34.DNA kloonimise mõiste Isepaljunevad süsteemid DNA kloonimiseks DNA kloonimise all mõistame teatud DNA lõigu paljunemist .Selleks kasutatakse isepaljunevaid süsteeme või polümeraas- ahelreaktsiooni. Isepaljunevate süsteemidena kasutatakse bakterite plasmiide või viiruseid-bakteriofaage.Vajalik DNA lõik ühendatakse vektoriga ja moodustunud rekombinaat-DNA viiakse bakteri rakku , kus vektor asub paljunema tootes lühikesevajaga miljoneid koopiaid meid huvitavast DNA fragmendist. 35.Polümeraas-ahelreaktsioon (PCR). PCR vajaminevad põhikomponendid. PCR põhietapid. Milleks kasutatakse PCRi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni läbiviimiseks on eelnevalt vajalik teada uuritava DNA lõigu otste nukleotiidset järjestust, mille alusel disainida praimerid, mis on tavaliselt kuni 30 oligonukleotiidi pikkused. Reaktsioonis (PCRis) kasutatavad komponendid (maatriks DNA, praimerid, ensüüm ja vabad nukleotiidid)
moodustumisega, gaasi eraldumisega või muude silmaga nähtavate muutuste toimumisega. 1.1 Valkude reaktsioonid 1.1.1 Biureedireaktsioon Reaktsioon toimub, kui aine sisaldab vähemalt kahte peptiidsidet. Leeliselises keskkonnas annab valk Cu(II) ioonidega sinakasvioletse, valgu mittetäieliku hüdrolüüsi produktid aga roosa värvusega biureedikompleksi. Cu2+ ioonid seostuvad nelja peptiidsideme koostisesse kuuluva lämmastiku aatomiga, kaks kummastki polüpeptiidahelast või selle fragmendist. Töö käik: 1 ml munavalgu lahusele lisati 1 ml 10% NaOH lahust ja mõni tilk 1% CuSO4 lahust. Tulemus: CuSO4 lisamisel muutus lahus lillakaks Järeldus: Munavalgu lahuses esinesid peptiidsidemed 1.1.2 Ksantoproteiinreaktioon (Mulderi reaktsioon) Reaktsioon näitab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Phe, Trp, Tyr) esinemist valgus. Lämmastikhappe mõjul valk denatureerub. Soojendamisel toimub aromaatsete tuumade
DNA eralduse protsess Purusta rakud, Lisa soolalahus, et DNA viia lahusesse, Lisa orgaaniline lahus (kloroform), et valgud ja rasvad eralduks. Tsentrifuugi ja eralda vesifaas. Lisa alkohol ja DNA sadestub välja Resttriktsiooniensüümid tunnevad ära konkreetsed kohad ja lõikavad DNA molekuli vaid sealt -Käärid. Lõikamismuster võimaldab võrrelda kahte taime ja leida ühisosasid või mutatsioone. PCR- polümeraasi ahelreaktsioon, võimaldab luua ühest DNA fragmendist tuhandeid koopiaid. (Kary Mullis). Geelelektroforees- Võimaldab eraldada DNA molekule suuruse järgi DNA on negatiivse laenguga ja seega liigub positiivse elektroodi poole. Mida suurem on DNA fragment, seda aeglasemalt see liigub geelis. Etiidium bromiid geelis võimaldab DNA värvida silmale nähtavaks (UV valguse all) Southern blot- Edwin Southern Testib, kas sisestatud geen on terve ja ühes tükis, õiges suunas ja koopia arvu. DNA kodeeriva
reaktsioon 1.1.1 Biureedireaktsioon Kui ühendis on enam kui kaks peptiidsidet, moodustavad nad aluselises keskkonnas Cu2+ ioonidega violetse kompleksi. Üldreakstsioon ongi biureedireaktsioon just seepäerast, et on tingitud peptiidsidemete esinemisest. Biureetkompleksi värvus on tingitud Cu2+ioonide koordinatiivsest seostumisest nelja peptiidsidemete koostisse kuuluva lämmastiku aatomiga, kaks kummastki polüpeptiidahelast või selle fragmendist. Värvuse intensiivsus sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses. Töö käik: · valan katseklaasi 1ml munavalgu lahust · lisan 1ml 10%-list NaOH lahust, et reaktsioonikeskkond oleks aluseline · mõni tilk 1%-list CuSO4 lahust ja loksutan - tekib lilla värvus Lahus värvub lillaks, sest tekib biureetkompleks. 1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon)
teatud aminohapetele valgu molekulis või vastavas lahuses. 1.1.1 Buireedireaktsioon Biureedireaktsiooni annavad kõik ained, mis sisaldavad vähemalt kahte peptiidsidet. Leeliselises keskkonnas annab valk Cu(II)ioonidega sinakasvioletse värvuse, valgu mittetäieliku hüdrolüüsi produktid aga roosa värvusega biureedikompleksi. Cu2+ ioonid seostuvad nelja peptiidsideme koostisesse kuuluva lämmastiku aatomiga, kaks kummastki polüpeptiidahelast või selle fragmendist. Struktuur? Töö käik: Katseklaasi valatakse 1 ml munavalgu lahust. Lisatakse 1 ml 10%- list NaOH lahust ja mõni tilk 1%-list CuSO4 lahust. Katseklaasi sisu loksutatakse hoolikalt. Tulemus: CuSO4 lisamisel muutus lahus lillaks. Järeldus: Segu värvus violetseks ja sellest võib järeldada, et lahus sisaldas kaht või enamat pepiidsidet, mis moodustasid aluselises keskonnas Cu2+-ioonidega violetse kompleksi. 1.1.2 Mulderi reaktsioon.
