indutseerib valgu konformatsiooni muutuse või allosteerilise transitsiooni, mis mõjutab valgu aktiivsust - (RNA) primaartranskript - Basaalsed transkriptsioonifaktorid Valgud nimega transkripstioonifaktorid abistavad RNA polümeraasi ja reguleerivadtema funktsiooni. vajatakse igas transkriptsiooni. - Modulatoorsed transkriptsioonifaktorid - Valgud nimega transkripstioonifaktorid abistavad RNA polümeraasi ja reguleerivadtema funktsiooni. Võimaldavad ekspresseerida erinevaid geene erineval ajal ja erinevas koes. - Ciselemendid aktiveerivad elemendid, DNA ahela signaaljärjestused (peamiselt promootorpiirkonnas), funktsioneerivad DNA ahela osas, milles paiknevad, seostamissaitidena. - Transfaktorid - aktiveerivad faktorid. Regulaatorvalgud, mille sünteesi määravad kaugemalasuvad geenid; valgud peavad migreeruma oma mõjukohtadesse DNA järjestuses, et aktiveerida RNA polümeraasi. - Transkriptsiooni promootorala
GTAGGGTCATGATAATCAGGGAACTGATGACTAATAAACTGCATTGTCATTGCGCTTTTACCAA CTCCCCCTGCTCCCAGCATTACCACCTTGTACTCTCTGGACCCGCCTGATGCGCTGCCCGGGG AGCAGCTGGCTTCATTTTCTACCTCGGATCC 70. 71. 72. 73. Plasmiidse DNA edasine kasutus 74. Olenevalt sellest, millisteks katseteks uuritavat järjestust vaja on, toimub edasine kloneerimine. Kui tegu on valku kodeeriva DNA järjestusega, mida soovitakse ekspresseerida mõnes eukarüootses rakus või rakuliinis, siis tõstetakse lihtsasse bakteriaalsesse kloneerimisvektorisse sisestatud järjestus edasi mõnda ekspressiooni vektorisse. Selline vektor sisaldab vajalikke järjestusi valgu ekspressiooniks rakkudes, aga ka bakteris paljundamist võimaldavaid elemente, kuid millesse kloneerimine otse PCR-ist oleks liiga tülikas. Seega restrikteeritakse esialgsest bakteriaalsest vektorist soovitud järjestus uuesti
on tühikud. Suurte geenide süntees: rohkem kui 1000bp. Kogu geeni võib moodustada mitmetest oligonukleotiididest, millest 4-6 on omavahel kattuvad (overlapping). Fill-in meetod over-lapping oligonucleotides: Kaks 60-80 mer oligonukleotiide võib sünteesida overlapping otstega. 19. Kirjelda detailselt, kuidas on võimalik, kasutades kahte kattuvat oligonukleotiidi ja fill-in meetodit, konstrueerida sünteetiline geen ning see kloonida, sekveneerida ja ekspresseerida E.colis. Kuidas erinevaid etappe analüüsitakse? Oligonukleotiide sünteesitakse keemiliselt nii, et nenda otsad kattuksid omavahel. Nii need oligonukleotiidsed ahelad seovad omavahel ning kasutades DNA polümeraasi I ja Klenow fragmenti, dNTP olemasolul võib sünteesida kaksikahelat. Seda sünteetilist järjestus amplifitseeritakse PCR abil, lisades praimeri (forward ja reverse), Mg (katalüsaator), dNTP-d, Taq polümeraasi (teostab sünteesi kõrgel temperatuuril)
• uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul) • eukarüootset promootorit (CMV, SV40) ja polüadenüleerimisjärjestust(SV40) Sageli ka: • reportergeeni (GFP, lacZ jt.) järjestus • märgise järjestus(FLAG, myc, V5, GFP) • selektsioonimarkeri ekspressioonikasset Praktikumis on kasutusel pEGFP (enhanced green flourescent protein) ekspressioonivektor, mis: • võimaldab ekspresseerida EGFP-d (roheliselt fluorestseeruv valk) eukarüootsetes rakkudes • võimaldab ekspresseerida EGFP liitvalke, kui EGFP geeni ette või järele on kloneeritud samas lugemisraamis uuritavat valku kodeeriv järjestus • replitseerub episomaalsena rakuliinides, kus on ekspresseeritud SV40 viiruse large T- antigen (Cos1, Cos7), mis tähendab tugevamat ekspressiooni Figure 3 pEGFP C1 ekspressioonivetori kaart (Clontech)
