LIISI KINK 1 VIROLOOGIA Grupp III dsRNA viirused Ehkki kõik need viirused erinevad, lisaks erinevate peremeesorganismide kasutamisele, teineteisest oluliselt ka genoomide ning virionide organisatsiooni poolest, leidub nende elutsüklites küllalt palju ühiseid jooni. 1. SUGUKOND BIRNAVIRIDAE Birnaviirustel on kahest segmendist koosnev dsRNA genoom, mille ahelate 5'-otstes asub kovalentselt kinnitunud genoomiga seotud valk (VPg, terminaalne valk) ning seetõttu moodustab birnaviiruste genoomne RNA VPg kaudu iseloomulikke mittekovalentseid tsirkulaarseid struktuure. Üks genoomi segment transleeritakse polüproteiinina, mis lõigatakse valmis valkudeks...
RNA Ribonukleiinhape ehk RNA (varasem eestikeelne lühend RNH) ehk on organismi rakkudes leiduv biopolümeer, millel olenevalt vormist on mitmeid erinevaid ülesandeid. Primaarstruktuur on ka RNA-l nukleotiidide ahel, kusjuures ühinemine toimub fosfodiestersidemetega. Nukleotiidse järjestuse määrab RNA sünteesil eeskujuks olev DNA ahel. Kuigi RNA on peamiselt üheahelaline, võivad selle molekulis esineda ka pikad kaheahelalised lõigud, kus ahelad on ühinenud komplementaarsete nukleotiidide vaheliste vesiniksidemete abil. Komplementaarsed paarid on siin A -- U ja C -- G. Sellised lõigud esinevad näiteks transport-RNA-s. Enamasti ei ole RNA ühinenud valkudega, kuid näiteks ribosoomides toimub ka RNA ja valkude liitumisi, kusjuures moodustuvad nukleoproteiidid. RNA-l esineb mitu funktsionaalset vormi. Nendeks on messenger-RNA (mRNA, informatsiooni-RNA), ribosomaalne-RNA (rRNA), transport-RNA (tRNA)
Kääviniidid kaovad 2. Kromosoomid keerduvad lahti 3. Tekivad tuumakesed 4. Sünteesitakse uued tuumamembraanid 5. Toimub ka tsütoplasma jagunemine e tsütokinees 6. Loomaraku membraan nöördub sisse ja nii moodustub 2 uut rakku (Kõik organismi rakud ei lähe mitoosi) Interfaas on kahe mitoosi vaheline eluperiood. - DNA replikatsioon (tekib 2 DNA molekuli, mõlemad kaheahelalised s.t. interfaasi lõpuks 4 ahelat) - ATP süntees - Raku mõõtmed suurenevad ja organellide arv suureneb - Loomarakus tsentrioolid kahestuvad s.t. mitoosieelsestsentrosoomis on 2 paari tsentrioole - Kromosoomid keerduvad lahti 4. Meioos raku jagunemise viis, kromosoomide arv tütarrakkudes väheneb kaks korda Haploidsus
Ribonukleiinhape ehk RNA (inglise ribonucleic acid; varasem eestikeelne lühend RNH) on organismi rakkudes leiduv nukleiinhape. RNA on biopolümeer, millel olenevalt vormist on mitmeid erinevaid funktsioone. Primaarstruktuur on ka RNA-l nukleotiidide ahel, kusjuures ühinemine toimub fosfodiestersidemetega. Nukleotiidse järjestuse määrab RNA sünteesil eeskujuks olev DNA ahel. Kuigi RNA on peamiselt üheahelaline, võivad selle molekulis esineda ka pikad kaheahelalised lõigud, kus ahelad on ühinenud komplementaarsete nukleotiidide vaheliste vesiniksidemete abil. Komplementaarsed paarid on siin A—U ja C—G. Sellised lõigud esinevad näiteks transport-RNA-s. Enamasti ei ole RNA ühinenud valkudega, kuid näiteks ribosoomides toimub ka RNA ja valkude liitumisi, kusjuures moodustuvad nukleoproteiidid. RNA-l esineb mitu funktsionaalset vormi. Nendeks on messenger-RNA (mRNA, informatsiooni-RNA), ribosomaalne-RNA (rRNA), transport-RNA (tRNA). Eukarüootides