Kuna biureedireaktsioon on tingitud peptiidsidemete esinemisest, siis on ta valkude üldreaktsioon. Leeliselises keskkonnas moodustavad Cu2+-ioonid valgumolekulidega sinakasvioletse, lühikese ahelaga peptiididega (valgu hüdrolüüsi produktidega) aga roosa värvusega biureetkompleksi. Kompleksi värvus on tingitud Cu2+-ioonide koordinatiivsest seostumisest nelja peptiidsidemete koostisse kuuluva lämmastiku aatomiga, kaks kummastki polüpeptiidahelast või selle fragmendist. Kompleksi värvuse intensiivsus sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses. Vaadake uuest juhendist katse teooriat. Biureet ei moodustu ainult peptiidsideme hapnikutega. Töö käik: Katseklaasi valan 1 ml munavalgu lahust. Lisan 1 ml 10% NaOH, mõni tilk 1% CuSO 4 lahust ja loksutan. Tulemus: Pärast ainete segamist lahuse värmus muutus violetseks.See tähendab ,et lahusel on aluseline keskkond,lahus sisaldab valku,mis koosneb rohkem,kui kahest peptiidsidemest. 2
Kuna biureedireaktsioon on tingitud peptiidsidemete esinemisest, siis on ta valkude üldreaktsioon. Leeliselises keskkonnas moodustavad Cu2+-ioonid valgumolekulidega sinakasvioletse, lühikese ahelaga peptiididega (valgu hüdrolüüsi produktidega) aga roosa värvusega buiretkompleksi. Kompleksi värvus on tingitud Cu2+-ioonide koordinatiivsest seostumisest nelja peptiidsidemete koostisse kuuluva lämmastiku aatomiga, kaks kummastki polüpeptiidahelast või selle fragmendist. Kompleksi värvuse intensiivsus sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses. Töö käik Valasin katseklaasi ~1 ml munavalgu lahust ja lisasin sama kogustl 10%-list NaOH lahust ja 4 tilka 1%-list CuSO4 lahust. Loksutasin hoolikalt. Töö tulemus Lahuse värvus muutus lillaks, mis tähendab, et vase ioonide kordinatiivne seostumine 4 lämmastikkudele peptiidsidemete koostises. Saame teha järeldusi, et lahuses meil oli valk. 1.1
· Difteeria 15. Difteeria epidemioloogia · Levib piisknakkuse või kontakti teel. · Ohtlik lastehaigus, kuid ka täiskasvanud haigestuvad. · Eestis taastus haigestumine difteeriasse 90-datel aastatel. · Maailmas järs tõus 90-date alguses, eriti NIS riikides 16. Olulisemad difteeriatekitajal esinevad virulentsusfaktorid Difteeria eksotoksiin - termolabiilne, polüpeptiid. Mürgisuse poolest botulismi ja teetanuse eksotoksiinide järel 3. kohal. Koosneb A ja B fragmendist. Fragment B tunneb rakkudel ära retseptorid ja seob toksiini rakuga. Fragment A inhibeerib valgu sünteesi käigus ribosoomil polüpeptiidahela pikenemist määravat EF2 faktorit. Valgusünteesi lõppemine põhjustab nekroosi ja neurotoksilise toime. 17. Difteeria patogenees Mikroobil puuduvad invasiivsed omadused. Koloniseerivad lokaalselt, tavaliselt kurgus ja nina- neelus. Tekib lokaalsest ärritusest, punalibledest ja fibriinist spetsiifiline katta ehk pseudomembraan.