Millises taime piirkonnas nad ekspresseeruvad? Mis toimub nende ekspresseerumisel piirkondades kus nad normaalselt ei avaldu. -Geenidel on oluline roll meristeemide püsimisel.Tipumeristeemide tsntraalsete meristemaatiliste rakkude säilitamiseks ja taastootmiseks – tagavad rakutsükli säilimise ning rakkude uuenemise. -Diferentseerunud rakkudes on nende ekspressioon pärsitud, nad ekspresseeruvad näiteks võrse tipumeristeemis. -Kui ekspresseerida neid geene kunstlikult nt lehtedes, moodustavad nad lehtede pinnal meristemaatiliste rakkude kuhjasid. Milliste geenide ekspresseerumise transkriptsioonitasandiline kontroll on reguleeritud valgusega (nimetage vähemalt kolm geeni) 1)Rubisco väikesubühik 2)LHC teatud valgu 3) nitraadireduktaas Millised iseärasused on valgusega reguleeritavate geenide regulaatorpiirkondadel Regulaatorpiirkondades on geeni kodeerivas osas 5’ pool cis-elemendid, millest sõltub
sekveneerida? Saame kaks nukleotiidset järjestus mis katavad üksteist ja teevad lugemise võimatuks. Väga pikkade fragmentide sekveneerimiseks kasutatakse forward ja reverse praimereid, kuid eraldi reaktsioonides. Praktiline töö nr. 10: Ümberkloneerimine Eesmärk: Sekveneerimistulemuste põhjal koostada plaan funktsionaalse ekspressioonivektori koostamiseks, millega saaks huvipakkuvat valku (liitvalguna koos GFP-ga) koekultuuri rakuloonides ekspresseerida. Töö käik: Leiame restriktaasid BamHI SalI KASUTAN C1 lugemisraami! Puhver Double Digest lehelt. BamHI buffer BamHI 2-fold excess of SalI Incubate at 37°C Mida on oluline ümberkloneerimisel silmas pidada? Inserdis ei tohi olla ümberkloneerimiseks kasutatave restriktaaside saite, kuna siis lõigataks meie kodeeritava ala keskelt fragment pooleks, aga me tahame tervet kodeeritavat ala saada.
Kuidas konstrueerida üht herbitsiididele tolerantset transgeenset taime? glüfosaat, glüfosinaat blokeerib aminohapete sünteesi. glüfosaat (herbitsiit) plokeerib ära ühe ensüümi mis vastutab aminohapete tootmise eest (EPSPS ensüüm ,EPSP süntaas). Et muuta taim herbitsiidi tolerantseks võiks talle siirdada, mõne teise organismi geene, mis kodeerivad sama ensüümi, aga vähe teisel kujul nii et herbitsiid sellega ei seondu. Võib ekspresseerida ka ensüümi, mis muudab herbitsiidi nii, et see ei seondu aminohapet sünteesiva ensüümiga. Mis on “Kuldne riis”? Üks varasemaid näiteid säärastest GMOdest on kuldne riis. Tavalise riisi sisse viiakse beta-karoteeni sünteesi jaoks vajalikud muudatused ja valmib veidi kollaka värviga riisisort, mis võib päästa sadade tuhandete laste elu, kes surevad vitamiin A puudusesse igal aastal. Kuldne riis on GMO riis, mis erineb valgest riisist selle poolest et selle terades
rakkudesse. Selekteeritakse ja kasvatatakse korrigeeritud rakud ning viiakse patsienti tagasi. In vivo geeni teraapia – funktsionaalne geen viiakse otse patsiendi rakkudesse või vastavasse koesse. Nt ajukoe rakke ei saa kultuuri viia. Vektorid geenide ülekandeks: Viiruslikud süsteemid: Adenoviirused, retroviirused – retroviirused on head, kuna integreeruvad peremehe genoomi ja võivad transgeeni ekspresseerida pikaajaliselt. Mitteviiruslikud süsteemid: on ohutumad kuid vähem efektiivsemad. Liposoomid – DNA konstrukti ümbritsemine kunstliku lipiidmembraaniga Nanopartiklid 49. Kirjeldage skemaatiliselt protsessi kuidas saab toota mingit lehmale võõrast aga terapeutiliselt inimesele olulist valku nii, et seda valku saab eraldada lehma piimast. nt saab luua transgeensed lehmad, kelle piimas on vähem laktoosi.
