d. *polüadenüleerimine mRNA 3' otsa lisatakse polü A-saba (kaitseb eksonukleaaside eest), enne toimub 3' otsa lõikamine e. *transport tuumast tsütoplasmasse läbi pooride tänu mRNA polü A-sabale. 23. Nimeta keemilised reaktsioonid, mis on pre-mRNA splaisingu taga. Missugused on need 3 staadiumit, mida katalüüsib splaisosoom? a. Transesterfikatsioon - *branchpointi A 2'-OH ja introni 5'-otsa fosfaatrühma-vaheline 2'5'-fosfodiesterside*ligeeritakse 2 eksonit 3'5'-fosfodiestersidemega b. Vabaneb lasiaadistruktuuriline intron, mis lagundatakse kohe Rnaaside poolt. 24. Missugused U snRNAd osalevad pre-mRNA splaisingu regulatsioonis? a. U1, U2,U5U6U4 ja U1U4. 25. Mis on GT-AG reegel? a. Intron algab alati GT'ga ja lõppeb AG'ga. 26. Kirjelda mehanismi, mille abil tuumsest pre-mRNAst kõrvaldatakse intronid. a. Splaissingut teostab splaissosoom snRNP + pre-mRNA. b
defineerida ka inserdi sisestamise suunda. 2. Vektorit töödeldakse aluselise fosfataasiga, Näit. CIP (calf intestin phosphatase). Selle tulemusel eemaldatakse vektori 5'fosfaat rühmad ja vektor ei religeeru iseendaga kokku. 3. Tömpide otstega DNA lõikude paremaks sisestamiseks kasutatakse ka linkereid või adaptereid. Linkerid ja adapterid on kaheahelalised sünteetilised oligod, mis sisaldavad restriktaaside poolt äratuntavaid DNA järjestusi (restriktsiooni saite) Esimeses ringis ligeeritakse adapterid või linkerid, mida võetakse DNA fragmentide suhtes suures ülehulgas, et ligeerimisel liidetaks iga fragmendiga adapterid või linkerid. Seejärel linkeritega varustatud DNA restrikteeritakse, et eemaldada linkerite ülearused osad. Edasi fragment puhastatakse ja ligeeritakse soovitud vektorisse.
mida transporditakse toimekohta mitteaktiivse eellasena Preprovalgud- valgud, mis sisaldavad signaaljärjestust ja mida aktiveeritakse proteolüütiliselt osttranslatoorne modifitseerimine Protein self-splicing: Mehhanism, kus aktiivne valk saadakse pärast valgu autokatalüütilist modifitseerimist- lõigatakse välja osa järjestusest (intein) ja ligeeritakse ülejäänud valk kokku Valkude struktuurid ja funktsioon Valkude põhiomadus siduda teisi valkemolekulaarne komplementaarsus Ligand mingi valguga spetsiifiliselt interakteeruv molekul Polüpeptiidid Mittevalgulised Ligandi seondumine kutsub esile märklaudvalgu (retseptori või ensüümi) konformatsiooni muutuse Ligandi (k.a ensüümi) spetsiifilisuse mõõt on afiinsus Mehhanismid, mis reguleerivad valkude funktsionaalsust
Nõudlus efektiivsemate tehnoloogiate järele tekkis juba HPG kestel. Sangeri meetod on kahtlemata oluline saavutus bioteaduste vallas, kuid perspektiivitu - meetod nõuab mahukaid ajalisi ja rahalisi ressursse. Nüüdseks on arendatud Sangeri meetodist järgmise põlvkonna sekveneerimismeetodid. Sünonüüm NGS-le ehk massiivne paralleelne sekveneerimine tähendab antud meetodi puhul, et terve genoom eraldatakse väiksemateks ühikuteks ning seejärel ligeeritakse adapterjärjestusele DNA sünteesi käigus sekveneerimine ja DNA süntees toimuvad üheaegselt. Sekveneerimisprotsess on muudetud kiiremaks, odavamaks ja täpsemaks. Pärast genoomi sekveneerimist on järgmiseks etapiks koostute (assembly) ülesehitamine. Kui genoomi sekveneerimine andis informatsiooni nukleotiidse järjestuste kohta, siis koostute arvutiprogrammid proovivad rekonstrueerida erinevaid pikemaid biopolümeeride järjestusi kasutades
