Meetodid: * geenide rekombinatsioon plasmiidsete vektoritega * geenide rekombinatsioon viirusvektoritega * DNA, RNA analüüsi meetodid: PCR, sekveneerimine, geel elektroforees Plasmiidid geenide vektorid Looduses kanduvad üle ühest bakterist teise geenide horisontaalne ülekanne Kui võõrad geenid plasmiidi DNA-sse sisestada lähevad üle teise bakterisse koos plasmiidiga Inimese kasvuhormooni geen GH1 (growth hormone) E. coli plasmiidi Kui GH1 muteerunud, ei tooda hüpofüüs kasvuhormooni kasv peatub lapseeas täiskasvanul kääbuskasv Kasvuhormoon: 191 AH valk AH järjestus teada, geeni GH1 nukleotiidne järjestus mitte Kasvuhormooni geeni kloneerimine Plasmiidid paljunevad rakus paljundavad ka inimese geeni Geeni kloneerimine miljonid koopiad geenist Geeni defektiga lapsele süstida kasvuhormooni
Naise tavalisel viisil rasestumist takistab mingi terviserike; mehel esinevad viljakushäired. 13. Mis on kloonimine? Kloonimine on geneetiliselt identsete järglaste saamine. 14. Kui suur on kloonimise edukus? Kloonitud on hiiri, küülikuid, kasse, lambaid, kitsi, sigu, muulasid, veiseid, hobuseid. Kuid pole suudetud teha sama ahvide ja konnadega. 15. Millised probleemid kerkivad kloonimisel esile? 16. Milliseid geenide organismi viimise võimalusi on olemas? Bakteri plasmiidiga, viirustega, kullapüstoliga ja taimedesse Agrobakteriga. 17. Geneetiliselt muundatud organismide poolt ja vastu argumendid. 1. Mudelhiired luuakse, et leida ravimeid inimese haigustele. 2. Hävimisohus olevate liikide säilitamiseks: võetakse hävimisohus looma tüvirakust tuum ja viiakse see lähedase liigi munarakku. Munarakk siirdatakse tagasi looma emakasse. Sünnib hävimisohus liigi esindaja. 1. Kloonimine, selle nimel, et päästa suremisohus olev loom võib olla ohtlik. 2.
Plasmiidi töödeldakse restriktaasiga (see on see aine, mis lõikab DNA-d), mis lõikab plasmiidi kindla koha pealt katki. Plasmiidi lõigatud otsad on üheahelalised ja kleepuvad. b) Võetakse DNA. Seda töödeldakse sama restriktaasiga, mille tagajärjel lõigatakse DNAst üks lõik. Ka selle DNA lõigu otsad on üheahelalised ja kleepuvad. c) DNA lõik ja plasmiidi pannakse kokku. Kuna mõlemad on lõigatud sama järjestuse kohalt, siis DNA lõik lõimub plasmiidiga. d) Lõimumiskohta töödeldakse ligaasiga. See on aine, mis tekitab endiste lahtilõigatud otste vahele kovalentsed sidemed, nii et need jäävad tugevasti kokku. Geenivektor ongi valmis. 7.On keerukas ja kulukas, sest toimiva transgeense looma saamine oleneb paljuski õnnest. Ühe korraliku geneetiliselt muundatud looma saamiseks tuleb teha 100-200 kordust. Ühest küljest on nende loomine hea ja vajalik, sest transgeensete loomade abil uuritakse inimeste
geene, saadakse GMO 9. Millised on levinumad geenitehnoloogia võtted(transgeensed organismid) Nokautorganism-organism kellel on teatud geen maha surutud. Restiktaaside abil- need on ensüümid mida toodavad bakterid enesekaitseks, need lõikavad dna lõikudeks, nii et tekivad kleepuvad otsad. Selliste otstega dna'd on võimalik liita ja saadakse rekombinatne dna. Geene saab kohale viia bakteri plasmiidiga, viirustega, kullapüstoliga ja taimedele agrobakteriga. 10. GM plussid Geenimutatsiooniga bakterid toodavad inimestele vajalike valke, suurem taimede saagikus, uued ravimid 11. GM miinused Võib olla keskkonnakahjulik, võib inimorganismile kahjulik olla(allergeenid), väheneb looduslik mitmekesisus, varane raukumine, juuste väljalangemine, XY-kromosoome kandev loode ei arene poisiks. 12. Mis on geeniteraapia
