Kasulikud uurijatele, et muuta DNA'd elusorganismis. Elemendid transposoonid, retrotransposoonid, DNA tr., plasmiidid, bakteriofaagi elemendid. Kromatiin Nukleiinhappe valkkompleks, nähtav interfaasis kui rakud ei jagune. Rakufaasis on jaotunud ühtlaselt üle kogu tuuma. Struktuur sarnane kõigil eukarüootidel. Kromatiin pakkimise käigus moodustab mitoosi ajal (metafaasis) nähtavaid kromosoome. Mediaatori funktsioon transkriptsiooni initsiatsioonil Mediaator on suur valkkompleks, mis funktsioneerib transkriptsiooni koaktivaatorina. Pol II initsiatsiooniks in vivo on vaja multivalkset mediaator-kompleksi, mis assotsieeruks mittefosforüülitud Polümeraas II C-terminusega, moodustades väga suure holoensüümi ning sisaldades ka enamuse generaalsetest transkriptsiooni faktoritest, toimides sillana ensüümi ja transkriptsioonifaktorite vahel. Ehk mediaator mõjutab otseselt transkriptsiooni preinitsiatsiooni kompleksi kokkupanekut.
Dekodeerivas tsentris toimub koodon-antikoodon äratundmine. Selles protsessis osaleb ribosoom aktiivselt, ribosoomis toimuv koodon-antikoodon interaktsioon on stabiilsem ja täpsem kui vabas lahuses tRNA antikoodoni ja mRNA koodoni paardumine. Dekodeeriva tsentri moodustumisel osalevad nii 16S rRNA kui ribosoomi väiksema subühiku valgud. Dekodeeriva tsenri läheduses paikneb ribosoomi väiksemal subühikul mRNA sidumispiirkond, mis toimib valgusünteesi initsiatsioonil. See piirkond koosneb eranditult rRNA'st ja moodustub 16S rRNA 3' otsas, mis paardub mRNA ribosoomi seondumispiirkonnaga (nn. anti-Shine-Dalgarno järjestus). Ribosoomi suuremal subühikul asuvad peptiidsideme moodustumist katalüüsiv tsenter e. peptidüültransferaasne tsenter on piirkond kuhu seonduvad aa-tRNA ja peptidüül- tRNA 3' otsad koos vastavalt aminohappe- ja kasvava peptiidahelaga, ning viimane oluline koht, valgusünteesi faktoreid siduv tsenter. Neist esimene, aminohappeid
Enne kui algab translatsiooni elongatsioonifaas, peab olema toimunud initsiatsioonifaas (initsiatsioonist tuleb kunagi eraldi loeng). Initsiatsiooni põhiline keerukus valgusünteesis seisneb tõsiasjas, et kui RNA süntees algab 1 nukleotiid enne või pärast, siis suurt funktsionaalset kaotust pole. Tuleb leida üles õige lugemisraam ja alustada valgusünteesi sealt kohast, kus ta on ettenähtud algama – initsiatsiooni kõige tähtsam ülesanne. Translatsiooni initsiatsioonil osalevad mitmed initsiatsioonifaktorid: IF1, IF2, IF3. Initsiaatorkoodoni üles leidmisel osaleb Shine-Dalgarno (SD) järjestus, mis asub mRNA initsiaatorkoodoni ees. rRNA 3’ ots seondub SD järjestusega. Initsiaatorkoodoniks on AUG. Kui 30S initsiatsioonikompleks on paika saanud, siis lahkub sealt IF3 faktor ning järelejäänud kompleksiga ühineb suurem subühik, misjärel võib elongatsioon peale alata.
