DNA replikatsioon 1. Alternatiivsed mudelid 2. Poolkonservatiivne: MeselsonStahli katsed 3. DNA süntees ja elongatsioon 4. DNA polümeraasid 5. Replikatsiooni algus ja initsiatsioon 6. Prokarüootne/eukarüootne mudel (tsirkulaarne/lineaarne kromosoom) 7. Telomeeride replikatsioon Replikatsiooni alternatiivsed mudelid Ultratsentrifuugimine gradiendis 1958: Matthew Meselson ja Frank Stahli katse, milles näidati, et repliktsioon on poolkonservatiivne 1955: Arthur Kornberg Töötas E. coli'ga. Avastas DNA sünteesi mehhanismi in vitro Vajalik neli komponenti: 1. dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP (deoxyribonukleosiid 5'trifosfosfaadid) (suhkuralus + 3 fosfaati) 2. DNA matriits 3. DNA polümeraas I (Kornbergi ensüüm) (DNA polymeraas II ja III avastati veidi hiljem) 4. Mg 2+ (optimeerib polümeraasi aktiivsuse) 1959: Arthur Kornberg (Stanford University) ja Severo Ochoa (NYU) DNA süntees: 1
Sünteesi käigus lisatakse desoksüribonukleosiid trifosfaate, lühendatult dATP, dGTP, dCTP ja dTTP. Lisamise käigus lõigatakse ära 2 fosforhappe jääki ja DNA ahelasse liitub desoksüribonukleosiid monofosfaat, lühendatult dAMP, dGMP, dCTP ja dTMP. Süntees on 5’-˃3’ suunaline. Replikatsiooni käigus lisatakse üks nukleotiid korraga. Uue nukleotiidi suhkrujäägi 5’ otsa liidetakse eelmise nukleotiidi 3’ otsaga fosfaatjäägi kaudu. DNA replikatsioon on poolkonservatiivne Poolkonservatiivne- tähendab, et replikatsiooni käigus sünteesitakse (kopeeritakse) mõlema vanemahela pealt uus komplementaarne tütarahel. DNA replikatsiooniks on vaja DNA ahelad teineteisest lahutada: Kaheahelalise DNA lahtikeerdumine ja replikatsioon toimuvad samaaegselt. Kaksikahela lahtikeerdumisel tekib torsionaalne pingestumine. Lahtikeerdumise eest vastutavad helikaas valgud. Torsioonjõudude leevendamiseks on vaja DNA ahelal katkete tekitamine- seda teevad topoisomeraas valgud.
biosüstemaatikast või ökonisist lähtuvalt). Elu põhineb elusorganismidel. Väljaspool organisme esinevad elu nähtused vaid ajutiselt ja passiivselt. ELUSORGANISMIDE peamised tunnused: 1. Paljunemine: õnnetused 2. Arenemine: ammendumine 3. Aine- ja energiavahetus. Organismid on avatud süsteemid seotud enda keskkonnaga. Reageerivad välisele. 4. Rakuline ehitus. 5. Homeostaas sisekeskkonna säilumine ELU omadused veel: 6. Pidev, aga poolkonservatiivne: DNA Watson, Crick 1953. 7. Iga organiseerumise tase lisab oma võimalused (rakk pole "organellide kott"). Tervikut pole võimalik seletada ainult lihtsa elementide seletamiste summana tervikul lisanduvad uued funktsioonid. 8. Struktuur ja ülesanded on seotud kõigil tasemetel. (Nt. looma, seene ja taime ehituse suurimad erinevused on määratud nende esmaste funktsioonidega) 9. Evolutsioon on elu püsimise tuum Darwin 1859
Ensüümid on efektiivsed, spetsiifilised hästi reguleeritavad katalüsaatorid. Reguleerida saab rakus ensüümide aktiivsust ja nende hulka · aktiivsuse regulatsioon allosteerilised ensüümid, · ensüümide hulkade regulatsioon geenide aktiivsuse regulatsioon (klassika operoni mudel) Molekulaarbioloogia tsentraalne dogma bioloogilise informatsiooni "voolu" suund on DNA RNA valk DNA replikatsioon on "poolkonservatiivne" tütar-DNAd saavad kumbki ühe vanadest ahelatest väga tähtis fakt DNA replikatsioonimehhanismi mõistmiseks. DNA replikatsiooni kiirus on konstantne, ei sõltu rakkude kasvutingimustest ja on 800- 1000 aluspaari (bp base pairs) sekundis. Prokarüootsete rakkude DNA replikatsiooni alustab üks DNA polümeraas ja ta viib replikatsiooni ka lõpule (vt. järgmine slaid), mis tähendab, et näiteks E. coli puhul võtab DNA replikatsioonitsükkel aega 40 minutit ja seda lühendada ei saa