aasta. BAKTERITEL ei ole tuuma; seda asendab tumapirkond, milles paikenb üks rõngasjas kromosoom. Lisaks leidub bakterirakus väiksemaid DNA rõngaid- plasmiide, mida kasutatase geenivektorite loomisel. Rakendusbioloogilises suunas hakati otsima võimalusi kasutada transgeenseid baktereid meditsiiniliselt oluliste inimese valkude tootmiseks. Inimese rakkudest eraldatakse huvipakkuva geeni mRNA ja pöördtranskribteeritakse selle järgi vastav komplementaarne DNA(cDNA). See ühendatatkse plasmiidiga ning saadud geenivektor lülitub bakteriraku koosseisu(peamiseks bakteriks on inimese soolekepike). Sel viisil loodud transgeenne bakter toodab peale end avalkude ka soovitavat inimesevalku. Esimene inimese valku sünteesiv bakteritüvi saadi 1978. a Seleks valguks oli hormoon isnuliin, mille USA Toidu- ja Ravimiamet lubas ravimina kasutusele võtta 1982. a. Insenergeneetiliselt muundatud bakteritüvsid kasutatakse ka tööstuse vajalike esnüümide saamiseks. Nt juustutööstused laapensüümi
30 aastaks vedelasse lämmastikku hoiule. 6. TRANSGEENSED ORGANISMID 1. I tüüpi GMO – geneetiliselt muundatud organism (neisse on sisestatud võõrorganismi geene; nende geenide poolt avalduvad tunnused päranduvad ka järglastele edasi) 2. II tüüpi GMO – surutakse geene maha mingi mutatsiooni abil (Geeninokaut) Kuidas geenid kohale viia? * Bakteri plasmiidiga nimetatakse teda geenivektoriks. * Viirustega * Kullapüstoliga (pipeti otsas element Kui neile on soovitud geen lisatud, kuld koos geeniga) * Taimesesse Agrobakteritega Selleks, et aru saada, kas sobiv geen on jõudnud organismi lisatakse sobivale geenile organismis helduv markergeen. 7. TRANSGEENSED LOOMAD
komplementaarsed üheahelalised(nn kleepuvad) otsad - kui need fragmendid lahuses kokku viia, siis otste paardumisel nad ühinevad - lõigatakse katki kahte moodi: 1. tekivad kleepuvad otsad-DNA ahelale jäävad ühe ahelalised otsad Kahe erineva DNA kokkupanemine toimub kleepuvate otste abil, ahelate seostumiseks läheb vaja ligaasi 2. tekivad tömbid otsad Geenide kohale viimine: 1. bakteri plasmiidiga 2. viirustega 3. Kui neile on soovitud geen lisatud nim teda geenivektoriks 4. kulla-või volframipüstoliga 5. taimedesseagrobakteriga 6. Kuidas aru saada,et tegu on geeni ülekandmisega ? - pannakse külge markergeen(helenduv), mida on võimalik UV kiirguses jälgida - kui enne stoppkoodonit on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFP valk on valmis 7. Kasutatakse kasvarakkude uurimiseks 8
Restriktaas, ligaas, „kleepuvad otsad“. Osata koostada skeemi. Restriktaasid on ensüümid, need lõikavad DNA kindla koha pealt lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad – “kleepuvad otsad”. Selliste otstega DNA juppe on mugavalt liita. DNA ühendamiseks piki suunas kasutatakse ensüüme nimega ligaas. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Geenid viiakse õigesse kohta kohale bakteri plasmiidiga või viirustega (geenivektoritega) või süstitakse otse viljastatud munarakku. 8. Genoomipank, pöördtranskriptaas, retroviirus. Õp lk 37 – 39. Genoomipank on bakterikloonides säilitatav inimese genoomi DNA- fragmentide kogum. nagu geenivektor, ainult peale ahelate ühinemist ligaasi toimel võtavad bakterid endasse plasmiide. Tekivad väikesed kolooniad, kolooniad eraldatakse kultuuriklaasidesse ja viiakse hoidlasse, mis moodustab DNA-panga.