taasloomine. Väga tähtis segada vektor ja sisestav DNA omavahel sobivates kontsentratsioonides, iga molekuli vektori jaoks peaks olema segus kolm sisestava DNA molekuli. DNAde otsad seovad komplementaarselt kokku ligaasi abil. 44. Me kasutasime kloneerimiseks pSTBlue-1 vektorit (T-overhangidega), kuhu saab sisestada saadud DNA järjestuse (A-overhangidega inserdi 3’ otsades). Toimub A-T otste komplementaarne paardumine ning vektor ja DNA ligeeritakse. 45. 46. pSTBlue-1 vektor sisaldab replikatsiooni vajaliku origini, antibiootikumiresistentsuse geeni ning ka lacZ operooni, mis annab bakterile lisatoitumisallika, kuna kodeerib β-galaktosidaasi. β-galaktosidaas lõhub β1-4 glükosiidsidet ja erinevaid substraate ette söötes saame kindlaks teha, millised meie kasutatud bakterikoloonuatest sisaldavad tühja plasmiidi ja millistel on insert seda ensüümi kodeeriva järjestuse „ära rikkunud“. 47
PCR käigus toimub ahelate denatureerimine, praimeritega seondumine ja süntees. Seda tsüklit korratakse 30 korda. Seda etappi kontrollitakse kasutades elektroforeesi. Järgmisena toimub selle järjestuse ja vajaliku vektori töötlemine. Sõltuvalt sellest, mis otsad tahetakse saada (,,blunt" või ,,sticky") kasutatakse vastavalt vajalikud restriktaase. Lõigatakse sama restriktaasidega nii vektorit kui ka järjestust. Puhastatakse saadu produktid. Siis ligeeritakse vektorisse saadud järjestust (takistades ise-ligeerimist, kasutades nt. defosforüülimist). Siis teostatakse vektori transformeerimine bakterirakku, kus huvipakkuva järjestuse ekspresseeritakse. Seejärel bakteriraku lõhutatakse, jäädes vektori huvipakkuva järjestusega, mille saadakse sekveneerimisele. Iga etapi kontrollitakse elektroforeesi abil, samuti igat puhastamisetappi kontrollitakse mõõdetes kontsentratsiooni.
g. FISH ees), miinused. 3C meetodiga uuritakse kromosoomide organiseeritust raku loomulikus olekus. Põhimõte seisneb lähedal asuvate lookuste paaride sageduse kindlaksmääramisel nende ristsidumisega. Toimub kolme sammuliselt: 1. Ristsidumine – formaldehüüdi lisamisel üksteisele lähedal asuvad kromatiini segmendid ristseotakse. DNA segmendid ristseotakse valkudega ja valgud ristseotakse üksteisega. 2. Kromatiin fragmenteeritakse ja ligeeritakse 3. DNA puhastatakse ja analüüsitakse (qPCR, sekveneerimine) 3C: one by one analüüs – kasutab 3C lookus-spetsiifilisi praimereid. Tulemus nt interaktsiooniprofiil valitud geenist näitab promootori ja ümbritseva kromatiini interaktsiooni. 4C: tsirkulariseeritud 3C, one by all analüüs – üle genoomne interaktsiooniprofiil üksikule lookusele. 5C: many by many analüüs – analüüsib interaktsioone kahe suurema lookuste
15. Posttranslatoorsed modifikatsioonid. Atsetüleerimine (N--atsetüültransferaas); N-terminaalne metülatsioon; N-terminaalne müristoüleerimine; Lipiidide lisamine; C-terminaalne amidatsioon; glükosüleerimine, fosforüleerimine; GTP-d hüdrolüüsivad lülitid. Protein self-splicing mehhanism, kus aktiivne valk saadakse pärast valgu autokatalüütilist modifitseerimist lõigatakse välja osa järjestustest (intein) ja ligeeritakse ülejäänud valk kokku. II VALKUDE INTERAKTSIOONID 1. Ligand, sidumissait, afiinsus, dissotsatsioonikonstant. Ligand on valguga spetsiifiliselt interakteeruv molekul (polüpeptiid või mittevalguline). Ligandi seondumine toob märklaudvalgus esile konformatsioonilisi muutusi. Afiinsus on ligandi (k.a ensüümi) spetsiifilisuse mõõt.
