Teine oluline regulatsiooni mehhanism on RBSi kättesaadavus ribosoomidele. Kui mRNA moodustunud sekundaarstruktuur, siis pole sait vaba. Siin on oluline roll teistel miRNAdel ja valkudel, mis võivad mRNAga seonduda ja selle konformatsiooni muuta. Initsiatsiooni koodoniks AUG, harva ka GUG. Ribosoomi 30S subühik ja mRNA moodustavad kompleksi IF3 juuresolekul. Metionüül-tRNAfMet interakteerub initsiatsiooni-faktoriga IF-2. Täielik initsiatsioonikompleks moodustub metionüül- tRNAfMet/IF-2 ning mRNA/30S subühik/IF-3 komplekside kombineerumisel IF-1 ja GTP juuresolekul. Enne 50S subühiku lisandumist vabaneb IF-3. 50S subühiku liitumisel 30S subühikuga tarbitakse GTP energiat ning kompleksist vabanevad IF-1, IF-2 ja GDP. Seejärel liigub metionüül-tRNAfMet ribosoomi peptidüül-saiti (P-saiti), olles seondunud antikoodoniga initsiaatorkoodonile AUG mRNA molekulil
· Seonduvad tekkinud kompleksiga TFIIE ja TFIIH Mediaatorkompleks transkriptsiooni koaktivaator, seostub RNA-polII C- terminaalse domääniga ning vahendab TF-dega; multiproteiinkompleks. 13. PolI ja PolIII-sõltuv transkriptsioon. Mille poolest need erinevad PolII- sõltuvast transkriptsioonist? Erinevalt PolII-st ei vaja teised transkriptsiooni initsiatsiooniks ATP hüdrolüüsi ensüümi. PolI sõltuv transkriptsioon rRNA: PolI initsiatsioonikompleks saab alguse kui multimeerne ülesvoolu aktivatsiooni-faktor (UAF) seondub ülesvoolu elemendiga. Kaks USFi alaühikut on histoonid, mis arvatavasti võtavad osa DNA seondumisel. Järgmisena seondub trimeerne tuumikfaktor koos TBPga, mis omakorda seondub nii UAFiga kui tuumik-faktoriga. Viimasena seondub PolI-Rrn2p kompleks juba ees olevate valkudega startsaidi lähedusse. Inimese rakkudes on TBP seotud kolme teise polüpeptiidiga, moodustades initsiatsiooni
Translatsiooni initsiatsioon sündmused, mis eelnevad peptiidsideme moodustumisele sünteesitava polüpeptiidi kahe esimese aminohappe vahel Bakteris: ribosoomid on jaotunud kaheks alaühikuks 30s ja 50s. Initsiaatorkoodon mRNA molekulis on AUG koodon. Ribosoomi 30s subühik ja mRNA moodustavad kompleksi IF3 juuresolekul. Metionüül-tRNA inaktiveerub initsiatsioonifaktoriga. Täielik initsiatsioonikompleks moodustub metionüül-tRNA ning mRNA/30s subühik/IF3 komplekside kombineerumisel IF1 ja GTP juuresolekul. Enne 50s subühiku lisandumist vabaneb IF3 50s subühiku liitumisel 30s subühikuga tarbitakse GTP energiat ning kompleksist vabanevad IF1, IF2 ja GDP. Seejärel liigub metionüül- tRNA ribosoomi P-saiti, olles seondunud antikoodoniga initsiaatorkoodonile AUG mDNA molekulil. Kui metionüül-tRNA on jõudnud P-saiti, on mRNA-s AUG kõrval