Ensüümid on efektiivsed, spetsiifilised hästi reguleeritavad katalüsaatorid. Reguleerida saab rakus ensüümide aktiivsust ja nende hulka · aktiivsuse regulatsioon allosteerilised ensüümid, · ensüümide hulkade regulatsioon geenide aktiivsuse regulatsioon (klassika operoni mudel) Molekulaarbioloogia tsentraalne dogma bioloogilise informatsiooni "voolu" suund on DNA RNA valk DNA replikatsioon on "poolkonservatiivne" tütar-DNAd saavad kumbki ühe vanadest ahelatest väga tähtis fakt DNA replikatsioonimehhanismi mõistmiseks. DNA replikatsiooni kiirus on konstantne, ei sõltu rakkude kasvutingimustest ja on 800- 1000 aluspaari (bp base pairs) sekundis. Prokarüootsete rakkude DNA replikatsiooni alustab üks DNA polümeraas ja ta viib replikatsiooni ka lõpule (vt. järgmine slaid), mis tähendab, et näiteks E. coli puhul võtab DNA replikatsioonitsükkel aega 40 minutit ja seda lühendada ei saa
ajutiselt ja passiivselt. ELUSORGANISMIDE peamised tunnused: 1. Paljunemine: õnnetused 2. Arenemine: ammendumine 3. Aine- ja energiavahetus. Organismid on poolavatud süsteemid seotud enda keskkonnaga. Reageerivad välisele. 4. Rakuline ehitus. R Hooke 1665. Leeuwenhoek. Schleiden ja Schwann: rakuteooria. Viimased 40 a: elektronmikroskoopia peened sisestruktuurid. 5. Homeostaas sisekeskkonna säilumine ELU omadused veel: 6. Pidev, aga poolkonservatiivne: DNA Watson, Crick 1953. 7. Iga organiseerumise tase lisab oma võimalused (rakk pole "organellide kott"). Tervikut pole võimalik seletada ainult lihtsa elementide seletamiste summana tervikul lisanduvad uued funktsioonid. 8. Struktuur ja ülesanded on seotud kõigil tasemetel. 9. Evolutsioon on elu püsimise tuum Darwin 1859 (piiratud ressursid!). Geenivariatsioonid, pärilikkus, põlvkondade vaheldumine, looduslik valik. 10
teavet. Koostoimel silutakse võimalikud keskkonna hävitavad kõikumised. Kompekssuse tõttu võimalik kasutada samaaegselt erinevaid klassifikatsioone. 2. Elu organiseerumise tasemed - Elutud: Aatom, (mikro)molekul, üsna elusad: makromolekul, organell, elusad: rakk, kude, organism, populatsioon, kooslus, biosfäär. 3. Elus ja eluta loodus Elu tunnused: paljunemine, arenemine, aine- ja energiavahetus, rakuline ehitus, homeostaas ehk sisekeskkonna säilumine. Elu on pidev, aga poolkonservatiivne. Iga organiseerumise tase lisab oma võimalused. Struktuur ja ülesanded on seotud kõigil tasemetel. Evolutsioon on elu püsimise tuum. Geenivariatsioonid, pärilikkus, põlvkondade vaheldumine, looduslik valik. Seaduspärasuses annavad erandid suure osa elu mitmekesisusest. Elu põhineb elusorganismidel. Väljaspool organisme esinevad elu nähtused vaid ajutiselt ja passiivselt B. Elu organiseerumine. 4. Elule vajalikud lihtsamad molekulid 5. Elu makromolekulid. 6. Raku ehitus. 7