valgud on glükosüleeritud, s.t. et nad sisaldavad aminohapete külge kovalentselt seotud oligosahhariidseid ahelaid. Eristatakse kahte tüüpi glükosüleerimist: N- seoseline (toimub Asparagiini lämmastiku aatomi kaudu) ja O-seoseline (toimub Seriini või Treoniini hapniku aatomi kaudu) g)fosforüleerimine (fosfataasid ja kinaasid) h)intiini mehhanism(aktiivne valk saadakse pärast valgu autokatalüütilist modifitseerimist st lõigatakse välja osa järjestusest-intein-ja ligeeritakse ülejäänud valk kokku) Lisaks: proteolüütiline lõikamine(selleks et saada aktiivset valku lõigatakse osa aminohappelisi järjestusi ära), aminohappeline modifitseerimine, prosteetiliste rühmade lisamine(prosteetiline rühm – koensüüm, mis on kogu reaktsiooni vältel tugevalt ensüümi külge seotud, kas kovalentselt või paljude nõrkade interaktsioonidega). VALKUDE INTERAKTSIOONID 1. Ligand, sidumissait, afiinuss, dissotsatsioonikonstant
siis eemaldatakse antud fluorofoor ja blokaatorgrupp. SOLID tehnoloogia põhineb sünkroonsetes ligeerimistsüklites. SOLID tehnoloogia kasutab DNA amplifitseerimises emulsioon- PCR meetodit. DNA fragmentide raamatukogu valmistatakse mikrokuulidel. PCR-i lõpptulemusena on iga kuulike kaetud tuhandete koopiatega algsest fragmendist. Seejärel vastavalt rakendusele asetatakse kuulid klaaspinnale. Fluorestsentsvalgus eraldub alles siis kui üksikahel ligeeritakse olemasoleva fragmendiga. SOLiD kasutab samuti nelja värviga fluorestsentsmarkeerimist, et kaardistada võimalike nukleotiidide kombinatsioone Miks on oluline teada organismide genoomide täispikki järjestusi? Selle abil on võimalik koostada evulutsiooni puid või arendada välja kindlaid mehhanisme sihtivaid ravimeid. Näiteks meditsiinis saab seda kasutada haiguste identifitseerimiseks ja potentsiaalselt ka ravi väljatöötamiseks erinevatele geneetilistele haigustele.
molekulide kogumeid (nt metaboliidid, antibiootikumid jne). Inimgeneetikas oluline metabolismi ja selle häirete uurimiseks. 17. Kirjelda teise põlvkonna sekveneerimise proovi ettevalmistamise etappe! Millele tuleb tähelepanu pöörata ning mis võib põhjustada proovi halva kvaliteedi? DNA purustatakse, et saada fragmendid. Siis liidetakse neile mõlemasse otsa ühenukleotiidilised A otsad ehk adenüleeritakse ning siis ligeeritakse sinna külge adapter-oligonukleotiidid. Saadud fragmendid selekteeritakse suuruse järgi ja puhastatakse. Sellele järgneb klastrite genereerimine Flow-cell’is. Flow-cell põhjas on lühikesed oligonukleotiidi järjestused, mis on komplementaarsed DNAle liidetud adapteritega. DNA denatureeritakse üheahelaliseks ning liidetakse flow-celli põhjas olevatele oligonukleotiididele. Toimub sildamplifikatsiooni teke, mille tulemusel tekivad identsed DNA klastrid
splaisosoomiks. Pärast splaisosoomi moodustamist viib snRNPde ja pre-mRNA ulatuslik paardumine U1 ja U4 snRNPde vabastamiseni. Katalüütiliselt aktiivne ümberstruktureeritud splaisosoom viib läbi transesterifikatsiooni reakstiooni nii, et (1) moodustub branchpoint A 2'hüdroksüülrühma ja introni 5' otsa fosfaatrühma vaheline 2'5'-fosfodiesterside. Teise struktuurse muutuse tulemusena, teise transesterifikatsiooni reaktsiooni käigus, (2) ligeeritakse kaks eksonit omavahel 3'5'fosfodiestersideme moodustumise tulemusena, nii 7 et intron vabaneb harulise lariaat-struktuurina. Pikkade pre-mRNAde puhul osalevad eksoni äratundmisel SR valgud. SR valgud interakteeruvud eksoni järjestusega, mida nim eksoonseteks splaisingu võimendajateks (ESE). Pärast ESEga seondumist vahendavad nad U1snRNPde kooperatiivset sidumist korrektsele 5' splaissaidile ja U2snRNPde õige branch point'I äratundmist
ribonukleovalkkompleksi, mida nim splaisosoomiks. Pärast splaisosoomi moodustamist viib snRNPde ja pre-mRNA ulatuslik paardumine U1 ja U4 snRNPde vabastamiseni. Katalüütiliselt aktiivne ümberstruktureeritud splaisosoom viib läbi transesterifikatsiooni reakstiooni nii, et (1) moodustub branchpoint A 2'hüdroksüülrühma ja introni 5' otsa fosfaatrühma vaheline 2'5'- fosfodiesterside. Teise struktuurse muutuse tulemusena, teise transesterifikatsiooni reaktsiooni käigus, (2) ligeeritakse kaks eksonit omavahel 3'5'fosfodiestersideme moodustumise tulemusena, nii et intron vabaneb harulise lariaat-struktuurina. Pikkade pre-mRNAde puhul osalevad eksoni äratundmisel SR valgud. SR valgud interakteeruvud eksoni järjestusega, mida nim eksoonseteks splaisingu võimendajateks (ESE). Pärast ESEga seondumist vahendavad nad U1snRNPde kooperatiivset sidumist korrektsele 5' splaissaidile ja U2snRNPde õige branch point'I äratundmist.