väikese subühiku koostises. 66)Võrrelge translatsiooni initsiatsiooni bakterites ja eukarüootses rakus. Kuna eukarüootides on initsiatsioonifaktoraid rohkem kui bakterites siis translatsiooni initsiatsioon on eukarüootides tunduvalt kompleksem. Üldiselt on initsiatsiooniprotsess sarnane kuid on kaks erinevust: 1)Polüpeptiidahelasse esimesena lülitatava metioniini aminorühm ei ole blokeeritud formüülrühmaga; 2)Initsiatsioonikompleks moodustub mRNA 5´-otsaga. Ei ole vaja spetsiifilist järjestust mRNA molekuli alguses, mis paarduks rRNA-ga ribosoomis, vaid initsiatsioonifaktorite hulgas on spetsiifiline valk CBP (cap-binding protein), mis seondub mRNA 5´-otsas oleva 7- metüülguanosiiniga ning edasi skanneerib initsiatsioonikompleks mRNA-d kuni esimese AUG koodonini. Seetõttu algab eukarüootides translatsioon enamasti esimeselt AUG koodonilt. Nii nagu
Initsiaatorkoodoniks mRNA molekulis on AUG koodon. Metionüül-tRNAtMet tunneb ära AUG initsiaator-koodoni ja viib ribosoomi formüülmetioniini – metioniini, mille aminorühm on blokeeritud formüülrühmaga. Eukarüoodis: initsiatsioon on kompleksem ja seda eeskätt initsiatsioonifaktorite rohkuse tõttu. 2 erinevust võrreldes bakteritega: 1) polüpeptiidahelasse esimesena lülitatava metioniini aminorühm ei ole blokeeritud formüülrühmaga. 2) initsiatsioonikompleks moodustub mRNA 5’ otsaga. Spetsiifiline valk CBP seondub mRNA 5’ otsas oleva 7-metüülguanosiiniga ning edasi skanneerib initsiatsioonikompleks mRNAd kuni esimese AUG koodonini. Enamasti algab eukarüootides translatsioon esimeselt AUG koodonilt. 67. Kirjeldage translatsiooni elongatsiooniprotsessi. 1) Aminoatsüül-tRNA seondub ribosoomi A-saiti, paardudes antikoodonjärjestuse kaudu parasjagu A-saidis asuva
ribosoomil. Avatud lugemisraam e valkukodeeriv järjestus - nukleiinhappe järjestus, mis sisaldab järjestikuseid aminohappeid kodeerivaid koodoneid ja mis algab initsiaator-koodoniga ning lõpeb stop-koodoniga. Initsiaator-koodonile eelneb ribosoomi sidumispiirkond RBS (ribosomebinding site) ehk Shine- Dalgarno järjestus. BAKTERIAALNE INITSIATSIOON: · IF1 ja IF 3 koos ribosoomi väikese subühikuga ja fMet-tRNAi seondub mRNAle-RBSile, 70S initsiatsioonikompleks saavutatakse kui IF2 vahendatud GTP hüdrolüüsi energia arvelt viiakse kokku väike ja suur alaühik. Shine-Dalgarno järjestus ( Shine-Dalgarno box), on ribosomaalne seondumissait, mis paikneb 6-7 nukleotiidi ülevalpool start koodonist. See on kuue aluseline konsensusjärjestus mis aitab ribosoomi väikesel subühikul õigesti positsioneeruda, kusjuures see toimub üle anti-Shine-Dalgarno järjestuse (CCUCCU) 16S rRNA-l EUKARÜOOTNE INITSIATSIOON toimub mRNA 5' otsa juures:
(palju AH'sid) E-sait ehk väljumissait sinna liigub tRNA, millelt AH on seotud polüpeptiidahelasse. 66. Võrrelge translatsiooni initsiatsiooni bakterites ja eukarüootses rakus. · Erinevused: Eukarüootides on rohkem initsiatsioonifaktoreid. Eukarüootides pole metioniini aminorühm blokeeritud formüülrühmaga. Eukarüoodil moodustub initsiatsioonikompleks mRNA 5'-otsaga spetsiifilise valgu CBP kaudu, initsiatsioonikompleks skanneerib mRNA-s kuni esimese AUG koodonini ning see tõttu algab translatsioon enamasti esimeselt AUG koodonilt. Prokarüootides on vaja mRNAs spetsiaalset RBS (ribosome binding site) järjestust AGGAGG, mis asub AUG koodonist 7 nukleotiidi kõrgemal. · Sarnasused üldjoontes on sama intsiatsiooniprotsess. :D 67