1. Kasutada vektori lineariseerimiseks restriktaase, mis annavad erinevaid üheahelalisi otsi. Taoliselt on võimalik defineerida ka inserdi sisestamise suunda. 2. Vektorit töödeldakse aluselise fosfataasiga, Näit. CIP (calf intestin phosphatase). Selle tulemusel eemaldatakse vektori 5'fosfaat rühmad ja vektor ei religeeru iseendaga kokku. 3. Tömpide otstega DNA lõikude paremaks sisestamiseks kasutatakse ka linkereid või adaptereid. Linkerid ja adapterid on kaheahelalised sünteetilised oligod, mis sisaldavad restriktaaside poolt äratuntavaid DNA järjestusi (restriktsiooni saite) Esimeses ringis ligeeritakse adapterid või linkerid, mida võetakse DNA fragmentide suhtes suures ülehulgas, et ligeerimisel liidetaks iga fragmendiga adapterid või linkerid. Seejärel linkeritega varustatud DNA restrikteeritakse, et eemaldada linkerite ülearused osad. Edasi fragment puhastatakse ja ligeeritakse soovitud vektorisse.
Viirused on rakusisesed parasiidid. Nad on täielikult sõltuvad peremeesrakust nad ei suuda ennast üksi paljundada Neil on ainult ühte tüüpi nukleiinhape, kas DNA või RNA EHITUS 1. Valguline kate e kapsiid Sellele võib lisanduda ümbris, mis koosneb kas valkudest, lipiididest või süsivesikutest. 2. Nukleiinhape kodeerib viirusspetsiifilisi valke. pärilikkuse kandjaks võivad olla kaheahelalised või üheahelalised DNA- või RNA- viirused TOIMIMINE RAKUS 1. viirusosake peab kinnituma peremeesrakule. 2. viiruse nukleiinhape tungib peremeesrakku. 3. Viiruse geenid hakkavad kontrollima peremeesraku ainevahetust. 4. a) Kävitub lüütiline tsükkel. Rakus tekib massiliselt viirusosakesi ja rakk sureb. b) Käivitub lüsogeenne tsükkel. Viiruse nukleiinhape püsib raku genoomis muutumatus olekus (herpes, HIV) 21. Osata ennustada tunnuse pärandusmist vastavalt pärandumistüübile
Üheahelalised interfereerivad RNA-d moodustuvad kaheahelaliselt RNAlt (20-30 nukleotiidi). Nad paarduvad sihtmärk RNAle ja võivad nii põhjustad mitmeid kahjustusi: 1. lõikavad, 2. represseerivad translatsiooni ja sihtmärk RNA destruktsiooni, 3. moodustavad heterokromatiinseid alasid DNAl, millelt sihtmärk RNA transkribeeritakse. Siia klassi kuuluvad: mikroRNA-d (miRNA-d), väiksed segavad RNA-d (siRNA-d) ja piwi-seoselised RNA-d (piRNA-d). Kõik nad on lühikesed, algselt kaheahelalised, seostuvad RNA-le ja vähendavad geeniekspressiooni. * miRNA-d miRNA-d reguleerivad mRNA translatsiooni ja stabiilsust miRNA-de protsessing ja toime. miRNA-sid sünteesitakse RNA polümeraas II poolt, lisatakse cap-struktuur ja polüadenüleeritakse. Prekursor miRNA moodustab endaga kaheahelalise struktuuri. Tuumas kärbitakse teda ja saadetakse tsütosooli, kus see lõigatakse dicer ensüümiga, nii moodustub miRNA. * Mis vahe on miRNA-l ja siRNA-l?