Plasmiidi töödeldakse restriktaasiga (see on see aine, mis lõikab DNA-d), mis lõikab plasmiidi kindla koha pealt katki. Plasmiidi lõigatud otsad on üheahelalised ja kleepuvad. b) Võetakse DNA. Seda töödeldakse sama restriktaasiga, mille tagajärjel lõigatakse DNAst üks lõik. Ka selle DNA lõigu otsad on üheahelalised ja kleepuvad. c) DNA lõik ja plasmiidi pannakse kokku. Kuna mõlemad on lõigatud sama järjestuse kohalt, siis DNA lõik lõimub plasmiidiga. d) Lõimumiskohta töödeldakse ligaasiga. See on aine, mis tekitab endiste lahtilõigatud otste vahele kovalentsed sidemed, nii et need jäävad tugevasti kokku. Geenivektor ongi valmis. 7.Keeruline: 1. Kuna tuleb mikropipeti abil geenivektor sisestada viljastunud munarakku, seda kahjustamata.2. Pole veel õnnestunud luua geenivektoreid, mis integreeruksid genoomi DNA-sse soovitaval kohal.Nii võivad nad kahjustada olemasolevaid geene. 3. Siiratav geen peab olema varustatud koespetsiifilise
MIINUSED PLUUSID · toiduallergia · suurem saagikus · GM umbrohi · vastupidav kahjuritele · GM kahurid · vastupidavam külmale · Igal org. Oma genoom · meditsiinilised uuringud Kuidas geenid kohale viia? (GMO-de saamine) 1) Bakteri plasmiidiga 2) Viirustega. Kui lisatud soovitud geen, nim. Geenivektoriks. 3) Kullapüstoliga 4) Taimedesse agrobakteriga Viiruse DNA-le lisatakse geen, mille ta rakku viib. Sellist kandurviirust nim. Viirusvektoriks. Üle viidavale geenile on markergeen külge pandud see helendab. Näiteid: loomadest, taimedest, bakteritest. Ei leidnud neid kuskilt hetkel. Geeninokaut Geen lülitatakse välja. Geenitehnoloogiliselt rikutud geenivektor. Organite kasvatamiseks GM-loomade baasil
BIOTEHNOLOOGIA KT2 Geenitehnoloogia on biotehnoloogia haru, kus eesmärgi saavutamiseks viiakse gene ühest organismist teise või muudetakse gene muul viisil. Geenitehnoloogia meetodid: - Transgeensete organismide loomine: võõra geeni viimine ühest organismist teise - Mutagenees: kuntslikult soovitud mutatsioonide esilekutsumine - Geeni-nokaut: organismi teatud geeni time surutakse alla Kuidas geenid üle kanda? 1. Bakteri plasmiidiga – plasmiidse vektori abil 2. Viirustega – viirusvektori abil 3. Kullapüstoliga – Au kuulikesele on kinnitatud DNA, see “tulistatakse” rakku 4. Taimedesse Agrobakteriga – taimi kergesti nakatav bakter 5. Homoloogiline rekombinatsioon – Dna molekuli homoloogiliste piirkondade vaheline ristsiire, kus rekominantne DNA asendab olemasoleva Erinevate DNA-de liitmisel same rekombinantse DNA. Kuidas DNA-d lõigata?