ammooniumiks, et seda saaks kasutada rakkude "ehitusmaterjalina". b) atmosfääri N omastama ja millisesse vormi lämmastiku viivad? Lämmastiku omastamine on NH3 või NH4+ omastamine organismide poolt ja seejärel selle sidumine biomassi. Taimed on võimelised nitraat-või ammooniumioone absorbeerima oma juurte kaudu. Esmalt absorbeeritakse nitraati, redutseeritakse see nitritiks ning seejärel ammoniumioonideks. Millises vormis olevat N omastavad loomad? 18.DNA replikatsioon a) poolkonservatiivne - DNA replikatsioon on semikonservatiivne. DNA replikatsiooni tulemusena tekivad uued DNA dupleksmolekulid, mille üks ahel pärineb lähtemolekulist ja teine on täiesti uus.DNA replikatsioon on kahesuunaline, mis sisaldab kahte replikatsioonikahvlit, mis liiguvad vastassuunas. Replikatsiionikahvel DNA jookseb läbi raku substruktuuridele immobiliseeritud replikatsioonimasina. b) poolkatkendlik - DNA replikatsioon on poolkatkendlik. Juhtiv ahel kopeerub
Eeldused: 1) üksikahelaline DNA kogu molekuli ulatuses 2) on vaja piisavalt kõiki nukleotiide, mis kuuluvad DNA koostisesse 3) on vaja ensüüme (põhiensüümiks DNA polümeraas) 4) on vaja energiat (selleks on ATP) 5) on vaja valgulisi faktoreid protsessi teostamiseks Komplementaarsus kahe DNA ahela vahel: Lähteahel A G C T Uus ahel T C G A Olemus: Poolkonservatiivne kopeerimistüüpi reaktsioon. Üks ahel pärineb vanalt molekulilt, teine sünteesitakse Tulemus: 2 identset DNA molekuli. 92 molekuli tekib RNA süntees ehk transkriptsioon: Koht: Eeltuumsetel tsütoplasmas, päristuumsetel tuumas, mitokondrites ja kloroplastidel Aeg: Eesltuumsetel koguaeg, päristuummsetel transkriptsiooni ei toimu replikatsiooni ning meioosi/mitoosi ajal Eeldused: 1) vaja üksikahelalist DNA lõiku 2) vaja kõiki 4 nukleotiidi, mis RNA koostisesse kuuluvad
- kõikide 4 tüüpi nukleotiidide olemasolu, mis kuuluvad DNA koostisesse. - Ensüüme (DNA polümeraas) - Energiat (ATP) - Protsessi juhivad valgulised faktorid. Tulemus : - 2 identset DNA molekuli. 19 Replikatsiooni kulg : 1. DNA replikatsioon algab üheaegselt molekuli mitmes kohas(kiirus) 2. DNA replikatsioon kulgeb naaberahelates vastassuunaliselt 3. DNA replikatsioon on poolkonservatiivne protsess.(üks ahel on pärit lähteahelast. Teine sünteesitakse juurde komplementaarsuse alusel. DNA reparatsioon : - DNA vigade tuvastamine ja parandamine Koht : - eeltuumsetel tsütoplasmas - päristuumsetel tuumas, mitokondrites, kloroplastides. Aeg : - kogu aeg va. Meioos ja mitoos. Reaktsiooni tüüp : - lokaalne kopeerimistüüpi reaktsioon Komplementaarsus : - Sama mis DNA replikatsioonil. Eeldused : - vea teke (ühe ahela tasandil)
- Seetõttu moodustub selgroona = suhkur – fosfaat – suhkur – fosfaat ahel - Ahela üks ots on 5’fosfaat, teine ots aga suhktu 3’OH fosfaat - N-aluste järjestus geenile on unikaalne Kaksikahelaline DNA dupleks - DNA-l 2 nukleotiidiahelat mis koos nõrkade H-sidemetega - Moodustuvad N-aluspaarid - Seetõttu on DNa ahelad komplementaarsed - DNA ahelad antiparalleelsed 10.DNA replikatsioon - DNA replikatsioon on poolkonservatiivne – mõlema vanemahela info põhjal sünteesitakse uus komplementaarne ahel DNA replikatsiooni komponendid Replikatsioonikahvel (DNA ahelad lahus) Moodustub replikatsiooi käigus – replikatsioon toimub bakteri kromosoomis kahesuunaliselt ning moodustub kaks Y-kujulist struktuuri e replikatsioonikahvlit - DNA topoisomeraasid (muudavad DNA spiralisatsiooni - DNA helikaasid – teevad ahela lahti - SSB valgud – kaitsevad üksikahelalist DNAd Ahelate eristamine