tRNA lahkub ribosoomilt. Ribosoom sisaldab 3 saiti tRNA sidumiseks. Kogu aeg samaaegselt 2 tRNA-d ribosoomiga seotud. Väiksemal subühikul asub mRNA kanal. Koodon-antikoodon paardumine toimub väiksemas subühikus. tRNA aktiivtsentrid: Ribosoomi dekodeeriv tsenter – asub väiksemal subühikul. Toimub koodon- antikoodon äratundmine. Moodustavad 16S rRNA ja väiksema subühiku valgud. mRNA sidumispiirkond – dekodeeriva tsentri läheduses, väiksemal subühikul. Toimib valgusünteesi initsiatsioonil. Koosneb rRNA-st ja moodustub 16S rRNA 3’ otsas, mis paardub mRNA seondumispiirkonnaga. peptidüültransferaasne tsenter – peptiidsideme moodustumist katalüüsiv tsenter – asub ribosoomi suuremal subühikul. Piirkond, kuhu seonduvad aa-tRNA ja peptidüül- tRNA 3’ otsad koos vastava AH ja kasvava peptiidahelaga. valgusünteesi faktoreid siduv tsenter – 1) AH siduv tsenter koosneb 23 S rRNA-st 2) selle tsentri moodustumisel osalevad ka L-valgud. Ribosomaalse valgusünteesi etapid:
kuni -60bp alale. Järgnevalt seondub trimeerne core-faktor koos TBP'ga core-elemendile. Viimases etapis RNAPolII eelmoodustunud kompleks koos Rnp3'ga assotseerub seondunud valkudega, paigutades polümeraasi startsaidi lähedusse. RNAPolIII-sõltuv initsiatsioon. Promootoralad asuvad täielikult transkribeeritava ala sees (tRNA geenidel A box ja B box, 5SrRNA geenidel C box). Initsiatsiooniks on vaja 3 GTF'i: TFIIIC ja TFIIIB osalevad nii tRNA kui 5SrRNA, TFIIIA vaid 5SrRNA transkriptsiooni initsiatsioonil. On vajalik, et spetsiifilised GTF'd istuksid teatud DNA järjestustele. TFIIIB alaühik BRF suunab polümeraasi õigele elemendile. Kui TFIIIB on sidunud, siis saab RNAPolIII seonduda ja rNTPde olemasolul initseerida transkriptsiooni. 13. Kus toimub transkriptsioon? Kus transkriptsioonifaktorid rakus paiknevad?Too näiteid, kuidas transkriptsioonifaktorite post-translatsioonilised modifikatsioonid mõjutavad nende a) DNAle
konformatsiooni). 3 2. Transkriptsiooni initsiatsiooni kontroll bakterites RNA polümeraas Geenide avaldumist kontrollitakse esmalt RNA sünteesi e. transkriptsiooni tasemel. Transkriptsiooni algatab ja viib läbi DNA-st sõltuv RNA polümeraas, mis on enamasti multimeerne ensüüm. Monomeerseid RNA polümeraase on kirjeldatud lüütilistel bakteriofaagidel (näit. T7, T3, SP6). Enamasti on nende suurus üle 100 kDa. Transkriptsiooni initsiatsioonil tunnevad nad ära väga spetsiifilisi DNA järjestusi ning ei vaja aktivatsioonil lisafaktoreid. Monomeersed RNA polümeraasid on 5-10 korda kiiremad, nad sünteesivad 200 nt/sek (bakteri RNA polümeraas sünteesib 40 nt/sek). Erinevalt bakteriaalsetest RNA polümeraasidest ei ole nad Zn-metalloensüümid. Tänu efektiivsusele ja spetsiifilisusele on monomeersed ensüümid leidnud rakendust nii rekombinantse DNA tehnoloogias kui ka RNA produtseerimises in vitro.