Kompetentsus võib olla kas loomulik või kunstlik, saavutatud laboritingimustes. Kompetentsus on vajalik selleks, et transformeerimisel soovitav plasmiid rakkudesse viia. Kompetentsete rakkude saamiseks laboritingimustes töödeldakse rakke kas KCl, CaCl või RbCl-ga, mis muudab rakumembraani DNAd läbilaskvaks. b) Rakkude kompetentsuse hindamiseks tranformeeritakse 100 l rakususpensiooni 10 pg, 100 pg ja 1 ng plasmiidiga (sobib lihtsalt tühi vektor, peaasi et kontsentratsioon on täpne). Kolooniate arvu järgi saav välja arvutada, mitu kolooniat tekib 1µg plasmiidi kohta. Kui 1 ng-ga transformeeritud tass annab 100 kolooniat, siis 1µg annab 100 000 (mis on suhteliselt viletsad). Head kompetendid on näiteks 10 8, see tähendab, et 1ng- ga transformeeritud tass annab 100 000 kolooniat, mida on ilmselgelt ülelugemiseks
meditsiiniliselt oluliste inimese valkude tootmiseks. Raskusi valmistas asjaolu, et eukarüootse organismi geene ei suuda bakterid algsel kujul transleerida geenistruktuuri erinevuse tõttu- geenides on mittekodeerivad lõigud, mida bakterid ei ''oska'' välja lõigata. Siin tuleb appi ensüüm pöördtranskriptaas. Inimese rakkudest eraldatakse huvipakkuva geeni mRNA ja pöördtranskribeeritakse selle järgi vastav komplementaarne DNA. See ühendatakse plasmiidiga ning saadud geenivektor lülitub bakteriraku koosseisu. Sel viisil loodud transgeenne bakter toodab peale enda valkude ka soovitavat inimesevalku. Esimene inimese valku sünteesiv balteritüvi saadi 1978.a. Selleks valguks oli hormoon insuliin, mille USA Toidu-ja Raviamet lubas ravimina kasutusele võtta 1982.a. Varsti pärast seda, 1980. aastatel tulid geenitehnoloogiliste toodetena kasutusele inimese kasvuhormoon,
Geenide ülekandmine on võimalik restriktaaside abil. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad". Selliste otstega DNA juppe on komplemen-taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Kuidas geenid kohale viia? Bakteri plasmiidiga Viirustega Kui neile on soovitud geen lisatud, nime- tame teda geenivektoriks. 3. Kullapüstoliga 4. Taimedesse Agrobakteriga Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? Üle viidavale geenile on markergeen ka külge pandud (näiteks helenduvGFP) Nüüd kasutataksegi GFP geeni markerina: Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp- koodoneid, on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFPvalk on valmis.
Lammas Polly (ja Molly) oli esimene tuumkloonitud ning samal ajal ka transgeenne imetaja. Lammas Dolly oli esimene edukas tuumkloonitud imetaja. Mida nimetatakse geenivektoriks ja kuidas seda tehakse ? Geenivektor on siiratav geen ühendatud sellisesse DNA- või RNA-kompleksi, mis saab siseneda rakku ja integreeruda selle genoomi. Plasmiidi ja DNAd töödeldakse sama restriktaasiga, et lõigata need katki samasuguse nukleotiidjärjestuse kohalt. Saadud DNA lõik liidetakse plasmiidiga ligaasi abil ning rekombinantne plasmiidne geenivektor on loodud. Mille poolest erineb embrüonaalkloonimine tuumkloonimisest ja mis tekitas tugeva eetilise vastuseisu tuumkloonimisele ? Embrüonaalkloonimine seisneb embrüote lõhestamises. See on loomuliku protsessi tehnoloogiline teisend ning kõik lõigustusrakud on võimelised arenema normaalseks tervikorganismiks. Tuumkloonimine seisneb somaatilise keharaku tuuma viimises munarakku, mille oma tuum on eemaldatud
Lõigatud DNA Restrikataas (sama) Lõigatud vektor Kleepuvad otsad ühinevad Rekombinantne plasmiid Kuidas geenid kohale viia? 1. Bakteri plasmiidiga 2. Viirustega Kui neile on soovitud geen lisatud, nime- tame teda geenivektoriks. 3. Kullapüstoliga 4. Taimedesse Agrobakteriga Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? Üle viidavale geenile on markergeen ka külge pandud (näiteks helenduv-GFP) Nüüd kasutataksegi GFP geeni markerina: Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp- koodoneid, on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFP-valk on valmis.