Plasmiid rongakujuline kaheahelaline DNA molekul, mis sisaldab autonoomset paljunemist voimaldavaid geneetilisi elemente (eelkoige replikatsiooni alguspunkti), selektiivset markerit (ampitsilliinile resistentsust tagavat geeni) ja unikaalseid restriktaaside loikamiskohti (esinevad plasmiidis ainult uks kord). Vajalik DNA-loik uhendatakse vektoriga ja moodustunud rekombinant-DNA viiakse bakteri rakku, kus vektor asub paljunema tootes luhikese ajaga miljoneid koopiaid meid huvitavast DNA-fragmendist. Plasmiidide abil geeni paljundamise pohietapid on jargmised 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "loikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni voi DNA-loigu "valjaloikamine" kromosoomist sama restriktaasiga s.o geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille kaigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6)
vastavat DNA polümeraasi. Ühe sekveneerimise tsükli kohta liidetakse üks komplementaarne nukleotiid, loetakse ära sellega seotud fluorestsentsmärge 8 ning siis eemaldatakse antud fluorofoor ja blokaatorgrupp. SOLID tehnoloogia põhineb sünkroonsetes ligeerimistsüklites. SOLID tehnoloogia kasutab DNA amplifitseerimises emulsioon- PCR meetodit. DNA fragmentide raamatukogu valmistatakse mikrokuulidel. PCR-i lõpptulemusena on iga kuulike kaetud tuhandete koopiatega algsest fragmendist. Seejärel vastavalt rakendusele asetatakse kuulid klaaspinnale. Fluorestsentsvalgus eraldub alles siis kui üksikahel ligeeritakse olemasoleva fragmendiga. SOLiD kasutab samuti nelja värviga fluorestsentsmarkeerimist, et kaardistada võimalike nukleotiidide kombinatsioone Miks on oluline teada organismide genoomide täispikki järjestusi? Selle abil on võimalik koostada evulutsiooni puid või arendada välja kindlaid mehhanisme sihtivaid ravimeid
DNA kloonimise all môistame teatud DNA lôigu paljundamist. Selleks kasutatakse isepaljunevaid süsteeme vôi polümeraas-ahelreaktsioooni. Isepaljunevate süsteemidena (nimetatakse ka vektoriteks) kasutatakse tavaliselt baketerite plasmiide vôi viiruseid- bakteriofaage. Vajalik DNA-lôik ühendatakse vektoriga ja moodustunud rekombinant-DNA viiakse bakteri rakku, kus vektor asub paljunema tootes lühikese ajaga miljoneid koopiaid meid huvitavast DNA-fragmendist. 5. Mis on plasmiid? Plasmiid on kaksikspiraalne DNA rõngasmolekul, mille molekulmass varieerub küllaltki 125 suurtes piirides. Plasmiidid asuvad vabalt tsütoplasmas või on liitunud kromosoomiga. 6. DNA kloonimise põhietapid isepaljunevas süsteemis. Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga;
1. Peremeesorganismi ja kloonimisvektori valik. 2. Vektor DNA ettevalmistamine. 3. Kloonitava DNA ettevalmistamine. 4. Rekombinantse DNA sünteesimine ligatsiooni abil. 5. Rekombinantse DNA sisestamine peremeesorganismi → hakkab seal paljunema. 6. Rekombinantide selekteerimine (need, mille rakud on vastu võtnud + paljundanud) 7. Rekombinantide analüüsimine Rekombinantne DNA – DNA molekul, mis on kunstlikult kokku pandud mitest erinevast DNA fragmendist, mis pärinevad sageli erinevatest organismides. Selle DNA tegemise eesmärgiks luua DNA molekul, mida vabas looduses ei leidu ja millel on mingid uued omadused. Selle kombineerumine on võimalik, kuna kõikidel organismidel on DNA keemiline struktuur täpselt sama ja nende DNA erineb vaid nukleotiidse järjestuse poolest. 42. Mis on cDNA? Ehk komplementaarne DNA, mis on sünteesitud üheaheliselt RNA-lt (pöördtranskriptaas).