Translatsiooni initsiatsioonil bakteris osalevad: ribosoomi 30S subühik, mRNA, spetsiaalne initsiaator-tRNA, kolm initsiaatorfaktorit (valgud IF-1, IF-2, IF-3), GTP molekul Eukarüootides on translatsiooni initsiatsioon võrreldes bakterites toimuvaga komplekssem ja seda eeskätt initsiatsioonifaktorite rohkuse tõttu.Üldiselt on initsiatsiooniprotsess sarnane kuid on kaks erinevust: 1)Polüpeptiidahelasse esimesena lülitatava metioniini aminorühm ei ole blokeeritud formüülrühmaga; 2)Initsiatsioonikompleks moodustub mRNA 5´-otsaga. Ei ole vaja spetsiifilist järjestust mRNA molekuli alguses, mis paarduks rRNA-ga ribosoomis, vaid initsiatsioonifaktorite hulgas on spetsiifiline valk CBP (cap-binding protein), mis seondub mRNA 5´-otsas oleva 7-metüülguanosiiniga ning edasi skanneerib initsiatsioonikompleks mRNA-d kuni esimese AUG koodonini. Seetõttu algab eukarüootides translatsioon enamasti esimeselt AUG koodonilt. 67. Kirjeldage translatsiooni elongatsiooniprotsessi. 1
Seejärel Peptidüül- saidis e. P-saiti, kus toimub aminohappe lisamine kasvavale polüpeptiidahelale. Viimaks E- saiti (exit site) liigub tRNA, millelt aminohape on seotud polüpeptiidahelasse juba. 66. Võrrelge translatsiooni initsiatsiooni bakterites ja eukarüootses rakus. Kaks erinevust võrreldes bakteritega: 1. Polüpeptiidahelasse esimesena lülitatava metioniini aminorühm ei ole blokeeritud formüülrühmaga 2. Initsiatsioonikompleks moodustub mRNA 5´-otsaga 67. Kirjeldage translatsiooni elongatsiooniprotsessi. 1) Aminoatsüül-tRNA seondub ribosoomi A-saiti, paardudes antikoodonjärjestuse kaudu parasjagu A-saidis asuva koodonjärjestusega mRNA molekulis. Selleks peab aminoatsüül- tRNA olema assotsieerunud elongatsioonifaktoriga EF-Tu, mis on seotud GTP-ga. 2) Peptiidsideme moodustumine ribosoomi A-saidis asuva aminoatsüül-tRNA aminorühma ja
vahendusel 66. Võrrelge translatsiooni initsiatsiooni bakterites ja eukarüootses rakus. Eukarüootides on translatsiooni initsiatsioon võrreldes bakterites toimuvaga komplekssem ja seda eeskätt initsiatsioonifaktorite rohkuse tõttu. Üldiselt on initsiatsiooniprotsess aga sarnane, välja arvatud kaks erinevust: 1) Polüpeptiidahelasse esimesena lülitatava metioniini aminorühm ei ole blokeeritud formüülrühmaga. 2) Initsiatsioonikompleks moodustub mRNA 5´-otsaga. 36 Ei ole vaja spetsiifilist järjestust mRNA molekuli alguses, mis paarduks rRNA-ga ribosoomis, vaid initsiatsioonifaktorite hulgas on spetsiifiline valk CBP, mis seondub mRNA 5´-otsas oleva CAP otsaga ning edasi skanneerib initsiatsioonikompleks mRNA-d kuni esimese AUG koodonini. Seetõttu algab eukarüootides translatsioon enamasti esimeselt AUG koodonilt. 67. Kirjeldage translatsiooni elongatsiooniprotsessi.