Lõigatud DNA Restrikataas (sama) Lõigatud vektor Kleepuvad otsad ühinevad Rekombinantne plasmiid Kuidas geenid kohale viia? 1. Bakteri plasmiidiga 2. Viirustega Kui neile on soovitud geen lisatud, nime- tame teda geenivektoriks. 3. Kullapüstoliga 4. Taimedesse Agrobakteriga Viirusvektor viib soovitud geeni rakku Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? Üle viidavale geenile on markergeen külge pandud. Näiteks kasutatakse GFP (helenduv) geeni markerina: Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp-koodoneid, on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFP-valk on valmis.
temperatuurid on erinevad. 1.3) Kui palju tuleb võtta 1 M Tris-HCl, 5 M NaCl, 20% SDS ja 0,5 M EDTA-Na 2 lahuseid, et valmistada 1 ml 2 x PK puhvrit (0,4 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,44 M NaCl, 2% SDS, 25 mM EDTA-Na2). On vaja võtta: 400µl Tris HCl, 88µl NaCl, 100 µl SDS ja 50 µl EDTA-Na2 lahuseid. 1.4) On vaja ligeerida 100 ng 5000 bp pikkune plasmiid ja 1000 bp pikkune insert. Mitu ng tuleb võtta inserti, et see oleks ekvivalentne(ekvimolaarne) plasmiidiga (arvesse tuleb võtta nende 5-kordset pikkuste erinevust)? Mitu ng tuleks inserti võtta, kui ligeermisreaktsiooni panna inserti 3 korda rohkem kui ekvivalentne kogus plasmiidi? On vaja võtta 20 ng inserti, et see oleks ekvimolaarne plasmiidiga. Tuleb võtta 60 ng inserti ,kui ligeerimisreaktsiooni panna inserti 3 korda rohkem kui ekvivalentne kogus plasmiidi. Insert- see fragment, mida kloonitakse. 3 Töö nr 2: Ligeeritud produktide transformeerimine E.coli rakkudesse. Lähteained:
restriktaasiga (see on see aine, mis lõikab DNA-d), mis lõikab plasmiidi kindla koha pealt katki. Plasmiidi lõigatud otsad on üheahelalised ja kleepuvad. b) Võetakse DNA. Seda töödeldakse sama restriktaasiga, mille tagajärjel lõigatakse DNAst üks lõik. Ka selle DNA lõigu otsad on üheahelalised ja kleepuvad. c) DNA lõik ja plasmiidi pannakse kokku. Kuna mõlemad on lõigatud sama järjestuse kohalt, siis DNA lõik lõimub plasmiidiga. d) Lõimumiskohta töödeldakse ligaasiga. See on aine, mis tekitab endiste lahtilõigatud otste vahele kovalentsed sidemed, nii et need jäävad tugevasti kokku. Geenivektor ongi valmis. 18.Lihaloomad (sead, veised jt), kelle tailiha ja rasva osakaal on täpselt määratud. Ravimeid tootvd loomad (Geneetiliselt muundatud kits, kelle piimas leiduvad antikehad kasvajate vastu, geneetiliselt muundatud sead, kes toodavad hemoglobiini) 19