Tüübid: mRNA, rRNA(e. ribosoomi RNA), snRNA(e. väikese tuuma RNA) ja tRNA(e. ülekande RNA) molekulid. 107. RNA polümeraas I ehitus. RNA polümeraas (E.coli) MW 480000 D, koosneb 5 polüpeptiidist (a2bb's). a2bb's on holoensüüm. Kaks a-alaüksust määravad tetrameerse tüviensüümi a2bb' kokkupaneku. b-alaüksus sisaldab ribonukleosiidtrifosfaate seondavat saiti. b'-alaüksus sisaldab DNA-matriitsi seonduvat piirkonda. Sigma faktor (s) osaleb vaid transkriptsiooni initsiatsioonil ja pärast seda ta vabaneb RNA polümeraasist. Annab RNA polümeraasi seondumisele spetsiifilisuse. 108. RNA polümeraasid I, II ja III eukarüootidel. RNA polümeraas I - tuumake - produtseerib rRNAd (v.a. 5S RNA) - amantiinile mittetundlik. RNA polümeraas II - tuum - pre-mRNAd - täiuslik tundlikkus RNA polümeraas III - tuum - tRNA, snRNA, 5S RNAd - keskmine tundlikkus. 109. Upstream ja downstream järjestused.
Sünteesitud RNA ahel vastab üks-üheselt temaga antiparalleelsele DNA matriitsahelale komplementaarsusprintsiibi alusel. RNA järjestusega identset DNA ahelat nimetatakse kodeerivaks ahelaks. RNA sünteesi käigus toimub DNA ahelate lahtiharutamine. Algne DNA struktuur taastub peale transkriptsiooni lõppu. Transkriptsiooni algatab ja viib läbi DNA-st sõltuv RNA polümeraas, mis on enamasti multimeerne ensüüm. Transkriptsiooni initsiatsioonil tunnevad nad ära väga spetsiifilisi DNA järjestusi ning ei vaja aktivatsioonil lisafaktoreid. Spetsiifilist DNA piirkonda, millega RNA polümeraas seondub, nimetatkse promootoriks. Bakterite RNA polümeraas koosneb viiest subühikust. Apoensüüm - koosneb neljast subühikust ja on võimeline katalüüsima RNA sünteesi. Apoensüümi subühikud on erinevates organismides struktuurselt lähedased. Holoensüümi koosseisu kuulub ka sigma faktor
· Kui RNA polümeraas vabaneb basaalsetest transkriptsioonifaktoritest algab elongatsioon. 59. Transkriptsiooni elongatsioon ja terminatsioon. Elongatsioon RNA ahela kasvatamine RNA polümeraasi poolt. Sünteesitava RNA ahela 5' otsa modifitseerimine toimub juba elongatsiooni varajasel etapil. 5' otsa lisatav ,,müts" sisaldab ebatavalist 5'-5' trifosfaatsidet ja kahte metüülrühma. Selline struktuur RNA molekuli otsas on äratuntav translatsiooni initsiatsioonil osalevate valkude poolt, samuti kaitseb see mRNA-d degradatsiooni eest. Terminatsioon RNA ahela süntees lõppeb siis, kui RNA polümeraas kohtab terminatsioonisignaali. Seejärel transkriptsioonikompleks dissotseerub. Transkriptsiooni termineerivad signaalid on kas Rho valgust sõltuvad või sõltumatud. · Rho sõltuvad terminatsioonijärjestused pikemad, Rho valk seondub kasvava
59)Transkriptsiooni elongatsioon ja terminatsioon. Kui RNA polümeraas vabaneb basaalsetest transkriptsioonifaktoritest promootorpiirkonnas, järgneb RNA ahela elongatsioon sarnaselt bakterirakus toimuvale. Sünteesitava RNA ahela 5´ otsa modifitseerimine toimub juba elongatsiooni varajasel etapil. 5´ otsa lisatav 7-metüülguanosiin "müts" sisaldab ebatavalist 5´-5´- trifosfaatsidet ja kahte metüülrühma. Selline struktuur RNA molekuli otsas on äratuntav translatsiooni initsiatsioonil osalevate valkude poolt, samuti kaitseb see mRNA-d degradatsiooni eest. RNA polümeraas II poolt sünteesitud primaarsete transkriptide 3´-otsad lõigatakse spetsiifiliste endonukleaaside abil lühemaks. Transkriptsiooni termineerumine toimub neist lõikekohtadest (lõikesaitidest) 1000 2000 nukleotiidi allpool, kusjuures kindlat termineerumiskohta ei ole. Enamasti jääb lõikesait 11-30 nukleotiidi allapoole konserveerunud järjestusest AAUAAA. Pärast lõikust lisab