Iga spetsiifiline aminoatsüül-tRNA- süntetaas tunneb ära teatud aminohappele vastavaid tRNA molekule. 65. Võrrelge translatsiooni initsiatsiooni bakterites ja eukarüootses rakus. Eukarüootides on translatsiooni initsiatsioon võrreldes bakterites toimuvaga komplekssem ja seda eeskätt initsiatsioonifaktorite rohkuse tõttu. Kaks erinevust: 1) Polüpeptiidahelasse esimesena lülitatava metioniini aminorühm ei ole blokeeritud formüülrühmaga; 2) Initsiatsioonikompleks moodustub mRNA 5'-otsaga. Sarnasused: 1) Mõlemal initsiaatorkoodon AUG. 2) Nii eukarüootides kui ka prokarüootides olemas spetsiifiline initsiaator-tRNA. 66. Kirjeldage translatsiooni elongatsiooniprotsessi. Kolm etappi: 1) Aminoatsüül-tRNA seondub ribosoomi A-saiti, paardudes antikoodonjärjestuse kaudu parasjagu A-saidis asuva koodonjärjestusega mRNA, olles assotsieerunud elongatsioonifaktoriga EF-Tu, mis on seotud GTPga. 2)
funktsionaalset kaotust pole. Tuleb leida üles õige lugemisraam ja alustada valgusünteesi sealt kohast, kus ta on ettenähtud algama – initsiatsiooni kõige tähtsam ülesanne. Translatsiooni initsiatsioonil osalevad mitmed initsiatsioonifaktorid: IF1, IF2, IF3. Initsiaatorkoodoni üles leidmisel osaleb Shine-Dalgarno (SD) järjestus, mis asub mRNA initsiaatorkoodoni ees. rRNA 3’ ots seondub SD järjestusega. Initsiaatorkoodoniks on AUG. Kui 30S initsiatsioonikompleks on paika saanud, siis lahkub sealt IF3 faktor ning järelejäänud kompleksiga ühineb suurem subühik, misjärel võib elongatsioon peale alata. AUG start-koodon on komplementaarne initsiaator-tRNA-ga (ehk fMet-tRNA, antikoodoniks 3’ – UAC – 5’, mis võimeline seega seondama AUG start-koodoniga). Initsiatsioonisaidi valik sõltub suuresti 30S subühiku omavahelisest interaktsioonist mRNA järjestusega. Elongatsioon
Juhtiva ja mahajääva DNA ahela süntees on väga täpselt koordineeritud protsess. Kogu replikatsiooniaparaati, mis liigub mööda DNA molekuli replikatsioonikahvlina, nimetatakse replisoomiks. Replisoom koosneb DNA polümeraas III holoensüümist, mille üks apoensüüm sünteesib juhtivat ahelat ja teine mahajäävat ahelat ning praimosoomist. DNA replikatsiooni initsiatsioon oriC-lt bakteris E. coli Algne initsiatsioonikompleks moodustub 20-30 DnaA monomeeri sidumisel. ATP juuresolekul toimub avatud kompleksi moodustumine, kusjuures DNA ahelate lahtikeerdumine algab kõige parempoolsemast 13-meerist. Seejärel moodustavad DnaB helikaas ja DnaC denatureerunud DNA-ga prepraimingkompleksi. SSB (üksikahelalise DNA-ga seonduv valk) ja güraasi (topoisomeraas II) juuresolekul jätkub DNA ahelate lahtikeerdumine mõlemas suunas. Järgneb praimeri süntees primaasi