mis sisaldavad huvipakkuva järjestuse. Põhineb alfa-komplimentaarsusel 7. Selgita mõistet ja milleks seda kasutatakse? Polycloning site faagi või plasmiidse vektori regioon, mis sisaldab mitu restriktsiooni saiti, mis on reeglina unikaalsed kogu vektori piires. Kasutatakse selleks, et oleks lihtsam vektorisse mingi järjestuse sisse viia. 8. Kuidas saab identsifitseerida/selekteerida baktereid rekombinantse plasmiidiga, kui plasmiidil on geenid, mis vastutavad nii ampitsilliini kui ka tetratsükliini resistentsuse eest ja sisend asub järjestuses, mis kodeerib tetratsükliini resistentsust? Selleks, et tuvastada huvipakkuva järjestusega baktereid, tuleb nende kolooniate osad asetada keskkonnale, kuhu lisati eelnevalt tetratsükliini ja inkubeerida. Need kolooniad, mis jäävad ellu ei
Raskusi valmistas asjaolu, et eukarüootse organismi geene ei suuda bakterid algsel kujul transleerida geenstruktuuri erinevuse tõttu- geenised on mittekodeerivad lõigud (intronid), mida bakterid ei ,,oska" välja lõigata. Siin tuleb appi ensüüm pöördtranskriptaas. Inimese rakkudest eemaldatakse huvipakkuva geeni mRNA (millest intronid on juba kõrvaldatud) ja pöördtranskribeeritakse selle järgi vastav komplementaarne DNA. See ühendatakse plasmiidiga ning saadud geenivektor lülitub bakteriraku koosseisu (peamiseks kasutatavaks bakteriks on inimsese soolekepike). Sel viisil loodud transgeenne bakter toodab peale enda valkude ka soovitavat inimesevalku. 2.2.2 Transgeensed loomad 1980. aastate teisel poolel alustati mitmes biotehnoloogiakeskuses toid saamaks transgeenseid imetajaid (lambaid, kitsi, veiseid), kes toodaksid piimas või veres inimese ravivalke või toidulisandeid. Paljude katsete tulemusena on niisuguseid loomi ka saadud
suhteliselt luhike, siis pole teada tapselt, kui kaua geenide ekspressioon pusib. Katseloomadel on see olnud eluaegne. Katsed primaatide ja veistega on kaimas. Vorreldes vektor-vaktsiinidega on DNA-vaktsiini eeliseks see, et imuunsupressiooni all kannatavad isendid ei satu ohtu saada kahjustatud vektor-organismi poolt, mida on taheldatud AIDS'i patsientide puhul vaktsiinia viiruse kasutamisel. Samas ei teata tapselt, kuidas voib vooras geneetiline materjal organismi lopuks mojutada. Ehkki plasmiidiga organismi viidud DNA liitumist kromosomaalse DNA-ga pole taheldatud, ei ole siin veel koik selge. Siiski voib uskuda, et fataalsete haiguste raviks hakatakse DNA-vaktsineerimist kasutama koige lahemas tulevikus. Lisaks patogeenide antigeene produtseerivatele geenidele on uuritud voimalusi kasutada vektoreid ka defektsete geenide asendamiseks normaalsete geenidega. Vektoriga liidetakse normaalne geen, mis viiakse organismi ja kompenseeritakse sellega vastava geeni defekt.