Stranguleerunud kubemesong nõuab erakorralist kirurgilist sekkumist. Operatiivne ravi on suhteliselt vastunäidustatud ülekaalulisetel, kasvajatega, hüübimishäiretga, rasedatel; absoluutselt vastunäidustatud massiivse astsiidi, aktiivse infektsiooni, raske südame- ja hingamispuudulikkuse puhul. Operatiivse ravi printsiibid on sarnased nii direktse kui indirektse tüübi korral: songakott identifitseeritakse, vabastatakse ümbritsevatest kudedest, ligeeritakse ja reponeeritakse kõhuõõnde. Sellele järgneb kõhuseina defekti sulgemine, meetod sõltub patsiendi seisundist, kudede kvaliteedist, retsidiiviohust. Kasutusel on oma kudedega plastika ja võrguga alloplastika: retsidiiv võrguplastikaga 1-5%, retsidiiv koeplastikaga kuni 20%. Operatiivne ravi: Koeplastika: Bassini (m.transversus abdominis ja m.obliquus internus kõõluste ning transversalis fastsia kinnitamine kubemeligamendile + vertikaalne lõõgastav lõige); McVay (m
kodeerivad valke, RNA siduv valk ja pöördtranskriptaas. Retrotransposoonide geenid ei sisalda introneid. Ilma introniteta pseudogeenide teket seostatakse retrotransposoonidega. Lõika ja kleebi Transpositsiooni algus: transposoon lõigatakse DNA-st välja ja hakkab sihtmärk DNA- d otsima → ühendatakse transposooni DNA 3’ otsad märklaud DNA-ga → tekib 2-st 89 kohast katkestatud DNA molekul → katked sünteesitakse täis ja ligeeritakse kokku reparatsiooni ensüümiga → transposoon uues kohas ja transpositsiooni käigus sünteesitakse uut DNA-d, sest vana DNA ahelale jäävad kleepuvad otsad, mis on vaja kaotada. Kui transpositsioon liigub mujale, jätab ta vanale kohale lühikese märklaud-järjestuse, milles indutseeritakse kordus. Näide „lõika-kleebi“ transposoonist. Tekitab DNA-s spetsiifilisi katkeid. Mõlemast ahelast lõigatakse välja tekkivad tömbid katked. Mõlemas otsas 3’ →5’. Märklaud DNA-
sarnanevad erütrotsüütide ABH glükolipiididele ning pääsevad sedasi inimese immuunvastusest. Lipopolüsahhariidide biosüntees E. coli's LPS sünteesitakse tsütoplasmamembraanis ning translokeeritakse välismembraani. See on ühesuunaline transport. LPS-i kõik komponendid (polüsahhariidide südamik, O-antigeen ning lipiid-A) sünteesitakse tsütoplasmamembraani rakupoolses kihis, kus lipiid-A ja polüsahhariidi südamik ka ligeeritakse, tekib nn kare LPS. Kare LPS ja O-antigeen transporditakse eraldi tsütoplasmamembraanist tsütoplasmaatiliselt küljelt periplasmaatilisele küljele ning seejärel liidetakse kokku terviklikuks LPS-ks. Karedat LPS-i transpordib ABC- transporter MsbA ning O-antigeeni Wzx (Wza) flipaas. Laborites laialt kasutatavad E. coli tüved, mis on põlvenud tüvest K-12 ei suuda O-antigeeni transportida, sest neil on flipaas defektne. Periplasmapoolsel
pürimidiin-rikka alaga. U2AF interakteerub tõenäoliselt teiste splasinguks vajalike valkudega domeeni kaudu, mis sisaldab dipeptiidseid seriin-arginiin (SR-motiiv) kordusi. Katalüütiliselt aktiivne ümberstruktureeritud splaisosoom viib läbi transesterifikatsiooni reakstiooni nii, et moodustub branchpoint A 2'hüdroksüülrühma ja introni 5' otsa fosfaatrühma vaheline 2'5'-fosfodiesterside. Teise struktuurse muutuse tulemusena, teise transesterifikatsiooni reaktsiooni käigus, ligeeritakse kaks eksonit omavahel 3'5'fosfodiestersideme moodustumise tulemusena, nii et intron vabaneb harulise lariaat-- struktuurina. Eemaldatud intron lagundatakse kiiresti tuumas olemasolevate Rnaaside poolt. Splaisosoom on peaagu sama suur struktuur kui ribosoomi väike alaühik, koosnedes umbes 70 valgust, mis kõik osalevad splaisingus. Mõned splaisingfaktorid (SF) on assotseeritud snRNPdega, teised mitte. Selleks et eksport tuumast välja toimuks, peavad mRNAd olema lõplikult protsessitud
annaabi.ee 