otsas. Rakukehas graanulid (volutiinterad ehk BabesErnsti kehakesed). Mikroobid üksteise suhtes nurgeti "L" või "V" tähed, hieroglüüfe. Füsioloogia § Aeroobsed bakterid. Katalaas-positiivsed. Lõhustavad süsivesikuid. Nõudlikud söötmete suhtes. Vajalik telluriit. Resistentsed kuivamisele. Difteeria toksiin § Difteeria eksotoksiin - termolabiilne, polüpeptiid. Mürgisuse poolest botulismi ja teetanuse eksotoksiinide järel 3. kohal. Koosneb A ja B fragmendist. § Fragment B tunneb rakkudel ära retseptorid ja seob toksiini rakuga. § Fragment A inhibeerib valgu sünteesi käigus ribosoomil polüpeptiidahela pikenemist määravat EF2 faktorit. Valgusünteesi lõppemine põhjustab nekroosi ja neurotoksilise toime. § Difteeriatoksiini teket määrab "tox" geen, mis asetseb lüsogeensetes difteeriatekitajates - saadakse bak-teriofaagilt (B-korünefaag). Letaalne doos 13 mg/kg. Patogenees Mikroobil puuduvad invasiivsed omadused. Koloniseerivad
Endla Tegova oli õpetaja, romaan "Humala aias" Enno Käo illustraator, lasteraamatud Jaanus Tamm luulekogu "Öö" Tarmo Teder novellist Kadri Tüür Jaan Oks Ratlast 1884-1918 novellid, varase Gailiti moodi, reaalsus. Peateemaks küla oma elu ja inimestega. Ilmekamaid proosateoseid on "Tume inimeselaps" (1912), mis 2 ilmus ka Noor-Eesti IV albumis, koosneb 10 üsna lühikesest fragmendist, milles võtab kuju traagiline lugu erksa vaimuga 10aastasest poisist, kes vabadust ihates põgeneb korduvalt metsa, kus sureb lõpuks nälga. Teose sümbolistlik maailmapilt koos teema ja tegelastega uusromantismile iseloomulik teos, sarnane Tuglase novellidele. Küla on vaevalist inimelu üldistav sümbol. Eriline kirjutuslaad- palju mõttelünki ja stiilivaheldust, palju lüürilist ja arutlevat esitluslaadi. Vaino Vahing
ilukirjanduse erinevad tekstid, siis Undil on selles romaanis just teaduskirjandusega seonduvat materjali kasutatud. See on justnimelt fragmentaarsele postmodernistlikule proosale maailma plaanis suhteliselt omane. Modernistlik tekst a la Joyce, ,,Ahermaa", siis ka neis palju viteid ja vihjeid, kuid modernism mängib paljuksi humanitaariast või ilukirjanudsest pärit tekstidega; postmodernismis aga palju teaduslikke tekste. See oli ka ilusti sellest fragmendist märgata - kaktuseloetelude, kaktuste uuringud. 3. Reaalsuse kahtluse alla seadmine, tõepära ja fiktsiooni keeruliste suhete välja toomine. Keel osutub kirjaniku jaoks selliseks keskkonnaks, kust ta välja ei pääse. Keel dikteerib kirjanikule tema käitumist. Keeles peituvate allkeelte probleem meil on üks suur nähtus, mida nimetame keeleks, mis aga iseenesest koosneb ju allkeeltest, dialektidest, erinevatest diskursustest, kõnelemisviisidest
DNA kloonimise all môistame teatud DNA lôigu paljundamist. Selleks kasutatakse isepaljunevaid süsteeme vôi polümeraas-ahelreaktsioooni. Isepaljunevate süsteemidena (nimetatakse ka vektoriteks) kasutatakse tavaliselt baketerite plasmiide vôi viiruseid- bakteriofaage. Vajalik DNA-lôik ühendatakse vektoriga ja moodustunud rekombinant-DNA viiakse bakteri rakku, kus vektor asub paljunema tootes lühikese ajaga miljoneid koopiaid meid huvitavast DNA-fragmendist. 50 Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga s.o geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi
Kuna biureedireaktsioon on tingitud peptiidsidemete esinemisest, siis on ta valkude üldreaktsioon. Leeliselises keskkonnas moodustavad Cu2+-ioonid valgumolekulidega sinakasvioletse, lühikese ahelaga peptiididega (valgu hüdrolüüsi produktidega) aga roosa värvusega biureetkompleksi. Kompleksi värvus on tingitud Cu2+-ioonide koordinatiivsest seostumisest nelja peptiidsidemete koostisse kuuluva lämmastiku aatomiga, kaks kummastki polüpeptiidahelast või selle fragmendist. Kompleksi värvuse intensiivsus sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses. Töö käik Katseklaasi valatakse 1 ml munavalgu lahust. Lisatakse 1 ml 10%-list NaOH lahust ja mõni tilk 1%-list CuSO4 lahust. Katseklaasi sisu loksutatakse hoolikalt. Reaktsiooni kiirendamiseks võib katseklaasi vesivannil soojendada. Jälgitakse reaktsioonisegu värvuse muutumist ja selgitatakse nähtust.
annaabi.ee 