1.3) Kui palju tuleb võtta 1 M Tris-HCl, 5 M NaCl, 20% SDS ja 0,5 M EDTA-Na 2 lahuseid, et valmistada 1 ml 2 x PK puhvrit (0,4 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,44 M NaCl, 2% SDS, 25 mM EDTA-Na2). 400µl Tris HCl, 88µl NaCl, 100 µl SDS ja 50 µl EDTA-Na2 lahuseid 3 1.4) On vaja ligeerida 100 ng 5000 bp pikkune plasmiid ja 1000 bp pikkune insert. Mitu ng tuleb võtta inserti, et see oleks ekvivalentne plasmiidiga (arvesse tuleb võtta nende 5-kordset pikkuste erinevust)? Mitu ng tuleks inserti võtta, kui ligeermisreaktsiooni panna inserti 3 korda rohkem kui ekvivalentne kogus plasmiidi? Ekvivalentne kogus oleks 20 ng (1000bp*100ng/5000bp). Tegelikkuses peaks võtma 3x rohkem ehk 60 ng. 4 Töö nr 2: Ligeeritud produktide transformeerimine E.coli rakkudesse. Lähteained:
blastostüst viia aesendusema emakasse. Millistel viisidel on võimalik rakku viia võõrast DNA-d? DNA saab rakku siseneda kui rakku töödelda kemikaalidega ja rakku tekkivad poorid. DNA võib panna ka vesiikulisse, mille rakk alla neelab. DNA võib panna kullapartiklitele ja pommitada nendega rakku. DNA-d võib ka rakku süstida. DNA võib viia rakku viirustega Taimede puhul agro bakteritega. Bakteri plasmiidiga. Mis on embrüonaalsed tüvirakud? Embrüonaalsed tüvirakud on pluripotentsed tüvirakud, mis on saadud embrüo varajase staadiumi blastotsüsti sisemisest rakumassist. Tüvirakud võivad areneda peaaegu igat tüüpi koe rakkudeks. Arvatakse, et embrüonaalsete tüvirakkude plastilisust ja potentsiaali piiramatuks paljunemiseks saab kasutada taastusravis ja vigastatud või haigete kudede asendamiseks
Sama restriktaasiga lõigatakse välja siiratavat geeni sisaldav DNA-fragment. Plasmiid ja DNA-fragment segatakse kokku, ”kleepuvad otsad” ühinevad. DNA ühendatakse ligaasiga töötlemisel.). Kuna niisama lihtsalt ei ole võimalik inimese geene bakteri plasmiidi sisestada, kasutatakse selleks ensüüm transkriptaasi. Eraldatakse huvipakkuvast geenis mRNA ja pöördtranskripeeritakse selle järgi vastav komplementaarne DNA. See ühendatakse plasmiidiga ja saadud geenivektor lülitub bakteriraku koosseisu. Transgeensed imetajad toodavad nt inimesele vajalike hormoone (kasvuhormoon, vasikas Juuni). Vajalik geen viiakse otse munarakku või kasutatakse viiruseid. Transgeensed taimed. Neid luuakse peamiselt põllumajanduslikel eesmärkidel. Nende muutmise põhjused: parandada saaduste tarbekvaliteeti (säilivust, välimust, ainelist koostist);
Plasmiidid: Plasmiid on bakteritele iseloomulik ekstrakromosomaalne rõngasjas, kahe- ahelaline DNA molekul, mis on võimeline ise autonoomselt rakus replitseeruma. Plasmiidseid vektoreid kasutatakse siis kloneerimiseks, sest sinna on võimalik kergesti sisse viia võõras DNA, ja plasmiid paljuneb autonoomselt. Plasmiidil peavad aga olema teatud omadused: Esmalt ori sait, mis on vajalik replikatsiooniks. Plasmiid peab kandma mingit spetsiifilist tunnust, et eristada plasmiidiga mikroobe nendest, millel plasmiide ei ole (tavaliselt mingi antibiootikumi suhtes resistentsuse geen, nii et saame antibiootikumiga söötmel kasvatada vaid plasmiidiga mikroobe). Unikaalne restriktsiooni sait, see tähendab, et ei tohi olla rohkem kui üks koht, mis lõigatakse läbi restriktsiooni ensüümiga. Siis saab sinna panna sama ensüümiga läbi lõigataud DNA lõigu. Mingi marker, millega saab eristada inserdiga plasmiide, mitte rekombinantsetest (näit. lacZ geen).