2'-OH asendamist hüdriidiga katalüüsib ensüüm ribonukleotiidi reduktaas DNA replikatsioon Uute polünukleotiidahelate süntees, st DNA (ema)molekuliga identsete koopiate (tütarmolekulide) süntees. Baseerub lämmastikaluste komplementaarsuse printsiibile. DNA kaksikheeliks (dsDNA) peab lahti keerduma, et tagada DNA-polümeraasile juurdepääs üheahelalisele (ssDNA) templeit- ehk sabloonahelale. DNA replikatsioon on semi- e. poolkonservatiivne (semiconservative), st tütarmolekulis üks ahel pärineb emamolekulist ("vana"), teine on sünteesitud ("uus") kahesuunaline (bidirectional) - sisaldab kahte replikatsioonikahvlit ehk replikatsiooniharki, mis liiguvad vastassuunas poolkatkendlik (semidiscontinuous) üks ahel (nn juhtiv ahel) kopeerub katkematult, mahajääv ahel kopeerub segmentide kaupa (Okazaki fragmendid), mis seejärel omavahel ühendatakse Replikatsiooni ensüümid:
Uurimist on takistanud raku poolsete biosünteeside foon, sest birnaviiruse infektsioon ei mõjuta oluliselt raku biosünteese ja on samas ka ise tundlik actinomycine D-le. Teadaolevalt ei ole birnaviirste replikatsioon seotud rakutuumaga. Birnaviiruste virionid (erinevalt reoviirustest) ei vaja transkriptsioon aktiveerimiseks kapsiidivalkude proteolüüsi. Nakatatud rakus ei toimu kapsiidi täieliku dissotsieerumist (nagu ka reoviirustel). Transkriptsioon on erinevalt reoviirustest poolkonservatiivne (toimub ahela väljatõrjumisega). Sünteesitakse kaks mRNAd, mis sisaldavad cap struktuuri. Samas on oletatud, et osade (tulevaste genoomsete segmentide?) sünteesil toimub transkriptsiooni praimeerimine VP1- valgu poolt. 2 LIISI KINK
või 3' otsast (5'eksonukleaasid ja 3'eksonukleaasid) Endonukleaasid- atakeerivad ja võtavad ära nukleotiide DNA ahela seest. 94. DNA polümeraas I omadused. Kornbergi polümeraas. 1) sünteesisuund 5'-3' (info loetakse matriitsahelast suunaga 3'-5') 2) 5'-3' eksonukleaasne aktiivsus. On reparatsiooniline polümeraas, kuna selle abil parandatakse ja korrigeeritakse geneetilise info paljundamisel, rekombinatsioonil ja mujal tekkivaid vigu. 95. DNA polümeraas III. Escherichia coli replikaas. Poolkonservatiivne süntees. Holoensüüm (katalüütiline südamik), 3 alaüksust, 900 000 daltonit, sisaldab vähemalt 20 erinevat polüpeptiidi. Tal on 2 beeta subühikute monomeeri, beeta subühikute dimeer moodustab ringi ümber DNA. 96. Okazaki fragment DNA replikatsioonil. I variant. Kuna DNA replikatsioon saab toimuda ainult ühes suunas, 5' ® 3' suunaliselt, replikatsioonikahvlis toimub süntees aga mõlemalt ahelalt korraga, on teine ahel
DNA polünukleotiidisete üksikahelate keemiline polaarsus. DNA kaksikahelas olevate polünukleotiidide vastassuunalisus e. Antiparalleelsus- kaksikahel, üks kulgeb 5´3´ ja teine 3´5´ Nukleotiidide komplementaarsuse printsiip- lämmastikaluste võime omavahel seonduda jamoodustada paar A=T(U), G=C DNA kaksikheeliksi suur ja väike vagu- suur vagu 3,4nm, sisaldab 10 nukleotiidi ning vahemaa lämmastikalsute vahel DNA ahelas on väike vagu DNA replikatsiooni mehhanism. DNA replikatsiooni poolkonservatiivne mudel. DNA replikatsiooni alguspunkt- origin punktid, AT rikkad järjestused replikatsiooni mull- topoisomeraas on kaksikahela lahti keeranud, helikaas lõhub vesiniksidemed ja tekib replikatsiooni mull replikatsiooni kahvel- Replikatsioon toimub alguspunktist lähtuvalt kahes suunas, moodustub kaks Y-kujulist struktuuri. Matriitsahelad- Transkriptsioonil DNA-ahel, mida kopeeritakse komplementaarse RNA- ahela moodustamiseks.