Proov (teadaolev järjestus) koosneb tüüpiliselt identifitseeritud nukleiinhappe molekulide homogeensest populatsioonist (kloonitud DNA või keemiliselt sünteesitud oligonukleotiidid) ja sihtmärgi (otsitavad järjestused) moodustab nukleiinhapete segust koosnev heterogeenne populatsioon. Hübridiseerimise eesmärgiks on proovi teadaolevaid järjestusi kasutades tuvastada homoloogilisi järjestusi sihtmärk DNA-s. Kui proov või sihtmärk on kaheahelalised, siis kõigepealt nad denatureeritakse, kas kuumutamisel või töötlemisel aluselises keskkonnas, seejärel segatakse proovi ja sihtmärgi üksikahelad kokku ja lastakse komplementaarsetel aluspaaridel reassotsieeruda. Seejuures võivad moodustuda nii homodupleksid proovi ja sihtmärgi DNA ahelate vahel kui ka heterodupleksid proovi ja sihtmärgi DNA ahelate vahel. Nukleiinhappe kiibid. Keemiliselt sünteesitud oligonukleotiidid kinnitatakse kiipidele. Me teame molekulide
KCl kui tüüpiline osmoprotektor halofiilidel - Paljudel halofiilidel (näiteks halofiilsed arhed, aga ka näiteks eubakter Salinibacter ruber) on osmoprotektoriks KCl ja seetõttu peavad nende ensüümid hästi taluma kõrget soolasisaldust. Raku sees on ca 5M KCl sisaldus. Selliste mikroobide rakusisesed valgud on happelised, et mitte soolaga välja sadeneda ja sellega soolaga kohanenud. Madalal soolasisaldusel pole töövõimelised. Kuivuse toimel tekivad kaheahelalised katked DNAs ehk DNA laguneb tükkideks. Kuivuse eest kaitsemiseks ümbritsevad rakud end kapsliga. Osmootse rõhu tõstmist saab kasutada hoidiste tegemisel: soolamine, suhkruga hoidised. Tekitab suurema osmootse rõhu toiduainetes, mida on vaja säilitada. See pärsib mikroorganismide kasvu ehk toiduained ei rikne nii kiiresti. 18. Kiirguste mõju mikroobidele. Kuidas mõjub elusrakkudele UV kiirgus? DNA kui UV kiirguse märklaud.
B-vormis pöörub paremale. 2’ C juures ei ole O RNA on A-vormis. Suur ja väikest vagu pole näha, suur = sügav vagu. väike = hästi madal. aluspaaride asukoht selles vaos. Väljas on fosfaadid; riboosid ja lämmastikalused on enamvähem kohakuti ja keskel on auk. RNA-l on veel lisa vesinikside, mida DNA-l pole. Kaheahelaline RNA on stabiilsem kui dsDNA. Aluspaaride roll stabiliseerimisel on väiksem. 2’ C juures on O RNA-s: - 2’ O suunab kiiremale lagundamisele - esinevad kaheahelalised struktuurid molekuli paardumisel iseendaga - kaksikheeliks jäik ja ebaregulaarne - aluste stäkkumine (järjestikuste nukleotiidide vahel, van der Waalsi jõudude abil – nõrgad elektromagneetilised jõud) - struktuur globulaarne - A-vormis DNA-s: - koosneb kahest eraldi ahelast - kaksikahel on paindlik ja regulaarne - kaksikheeliksit stabiliseerib lämmastikaluste paardumine - määrab samas ka struktuuri - struktuur fibrillaarne (kiud) - B-vormis Puriin paardub pürimidiiniga:
Telomeeride koosseisus olevad RNA-d – osalevad kui matriitsid kromosoomi otste replitseerimises snoRNA-d – modifitseerivad ribosomaalset RNA-d snRNA-d – osalevad RNA splaissingu läbiviimises Xist RNA – osaleb emasloomade X kromosoomi ühe koopia inaktiveerimises Kolm viisi kuidas RNA interferents muudab geeniekspressiooni eukarüootides Siia klassi kuuluvad: mikroRNA-d (miRNA-d), väiksed segavad RNA-d (siRNA-d) ja piwi- seoselised RNA-d (piRNA-d). Kõik nad on lühikesed, algselt kaheahelalised, seostuvad RNA- le ja vähendavad geeniekspressiooni: Lagundavad RNA millele seostunud Aeglustavad translatsiooni ja hävitavad RNA Moodustavad heterokromatiini DNA-st millest RNA transkribeeritakse miRNA-d reguleerivad mRNA translatsiooni ja stabiilsust. miRNA-sid sünteesitakse RNA polümeraas II poolt, lisatakse cap-struktuur ja polüadenüleeritakse, toimub lõikamine dicer ensüümi abil ning seondub valguga tekib RISC- kompleks (ingl-k
Üheahelalised interfereerivad RNA-d moodustuvad kaheahelaliselt RNAlt (20-30 nukleotiidi). Nad paarduvad sihtmärk RNAle ja võivad nii põhjustad mitmeid kahjustusi: 1. lõikavad, 2. represseerivad translatsiooni ja sihtmärk RNA destruktsiooni, 3. moodustavad heterokromatiinseid alasid DNA-l, millelt sihtmärk RNA transkribeeritakse. Siia klassi kuuluvad: mikroRNA-d (miRNA-d), väiksed segavad RNA-d (siRNA-d) ja piwi-seoselised RNA-d (piRNA d). Kõik nad on lühikesed, algselt kaheahelalised, seostuvad RNA-le ja vähendavad geeniekspressiooni. 62. miRNA-d reguleerivad mRNA translatsiooni ja stabiilsust miRNA-sid sünteesitakse RNA polümeraas II poolt, lisatakse cap-struktuur ja polüadenüleeritakse. Prekursor miRNA moodustab endaga kaheahelalise struktuuri. miRNA moodustub nii, et tuumas kärbitakse teda ja saadetakse tsütosooli, kus see lõigatakse dicer ensüümiga. Argonaut konjugeerub RISC valkudega ning seejärel seostuvad
RNA on biopolümeer, monomeerideks ribonukleotiidid, tümiini asemel on uratsiil(U). RNA omadused sõltuvad monomeeride järjestusest molekulis. Ribonukleotiidide järjestust molekulis nimetatakse RNA prim.struktuuriks. Primaarstruktuur on ka RNA-l nukleotiidide ahel, kusjuures ühinemine toimub fosfodiestersidemetega. Nukleotiidse järjestuse määrab RNA sünteesil eeskujuks olev DNA ahel. Kuigi RNA on peamiselt üheahelaline, võivad selle molekulis esineda ka pikad kaheahelalised lõigud, kus ahelad on ühinenud komplementaarsete nukleotiidide vaheliste vesiniksidemete abil. Komplementaarsed paarid on siin A -- U ja C -- G. Sellised lõigud esinevad näiteks transport-RNA-s. Nagu iga teine nukleiinhapegi koosneb mRNA nukleotiididest, mida tihti kutsutakse ka alusteks. RNAs sisalduvad nukleotiidid on: adeniin (A), guaniin (G), tsütosiin (C) ja uratsiil (U). DNA ahelas vastab uratsiilile tümiin (T). Nukleotiidide kolmikuid e. triplette mRNAs