§ Kuigi kombinatsioone tekib harva, siis kui see juhtub, on bakterid võimelised geene vahetama ka väga suurte erinevuste puhul (madal ristamisbarjäär! - loob võimaluse info vahetuseks erinevate bakterite liikide vahel). § Kombinatiivse muutlikkuse käigu vahetatud geneetiline materjali hulk bakteritel on väike - võrdle imetajaid viljastumisel. Konjugatsioon 1 § Info ülekanne doonorilt retsipiendile toimub plasmiidiga. Vajalik on retsipiendi ja doonori otsene kontakt. Konjugat-sioonivõimelised on F+ faktorit (plasmiidi) omavad rakud. F plasmiid tagab: § plasmiidi autonoomse replikatsiooni; § raku pinnale sex-pilide või adhesiinide sünteesi; § F plasmiidi mobiliseerimise ja ülekande F- rakku; § F plasmiidi võime integreeruda retsipiendi genoom Bakteriofaag Bakteriofaag (bakteri viirus, faag) on infektsioosne agens, mis replitseerub kui obligatoorne bakteriraku sisene parasiit. Ekstratsellulaarselt
eksogenoodiks. Retsipiendi DNA on endogenoot. Bakteritel toimuvad horisontaalsed ülekanded 3 mehhanismi abil, milledeks on : transformatsioon- bakteritest vabanenud DNA lõigukese ülekanne retsipientrakku. transduktsioon- on gneetilise informatsiooni (DNA) ülekanne doonorbakterilt retsipientbakterile bakteriofaagi osalusel; osalevad peamiselt mõõdukad faagid konjugatsioon- info ülekanne doonorilt retsipiendile toimub plasmiidiga; vajalik on doonori ja retsipiendi otsene kontakt. · 54. Geenide ülekanne vektorite abil. Vektorid e isepaljunevad süsteemid, kasutatakse tavaliselt bakterite plasmiide või viiruseid- bakteriofaage. Geenide ülekanne- selle mehhanismi puhul on plastiidi geen esmalt duplitseerunud ja geeni üks koopiatest kandub üle tuuma genoomi. Seejärel kaob plastiidi genoomis paiknev duplikaat. Peremeesorganismi patogeeni manustatakse antigeene produtseerivaid
diarröa, oksendamine, krambid, iiveldus, madal palavik. Patogeneesis plasmiid-vahendatud STa, STb, LT-I ja/või LT- II, mis stimuleerivad vedelike ja elektrolüütide hüpersekretsiooni. LT-I on nagu koolera toksiin. Inkubatsioon 24-72h. • EAEC. Enteroagregatiivne. Peensool. Mitteinvasiivne. Imikute kõhulahtisus arengumaades, reisijate kõhulahtisus, püsiv (kauakestev) vesine diarröa oksendamise, dehüdratatsiooni, madala palavikuga. Agregeeruvad suurte kogumikena (AAF plasmiidiga) enterotsüütidele, mikrovillid lühenevad, mononukleaarid infiltreeruvad, verejooks ja lima sekretsioon, vähenenud vedeliku absorptsioon. Lima vangistab bakterid biofilmina epiteelile. Tsütotoksiini pole. • EHEC. Enterohemorraagiline. Jämesool. Invasiivne. Algne vesine kõhulahtisus, millele järgneb tugevalt verine (hemorraagiline koliit) diarröa kõhukrampidega, palavik väike või puudub, võib progresseeruda HUSiks – hemolüütilis- ureemiliseks sündroomiks
Kuidas panna bakter tootma inimese valku? Probleem- inimese DNA-s on intronid, mitte kodeerivad lõigud, mida bakter ei suuda eristada. Lahendus- pöördtranskriptaas (transkriptsiooni vastandprotsess). Saame RNA-le vastava „puhta“ DNA lõigu, mille saab lisada plasmiidi. Tulemus- bakter, kes suudab toota nt insuliini. Inimese rakkudest eraldatakse huvipakkuva geeni mRNA (intronid kõrvaldatud) ja pöördtranskribreeritakse selle järgi vastav komplementaarne DNA. See ühendatakse plasmiidiga nind saadud geenivektor lülitub bakteriraku koosseisu. Selline transgeenne bakter toodab lisaks enda valkudele ka inimese. GMO mikroorganismide kasutamine Suhteliselt lihtsasti loodav, kui on olemas, siis on nende abil tootmine odav. Genoomi pangad- e DNApank Valkude tootmine Vaktsiinide tootmine Tööstuslikud ensüümid- juustutööstus Transgeensed loomad. I oli hiir, kelle genoomi viidi roti kasvuhormooni geen. Geenivektorite ülekandeks
annaabi.ee 
