheduses asuvategeenide ekspressiooni nimetatakse cis-acting elementideks. Regulatoorsed valgud- prokarüootidel : sigma-abifaktor( soodustab RNA
ning seejärel TFIIA ja TFIIB. TATA järjestus asub transkriptsiooni alguskohast umbes 30 nukleotiidi eemal. Sageli on TATA-järjestusest 5’-suunas CAAT ja GC järjestused. Peale RNA polümeraasi seondumist kompleksiga vabanevad üldised transkriptsioonifaktorid ja RNA polümeraas fosforüleeritakse ning algab RNA süntees. Lisaks sellele seonduvad promootoriga ka regulaatorvalgud, mille DNA järjestused paiknevad promootorist veel kaugemal. Viimasena seonduvad tekkinud valkude komplektiga enhancer valgud, mis omakorda seonduvad DNA järjestusega tuhandeid nukleotiide eemal promootorist. (DNA keerab ennast ümber promootoril paikneva valgukompleksi). Enhancer e võimendaja – väike DNA piirkond, mis peale transkriptsiooni faktoritega seostumist stimuleerib transkriptsiooni põhiliste geenipromootorite pealt. Enhaanser peab tulema promootori juurde. DNA-järjestus, mis võimendab transkriptsiooni ühel või mõnel
siseneda 😉 42. Transkriptsiooni alustamine RNA polümeraas II toimel eukarüoodi rakus: Millised faktoreid on kirjeldatud eukarüootses transkriptsiooni initsiatsiooni kompleksis. TATA kast – DNA ahela neljanukleotiidne järjestus. Promootorist 25 nukleotiidi kaugusel. Sinna seondub TBP (TFIID’i alaühik) Transkriptsiooni alustamiseks vajab RNA polümeraas mitmeid transkriptsiooni faktoreid: FFIIA, TFIIB, TFIID (TBP), TFIIH (CTD) A) TFIID (TBP kaudu) seostub TATA-le B) See võimaldab seostuda TFIIB-l C) Tulemuseks kogu transkriptsiooni faktorite hunnik ja RNA polümeraas ise ka seostuvad promootorpiirkonnale.
startsaidi ees) nt ― -35 ― - 10 Transkribeeritakse ainult ühte ahelat. See, mida transkribeeritakse, on matriitsahel (DNA) ja see, mida mitte, on kodeeriv ahel Matriitsahel: 3’ ←5’, sinna peale tehakse 5’ ― 3’ RNA operaator – geeni aktiivsust reguleeriv järjestus, millele saabub regulatsioonifaktor. cis-järjestus – (promootor, operaator, enhancer) 46 UAS – (upstream activating sequence) promootorist eespool asuv järjestus, mis aktiveerib spetsiifiliselt geene. Paljudel geenidel, mille ekspressioonitase väga palju muutub. Muutub 1000 x või enam. silencer – järjestus, mis surub geenide aktiivsust maha trans-faktorid – enamasti valgud, mõnel juhul RNA. repressor, aktivaator, terminaator. ensümaatiline terminaator – sigma-sõltuv terminaator (tagasihoidlik juuksenõel + sigmafaktor). Transkriptsioon võib väga tihti jääda pooleli (erinevalt translatsioonist). Tavaliselt
annaabi.ee 