Juhtiva ja mahajääva DNA ahela süntees on väga täpselt koordineeritud protsess. Kogu replikatsiooniaparaati, mis liigub mööda DNA molekuli replikatsioonikahvlina, nimetatakse replisoomiks. Replisoom koosneb DNA polümeraas III holoensüümist, mille üks apoensüüm sünteesib juhtivat ahelat ja teine mahajäävat ahelat ning praimosoomist. DNA replikatsiooni initsiatsioon oriC-lt bakteris E. coli Algne initsiatsioonikompleks moodustub 20-30 DnaA monomeeri sidumisel. ATP juuresolekul toimub avatud kompleksi moodustumine, kusjuures DNA ahelate lahtikeerdumine algab kõige parempoolsemast 13-meerist. Seejärel moodustavad DnaB helikaas ja DnaC denatureerunud DNA-ga prepraimingkompleksi. SSB (üksikahelalise DNA-ga seonduv valk) ja güraasi (topoisomeraas II) juuresolekul jätkub DNA ahelate lahtikeerdumine mõlemas suunas. Järgneb praimeri süntees primaasi
1-ne tRNA on tRNAfMet (formuul-metionuul-tRNA). Internaarselt tRNAMet, millel sama metioniini AUG koodon. tRNAfMet-ga seondub IF-2 ja samal ajal moodustub IF-3/mRNA/30S alauksuse kompleks. Need kompleksid uhendatakse IF-1 ja GTP abil 30S initsiatsiooni kompleksiks. IF-3 vabaneb ja uhineb suur 50S alauksus, millele jargneb IF-1ja IF-2 vabanemine ja GTP energia kasutamine (tekib GDP). Initiation codon: AUG ja GUG. Shine-Dalgarno järjestus: a) prokarüootidel mRNA/30S ribosoomi alaüksuse initsiatsioonikompleks b) komplementarne järjestus 16S rRNA 3' terminuse ja mRNA 3'algusjärjestuse (parast initsiatsioonisaiti) vahel. 127. Translatsiooni elongatsioon prokarüootidel. Elongatsioonifaktorid. Translokaas. 3 etappi: 1.aminoatsuul-tRNA seondumine A saiti. Elongatsioonifaktor Tu koos GTP-ga (EF-Tu.Gtp), GTP vajalik aminoatsuul-tRNA seondumiseks A saiti. Parast peptiidsideme teket ja GTP hüdrolüüsi EF-Tu.GDP vabaneb. EF-Tu.GDP regenereeritakse elongatsioonifaktoriga EF-Ts 2
mRNA kodeerivas järjestuses on Shine-Dalgarno väga haruldane. Kõik komponendid võivad seostuda enne mRNA seostumist. Kui translatsioonifaktorid on seondunud, siis peab fMet-tRNA ka olemas olema ja seostub väiksema subühikuga. Toimub koodon- antikoodon interaktsioon. Moodustub kaheahelaline RNA, mis saab 50S subühikuga seonduda. fMet-tRNA läheb otse P-saiti, kõik teised lähevad läbi A-saidi. Kui kompleks on korrektselt moodustunud, siis kõik faktorid vabanevad ja tekib 70S initsiatsioonikompleks, kus initsiaatorkoodon paigas. Bakteritel on kaks konserveerunud initsiatsioonifaktorit (IF), mõnel on kolm IF-i. IF-2 on suur valk, IF-1 ja IF-3 väikesed. IF-2 ja IF-3 esinevad kõigil bakteritel IF-1 kiirendab IF-de seostumist 50S-ga. Aitab tRNA-l P-saiti ja blokeerib A-saidi. IF-2: (GTP-fMet-tRNA) - seob GTP juuresolekul initsiaator-tRNA-d (bakterites on fMet-tRNA fmet). Juhendab initsiaator-tRNA P-saiti. - seondub ribosoomi väikse subühikuga ja moodustub stabiilne kompleks.