aminohappe lisamine kasvavale polüpeptiidahelale), E-saiti liigub tRNA, millelt aminohape on seotud polüpeptiidahelasse. A, P ja E seondumissaitide põhiosa asub ribosoomi suures subühikus. 66. Võrrelge translatsiooni initsiatsiooni bakterites ja eukarüootses rakus. Translatsiooni initsiatsioon – sündmused, mis eelnevad peptiidsideme moodustumisele sünteesitava polüpeptiidi kahe esimese aminohappe vahel. Bakterites: initsiatsioonil osalevad ribosoomi 30S subühik, mRNA, spetsiaalne initsiaator-tRNA, kolm initsiaatorfaktorit, GTP molekul. Enne translatsiooni toimumist on ribosoomid jaotunud kaheks alaühikuks – 30S ja 50S subühikuteks. Initsiaatorkoodoniks mRNA molekulis on AUG koodon. Metionüül-tRNAtMet tunneb ära AUG initsiaator-koodoni ja viib ribosoomi formüülmetioniini – metioniini, mille aminorühm on blokeeritud formüülrühmaga
Järgnevalt seondub trimeerne core-faktor koos TBP'ga core-elemendile. Viimases etapis RNAPolII eelmoodustunud kompleks koos Rnp3'ga assotseerub seondunud valkudega, paigutades polümeraasi startsaidi lähedusse. RNAPolIII-sõltuv initsiatsioon. Promootoralad asuvad täielikult transkribeeritava ala sees (tRNA geenidel A box ja B box, 5SrRNA geenidel C box). Initsiatsiooniks on vaja 3 GTF'i: TFIIIC ja TFIIIB osalevad nii tRNA kui 5SrRNA, TFIIIA vaid 5SrRNA transkriptsiooni initsiatsioonil. On vajalik, et spetsiifilised GTF'd istuksid teatud DNA järjestustele. TFIIIB alaühik BRF suunab polümeraasi õigele elemendile. Kui TFIIIB on sidunud, siis saab RNAPolIII seonduda ja rNTPde olemasolul initseerida transkriptsiooni. 1. N-terminaalne DNAd - siduv domään, mis seondub teatud DNA järjestustele, 2. C-terminaalne aktivatsiooni domään, mis interaktsioonis teiste valkudega aktiveerib transkriptsiooni.
68 on sigma70. See sigma faktor võimaldab ära tunda promootoreid, milles on konserveerunud kaks 6- nukleotiidset regiooni, mida nimetatakse 35 elemendiks ja 10 elemendiks (need järjestused paiknevad transkriptsiooni alguspunktist keskmiselt 35 ja 10 nukleotiidi kaugusel). 35 elemendis on konserveerunud (esinevad kõige sagedamini) nukleotiidid TTGACA, -10 elemendis aga TATAAT. DNA ahelate lahtisulamine transkriptsiooni initsiatsioonil hõlmab ka regiooni, kus paikneb A:T-rikas 10 element (DNA ahelad eralduvad teineteisest kergemini just A:T-rikastest piirkondadest!). 35 ja 10 heksameeride vaheline ala on enamasti 16-18 nukleotiidi ning selle nukleotiidne järjestus võib olla suvaline. Transkriptsiooni alguspunkt jääb 10 järjestusest 5-9 nukleotiidi allapoole. Valdavalt on esimeseks nukleotiidiks RNA ahelas (RNA molekuli 5´ otsas) puriin, seega kas adenosiin- või guanosiinnukleotiid.