Otsesed UV kiired tapavad mikroobe juba 10-30min jooksul. UV-C mutageenne toime, UV-B päikesepõletus, mutageenne toime, UV-A naha vananemine, muidu suht kahjutu. 82. Mis on UV kiirguse märklauaks? DNA. 83. Kuidas toimib ioniseeriv kiirgus? Mõjub nii letaalselt kui ka mutageenselt. See kiirgus tekitab radikaale. Lõhub visiniksidemeid, oksüdeerib kaksiksidemeid, lõhub tsüklilisi molekule ja polümeriseerib molekule. Ioniseeriva kiirguse toimel tekivad kaheahelalised katked DNA-s DNA laguneb tükkideks. Sellega steriilitakse opivahendeid, laboriplastikut, süstlaid ja ka toiduaineid. 84. Nimeta kõige kiirgusttaluvam bakter. Deinococcus radiodurans. 85. Mis kaitseb teda kiirguse eest? Tal on mitmekihiline rakukest, ta sünteesib karotinoidpigmente, tal on ülitõhusad DNA reparatsioonimehhanismid, mis võimaldavad kokku panna juppideks lagunenud DNA, tema rakus on vähe rauda ja palju mangaani. See aitab vähendada rakus
UV kiirguse toimel moodustuvad DNA ahelas kõrvutiasetsevate tümiinaluste vahel kovalentsed sidemed- tekivad tümidiindimeerid. Nende dimeeride moodustumine takistab replikatsiooni- tekivad replikatsioonivead (kasutatakse mutageenina). Mis on UV kiirguse märklauaks? DNA. Kuidas toimib ioniseeriv kiirgus? Ioniseeriv kiirgus lõhub vesiniksidemeid, oksüdeerib kaksiksidemeid, lõhub tsüklilisi molekule ja polümeriseerib molekule. Ioniseeriva kiirguse (ja ka kuivuse!) toimel tekivad kaheahelalised katked DNA-s DNA laguneb tükkideks. Nimeta kõige kiirgusttaluvam bakter. Mis kaitseb teda kiirguse eest? Deinococcus radiodurans, kes talub väga hästi ka ioniseerivat kiirgust. Tal on mitmekihiline rakukest, ta sünteesib karotinoidpigmente, tal on ülitõhusad DNA reparatsioonimehhanismid, mis võimaldavad efektiivselt kokku panna juppideks lagunenud DNA, tema rakus on vähe rauda ja rohkesti mangaani. Milleks saab kasutada UV-kiirgust? Steriliseerimiseks. Mikroobimutantide saamiseks
Kõige tugevama toimega on UV kiirgus lainepikkusega 260 nm. DNA reparatsioonimehhanismid 82. Kuidas toimib ioniseeriv kiirgus? Nimeta kõige kiirgusttaluvam bakter. Mis kaitseb teda kiirguse eest? Milleks saab kasutada UV-kiirgust? Miks saab UV kiirgust kasutada mikroobimutantide saamiseks? Ioniseeriv kiirgus lõhub vesiniksidemeid, oksüdeerib kaksiksidemeid, lõhub tsüklilisi molekule ja polümeriseerib molekule. Ioniseeriva kiirguse (ja ka kuivuse!) toimel tekivad kaheahelalised katked DNA-s DNA laguneb tükkideks. Deinococcus radiodurans, kes talub väga hästi ka ioniseerivat kiirgust. Tal on mitmekihiline rakukest, ta sünteesib karotinoidpigmente, tal on ülitõhusad DNA reparatsioonimehhanismid, mis võimaldavad efektiivselt kokku panna juppideks lagunenud DNA, tema rakus on vähe rauda ja rohkesti mangaani. UV kiirguse toimel moodustuvad DNA ahelas kõrvutiasetsevate tümiinaluste vahel kovalentsed
eest. RNA sünteesi põhietapid Pre-initsiatsioon Initsiatsioon Promootori vabastamine Elongatsioon Terminatsioon RNA-de tüübid. • mRNA-d - messenger RNA-d e. käskjalg RNA-d • rRNA-d - ribosomaalsed RNA-d • tRNA - transport RNA-d • snRNA-d - väiksed tuuma RNA-d • snoRNA-d - väikesed tuumakese RNA-d • Erinevad mittekodeerivad RNA-d: mikroRNA-d e. miRNA-d (üheahelalised) siRNA-d - väiksed segavad RNA-d (kaheahelalised) piRNA-d - Piwi segavad RNA-d (tansposoonide vaigistajad sugurakkudes) Tsütoplasma võrgustik (TV) Tsütoplasmavõrgustik e. endoplasmaatiline retiikulum (ER) on ühekordse membraaniga ümbritsetud terviklik kompartment, mis on iseloomulik kõigile eukarüootidele. ER-i membraan moodustab üle poole kogu raku membraanistikust ja on barjääriks luumeni ja tsütosooli vahel, ta vahendab teatud kindlate molekulide liikumist ühest kompartmendist teise. ER-i membraanis