24. Kirjelda transkriptsiooni tsükli osasid ja RNA polümeraasi tööd Transkriptsioonitsükkel 1. RNA polümeraas ja sigmafaktor seondub promootoriga 2. DNA lahti harutamine 3. Initsiatsioon- transkriptsioonifaktorid vahendavad RNA polümeraasi seondumist ja transkriptsiooni initsiatsiooni, ehk alles pärast kindla transkriptsioonifaktori ühendumist promootorjärjestusele seondub RNA polümeraas sellele. Tulemuseks on initsiatsioonikompleks (transkriptsioonifaktorid ja RNA polümeraas) 4. Elongatsiooni algus 5. Elongatsioon e pikendamine- DNA ahelalt komplementaarse RNA ahela sünteesimine RNA polümeraasi abil 6. Terminatsiooni signaal destabiliseerib polümeraasi- sünteesi lõpp 7. RNA eraldumine RNA polümeraasi ehk holoensüümi töö ● RNA polümeraas katalüüsib ribonukleotiidide sidemeid ● RNA polümeraas liigub DNA molekulil 5’ --> 3’ suunas, harutades samal ajal lahti DNA molekuli
Paikenb AUG koodonist 5-7 nukleotiidi eespool 10. RBS (Shine Dalgarno järjestus vs Kozaki järjestus), translatsiooni initsiatsioon, eukarüoodi ja prokarüoodi võrdlus Initsiatsioon: Valgusünteesi initsiatsioonil osalevad lisaks ribosoomidele initsiatsioonifaktorid, initsiaator-tRNA ja GTP. Bakteriaalne initsiatsioon: · ·IF1 ja IF 3 koos ribosoomi väikese subühikuga ja fMet-tRNAi seondub mRNAle-RBSile (Shine-Dalgarno sequence) 70S initsiatsioonikompleks saavutatakse kui IF2 vahendatud GTP hüdrolüüsi energia arvelt viiakse kokku väike ja suur alaühik. Shine-Dalgarno järjestus ( Shine-Dalgarno box), on ribosomaalne seondumissait, mis paikneb 6-7 nukleotiidi ülevalpool start koodonist. See on kuue aluseline konsensusjärjestus mis aitab ribosoomi väikesel subühikul õigesti positsioneeruda, kusjuures se toimub üle anti-Shine- Dalgarno järjestuse (CCUCCU) 16S rRNA-l Eukarüootne initsiatsioon toimub mRNA 5' otsa juures:
Enne replikatsiooni initsiatsiooni on transkriptsioon mioC-lt inhibeeritud. mioC promootor ei kontrolli replikatsiooni initsiatsiooni. Transkriptsioon gidA promootorilt toimub nii enne kui ka replikatsiooni initsiatsiooni käigus. Transkriptsioonist tingitud negatiivne superspiralisatsioon soodustab DNA lahtikeerdumist AT-rikkast 13-meersest DNA järjestusest. Pärast replikatsiooni initsiatsiooni on gidA transkriptsioon pärsitud, sest vastav DNA regioon on seotud rakumembraaniga. Algne initsiatsioonikompleks moodustub 20-30 DnaA monomeeri sidumisel. ATP juuresolekul toimub avatud kompleksi moodustumine, kusjuures DNA ahelate lahtikeerdumine algab kõige parempoolsemast 13-meerist. Seejärel moodustavad DnaB ja DnaC denatureerunud DNA-ga prepraimingkompleksi. SSB (üksikahelalise DNA-ga seonduv valk) ja güraasi juuresolekul jätkub DNA ahelate lahtikeerdumine mõlemas suunas. Järgneb praimeri süntees DnaG poolt, DNA polümeraas III
Enne replikatsiooni initsiatsiooni on transkriptsioon mioC-lt inhibeeritud. mioC promootor ei kontrolli replikatsiooni initsiatsiooni. Transkriptsioon gidA promootorilt toimub nii enne kui ka replikatsiooni initsiatsiooni käigus. Transkriptsioonist tingitud negatiivne superspiralisatsioon soodustab DNA lahtikeerdumist AT-rikkast 13-meersest DNA järjestusest. Pärast replikatsiooni initsiatsiooni on gidA transkriptsioon pärsitud, sest vastav DNA regioon on seotud rakumembraaniga. Algne initsiatsioonikompleks moodustub 20-30 DnaA monomeeri sidumisel. ATP juuresolekul toimub avatud kompleksi moodustumine, kusjuures DNA ahelate lahtikeerdumine algab kõige parempoolsemast 13-meerist. Seejärel moodustavad DnaB ja DnaC denatureerunud DNA-ga prepraimingkompleksi. SSB (üksikahelalise DNA-ga seonduv valk) ja güraasi juuresolekul jätkub DNA ahelate lahtikeerdumine 71 mõlemas suunas
annaabi.ee 