on sigma70. See sigma faktor võimaldab ära tunda promootoreid, milles on konserveerunud kaks 6- nukleotiidset regiooni, mida nimetatakse 35 elemendiks ja 10 elemendiks (need järjestused paiknevad transkriptsiooni alguspunktist keskmiselt 35 ja 10 nukleotiidi kaugusel). 35 elemendis on konserveerunud (esinevad kõige sagedamini) nukleotiidid TTGACA, -10 elemendis aga TATAAT. DNA ahelate lahtisulamine transkriptsiooni initsiatsioonil hõlmab ka regiooni, kus paikneb A:T-rikas 10 element (DNA ahelad eralduvad teineteisest kergemini just A:T-rikastest piirkondadest!). 35 ja 10 heksameeride vaheline ala on enamasti 16-18 nukleotiidi ning selle nukleotiidne järjestus võib olla suvaline. Transkriptsiooni alguspunkt jääb 10 järjestusest 5-9 nukleotiidi allapoole. Valdavalt on esimeseks nukleotiidiks RNA ahelas (RNA molekuli 5´ otsas) puriin, seega kas adenosiin- või guanosiinnukleotiid.
A-saiti. Peptidüül-saidis e. P-saidis toimub aminohappe lisamine kasvavale polüpeptiidahelale. E-saiti (exit site) liigub tRNA, millelt aminohape on seotud polüpeptiidahelasse. Nende seondumissaitide põhiosa asub ribosoomi suures subühikus, samas kui mRNA (milles asuvad koodonid määravad ära, milline aminoatsüül-tRNA parasjagu mRNA-le seondub) on ribosoomi väikese subühiku koostises. 66. Võrrelge translatsiooni initsiatsiooni bakterites ja eukarüootses rakus. Translatsiooni initsiatsioonil bakteris osalevad: ribosoomi 30S subühik, mRNA, spetsiaalne initsiaator-tRNA, kolm initsiaatorfaktorit (valgud IF-1, IF-2, IF-3), GTP molekul Eukarüootides on translatsiooni initsiatsioon võrreldes bakterites toimuvaga komplekssem ja seda eeskätt initsiatsioonifaktorite rohkuse tõttu.Üldiselt on initsiatsiooniprotsess sarnane kuid on kaks erinevust: 1)Polüpeptiidahelasse esimesena lülitatava metioniini aminorühm ei ole blokeeritud formüülrühmaga;
Alternatiivne DNA replikatsioon Indutseeritud stabiilne DNA replikatsioon iSDR: Toimub rakkudes, kus on indutseeritud SOS vastus ning sõltub homoloogilisest rekombinatsioonist. iSDR algab nii oriC piirkonnast kui ka terC-st (oriM). Initsiatsiooniks vajaliku praimeri genereerimiseks toimub DNA rekombinatsioon, mille käigus tekib D-ling (3-st DNA ahelast moodustunud struktuur vaba 3´-OH otsaga. Limiteeriv faktor DNA replikatsiooni initsiatsioonil. GATC saitide metülatsioon oriC regioonis Bakteri DNA-s on A nukleotiid GATC järjestustes Dam metülaasi poolt metüleeritud. DNA replikatsiooni käigus jääb sünteesitud tütarahel mõneks minutiks metüleerimata. DnaA seondub ainult metüleeritud DNA-ga. oriC regioonis jäävad GATC saidid metüleerimata pikemaks ajaks kui mujal (30-40% rakutsükli ajast). Sel ajal on oriC assotsieerunud rakumembraaniga. Membraaniga seondumine on oluline ka kromosoomi