koodon – koosneb kolmest järjestikusest nukleotiidist ribosoom sünteesib AH vahele peptiidsideme (tRNA küljes AH-d). Kasvav peptiidahel on sünteesi käigus kovalentselt seotud tRNA-ga. Geen - pärilikkuse ühik, DNA lõik (nukleotiidsed järjestused, järjekord määrab info), mis kodeerib eralduvat produkti (RNA või valk) - DNA kodeerib iseend, aga pole eralduv produkt – jääb matriitsahelaga seotuks (poolkonservatiivne replikatsioon) - Geenid on kodeeritud ühe ahela poolt, vastasahel kodeerimisel ei osale. NB! Pikema DNA lõigu ulatuses võivad mõlema ahela poolt kodeeritud olla – osa geene paikneb ühel, osa teisel ahelal. - geenid võivad kattuda nii ühel kui ka eri ahelatel. - ühe geeni sees võib asuda teine geen - ei võrdu DNA - võib koosneda ka RNA-st - produktiks on RNA või valk 2
mtDNA genoom on rõngasjas ja sageli superspirliseerunud (mõnedel seentel ja ainuraksetel siiski ka lineaarne). On GC rikas, seepärast tuuma DNAst kerge eraldada tsentrifuugimisel. mtDNAs puuduvad histoonide sarnased valgud. Kuna mitokondreid on rakus palju, siis nende koopiate arv eraldamisel suur ja neid on kerge amplifitseerida PCRiga. mtDNA suurus on väga varieeruv. mtDNA genoomi replikatsioon: Sarnane tuuma DNA replikatsiooniga (poolkonservatiivne) kuid tal on oma spetsiifiline DNA polümeraas. Toimub kogu aeg, mitte ainult S faasis, nagu tuuma DNA. Mittekodeeriv kontrollpiirkond moodustab lingu, mis funktsioneerib kui replikatsiooni piirkond. Mitokondriad kui organellid paljunevad, mitte ei moodustu de novo. mtDNA genoom: mtDNA geenid on tRNA, rRNA ja tsütokroom oksüdaasid, NADH-dehüdrogenaas, & ATPaasid . Mitokondriaalne geneetiline info ka tuumas: DNA polümeraas, replikatsiooni faktorid; RNA
Reaktsioonitüüp : - kodeerimistüüpi Komplementaarsus : A-T G-C T-A C-G Eeldused : - üksikahelaline DNA infokandjana - kõikide 4 tüüpi nukleotiidide olemasolu, mis kuuluvad DNA koostisesse. - Ensüüme (DNA polümeraas) - Energiat (ATP) - Protsessi juhivad valgulised faktorid. Tulemus : - 2 identset DNA molekuli. Replikatsiooni kulg : 1. DNA replikatsioon algab üheaegselt molekuli mitmes kohas(kiirus) 2. DNA replikatsioon kulgeb naaberahelates vastassuunaliselt 3. DNA replikatsioon on poolkonservatiivne protsess.(üks ahel on pärit lähteahelast. Teine sünteesitakse juurde komplementaarsuse alusel. DNA reparatsioon : - DNA vigade tuvastamine ja parandamine Koht : - eeltuumsetel tsütoplasmas - päristuumsetel tuumas, mitokondrites, kloroplastides. Aeg : - kogu aeg va. Meioos ja mitoos. Reaktsiooni tüüp : - lokaalne kopeerimistüüpi reaktsioon Komplementaarsus : - Sama mis DNA replikatsioonil. Eeldused : - vea teke (ühe ahela tasandil)
järjestusega DNA molekuli. DNA replikatsioon on kiire protsess: sünteesi käigus lisatakse eukarüoodi rakus 3000 nukleotiidi minutis (bakteris võib ulatuda 30000 nukleotiidini minutis) DNA replikatsioon on ka erakordselt täpne protsess: nii prokarüootide kui eukarüootide replikatsioonil tekkiv viga on umbes 1 nukeotiid 109 nukleotiidi kohta – see teeb 3 nukleotiidi inimese genoomi kohta ühes rakujagunemises. DNA replikatsioon on poolkonservatiivne – see tähendab, et replikatsiooni käigus sünteesitakse (kopeeritakse) mõlema vanemahela pealt uus komplementaarne tütarahel. Sünteesi käigus lisatakse desoksüribonukleosiid trifosfaate, lühendatult dATP, dGTP, dCTP ja dTTP. Lisamise käigus lõigatakse ära 2 fosforhappejääki ja DNA ahelasse liitub desoksüribonukleosiid monofosfaat, lühendatult dAMP, dGMP, dCMP, dTMP. Süntees on alati 5’-3’ suunas
päristuumsetel rakutsükli S mitoosi/meioosi ajal, faasis. kui kromosoomid on transportvormi pakitud Kiirus (sekund) 500 bp/s 40 bp/s 20 ah/s bakteris Olemus Kopeerimistüüpi protsess, Kopeerimistüüpi Kodeerimistüüpi mis on poolkonservatiivne- protsess matriitsreaktsioon moodustunud molekulis on üks ahel lähtemolekulit, teine sünteesitud. Tulemus Kõikide rakus leiduvate Toimub kõikide RNA Sünteesitakse DNA molekulide vormide süntees; lihtvalgud esmases kahekordistumine. transkriptsiooni kultuuris ja järgneb
annaabi.ee 