diaalvõrgud või avatuna talitlevad ring- ja silmusvõrgud. Elektrisüsteemi põ- hivõrgud (süsteemi- ja ülekandevõrgud) on enamasti silmusvõrgud, mis kind- lustavad elektrisüsteemi ja –võrgu kõrge töökindluse. Reserveerimata radiaalvõrke kasutatakse madalamat varustuskindlust nõudva- te tarbijate toiteks. Selliseid võrke kasutatakse sageli maal ja asulates elukond- like tarbijate puhul. Reserveeritud radiaalvõrk kõrgema varustuskindluse. Sel- listes võrkudes on kaheahelalised või paralleelliinid, mis kindlustavad toite ka ühe ahela avarii korral. Suletud võrgud on kõik reserveeritud võrgud. Suletud võrgud on avatutega võrreldes töökindlamad ja tavaliselt väiksemate võimsuskadudega, kuid nende käit, automaatika ja releekaitse on keerukam. Lihtsad suletud võrgud (kahe- poolse toitega ja ringliinid) on laialdaselt kasutusel linna ja maa jaotusvõrku- des. Kaitse ja automaatika lihtsustamise eesmärgil töötavad sellised võrgud sageli avatuna.
Toimib ka endospooridele ning viirustele. Ioniseeriv kiirgus Lühike lainepikkus, suur energia. Mõjub letaalselt kui ka mutageenselt; tekitab radikaale. Röntgenkiired (kunstlikult tekitatud) ja gammakiired (radioaktiivsete isotoopide lagunemine). Gammakiiri kasutatakse steriliseerimisel. Lõhub vesiniksidemeid, oksüdeerib kaksiksidemeid, lõhub tsüklilisi molekule ja polümeriseerib molekule. Ioniseeriva kiirguse (ja kuivuse) toimel tekivad kaheahelalised katked DNAs DNA laguneb tükkideks. Ioniseeriv kiirgus lööb erinevatest molekulidest elektrone välja. Kui need liituvad hapniku molekuliga, siis moodustuvad hapnikuradikaalid, mis kahjustavad biopolümeere, eriti DNAd. Seega tugevdab hapnik ioniseeriva kiirguse toimet. Bakterite vegetatiivsed rakud on ioniseerivale kiirgusele palju tundlikumad, kui endospoorid. Erinevad bakterid ka erineva tundlikkusega. Mikrokokid ja streptokokid on küllalt resistentsed. G(+) bakterid vähem tundlikumad.
Hübridisatsioonireaktsiooni korral on üks nukeliinhappe järjestus pärit “tuntud” mikroorganismilt (näiteks gripiviiruselt A). See ahel on proov ehk sond (probe). Teine ahel kuulub uuritavale mikroorganismile ehk sihtmärgile (target), mida püütakse kindlaks teha. Positiivne hübridisatsioonireaktsioon näitab, et uuritavas materjalis on sama mikroorganism, millest valmistati sond. Üheahelaline nukleiinhape, mida kasutatakse sondina, võib olla nii RNA kui DNA. Moodustuvad kaheahelalised hübriidid võivad olla kas DNA-DNA, RNA-RNA võis siis DNA-RNA ahelad. 63 Joonis 1. Nukleiinhapete hübridisatsiooni põhimõte. Positiivse hübridisatsiooni korral moodustub sondi ja sihtmärgi vahel kaksikahel. Negatiivse hübridisatsiooni korral homoloogia sondi ja sihtmärgi vahel puudub. Hübridisatsioonireaktsiooni etapid (1) üheahelalise nukleiinsondi valmistamine ja märgistamine;
annaabi.ee 