replikatsiooni käigus kromosoom ei lüheneks. DNA replikatsiooni origin'id on kohad kromosoomidel, kust alustatakse DNA sünteesi. DNA replikatsiooni eukarüootides iseloomustavad: palju replikatsiooni origin'e, millel üldjuhul puudub konsensus DNA järjestuse tasemel ning DNA sünteesi initsiatsiooni ajastus erinevatelt origin'idelt on erinev, nende kasutamine sõltub rakutüübist, organismi arengustaadiumist, kasvutingimustest ning epigeneetilistest faktoritest. Replikatsiooni initsiatsioonil on eriti olulised kaks valgukompleksi: ORC (origin recognition complex) ja MCM (minichromosomal maintenance). ORC seondub origin'ile ja koos teiste valkudega moodustab pre- replikatsioonikompleksi (pre-RC). Selleks, et origin funktsionaalseks muutuks, on vaja, et sinna seonduks MCM kompleks. MCM on replikatiivne DNA helikaas, MCMi toomine origin'ile = replication licensing. Pärast veel mitmete valkude seondumist selle kompleksiga
osaliselt fosforüleeritud CTD-sse (RNA polümeraasi c- terminaalne domeen) i. Sabas on 52 tandemina esinevat 7AH järjestust, isasühes 2Ser. 2. Splaissingu valgud lisatakse CTD kaudu, nende kinnitumiseks on oluline CTD fosforüülitus (toimus transkriptsiooni initsiatsioonil!) i. Nende seondumist soodustab CTD fosforüülitus 3. CTD-ga on seotud ka 3’ otsa protsessimine. Polümeraas saab uude transkriptsiooni siseneda, kui kogu CTD on defosforüleeritud. Ainult täielikult defosforüleeritud RNA polümeraas II on võimeline alustama RNA sünteesi 4
35 Erinevalt bakterirakust toimuvad eukarüootses rakus transkriptsioon ja translatsioon nii ajaliselt kui ka ruumiliselt lahus. Bakterirakus algab translatsioon kohe kui konkreetse mRNA transkriptsioon on lõpule jõudnud. 64. Ribosoomide ehitus prokarüootses ja eukarüootses rakus. Ribosoomid koosnevad suurest ja väikesest subühikust, milles sisalduvad rRNA ja valgud. Ribosoomi alaosad eralduvad teineteisest, kui mRNA molekul on transleeritud ja ühinevad uuesti translatsiooni initsiatsioonil. Ribosoomide kolmemõõtmeline struktuur on üldjoontelt sarnane kõigis elusorganismides. PROKARÜOOTNE RAKK Bakterirakus asuvad ribosoomid on suurusega 70S väike subühik (30S): 16S rRNA molekul + 21-st erinevat polüpeptiidi. Suur subühik (50S): 2 RNA molekuli + 31 erinevat polüpeptiidi. EUKARÜOOTNE RAKK Eukarüootide tsütoplasmas asuvad ribosoomid on suurusega 80S. väikesest subühik (40S): 18S RNA + 33 erinevat polüpeptiidi suurest subühik (60S): 3 rRNA + 49 polüpeptiidi. 65
koodoneid ja mis algab initsiaator-koodoniga ning lõpeb stop-koodoniga Initsiaator-koodonile eelneb ribosoomi sidumispiirkond RBS (ribosome binding site) ehk Shine-Dalgarno järjestus. RBS (4-7 NA) on komplementaarne ribosoomi väiksema subühiku RNA (16S rRNA) 3' otsaga. Paikenb AUG koodonist 5-7 nukleotiidi eespool 10. RBS (Shine Dalgarno järjestus vs Kozaki järjestus), translatsiooni initsiatsioon, eukarüoodi ja prokarüoodi võrdlus Initsiatsioon: Valgusünteesi initsiatsioonil osalevad lisaks ribosoomidele initsiatsioonifaktorid, initsiaator-tRNA ja GTP. Bakteriaalne initsiatsioon: · ·IF1 ja IF 3 koos ribosoomi väikese subühikuga ja fMet-tRNAi seondub mRNAle-RBSile (Shine-Dalgarno sequence) 70S initsiatsioonikompleks saavutatakse kui IF2 vahendatud GTP hüdrolüüsi energia arvelt viiakse kokku väike ja suur alaühik. Shine-Dalgarno järjestus ( Shine-Dalgarno box), on ribosomaalne
annaabi.ee 