mingit mRNA-d sünteesitakse. Valik toimub enamasti regulaatorvalkude abil. Eukarüoodi DNA on tihedalt pakitud (histoonid) ja ei ole kättesaadav: transkriptsioonifaktorid ei saa seostuda, aga reguleerivad valgud saavad. Näiteks kromatiini struktuuri muutvad valgud. Transkriptsioonifaktori tuumas viibimine on tasakaaluline protsess tuuma impordi ja ekspordi vahel, kui geeni pole vaja ekspresseerida, viiakse faktor tuumast välja. Tähtis ka DNA metülatsiooni tase neis kudedes kus ei ekspressiooni ei toimu on geenid (uinuvas olekus geenid) harilikult rohkem metüleeritud. Metüleerimine muudab geenide struktuuri ja seega transkriptsiooni toimumist. CG nukleotiidipaaris saab metüleerida tsütosiini (tsükli viiendast positsioonist) Enamus bakteriaalseid geene on organiseeritud operonidesse, mida saab korraga indutseerida ja represseerida
potentsiaalset amphipaatilist heeliksit ja on oluline orbiviiruste rakku sisenemiseks (endosoomi membraanide läbimiseks). VP3 (103 kDa) on mazoorne core valk, mis on erinevatel orbiviirustel väga konserveerunud. Core struktuuri kuulub 120 VP3 subühikut (moodustavad 60 dimeeri). Omab olulist osa virioni moodustamisel ja virionide rakku tungimisel. VP7 (39 kDa) on väga konserveerunud mazoorne core valk: core koostisesse kuulub 780 VP7 subühikut (moodustavad 260 trimeri). Kui rakkudes ekspresseerida samaaegselt VP3 ja VP7 valke, siis moodustavad need valgud core-sarnaseid ikosaedrilisi partikleid. VP1 (150 kDa) on orbiviiruse RdRp. VP1 on minoorne valk ja on virionis esindatud vaid 12 koopiaga, VP4 (76 kDa) on minoorne sisekapsiidi valk (ca 24 koopiat virioni kohta), mis moodustab nii lahuses kui ka virionides homodimere ja on orbiviiruse cap-sünteesi ensüüm, mis omab: - GT aktiivsust; - kahte tüüpi MT aktiivsuseid nagu (ka teiste Reoviridae esindajate MT-d);
) ja tulemuseks ongi kunstlik aa-tRNA ja siis tuleb see lisada lihtsalt valkudesse. 2 In vivo: geneetilise koodi muutumine toimub väikeste genoomide puhul, kui kõiki koodoneid ei kasutata. Kasutamata koodonitele saab määrata uue funktsiooni ilma et see valgusünteesi häiriks) Rakuvaba valgusünteesi rakendused. Valgud, mida on raske ekspresseerida in vivo (tsütotoksilised, ebastabiilsed). Valkude märkimine stabiilsete või radioaktiivsete isotoopidega, spin märke või fotoaktiveeritava rühmaga. Geneetilise koodi laiendamine. In vitro evolutsioonilised lähenemised. Valgusünteesi uurimine rakkudes Ribosoomide profileerimise meetod, millel põhineb ja kuidas toimib, mida selle meetodiga on võimalik teada saada. Süvasekventsiga määratakse ribosoomidega seotud
3. Mida teate geneetiliselt muundatud loomade kohta (millised, kus kasutatakse, kas on müügil)? farmakoloogiliste valkude tootmine piimanäärmes vm. koes, transgeensed sead doonororganite saamiseks. Suunad on liha jms. toodangu kvaliteedi tõstmine ja haigusresistentsed loomad. Kasvuhormooni ekspresseerimine ei õnnestunud kariloomadel nii hästi kui hiirtel kaasnes palju kahjulikke kõrvalmõjusid. Tööd selles suunas jätkuvad, aga püütakse ekspresseerida kasvuhormooni toimet vahendavaid valke jne. P.s. püütakse mõjutada loomsete produktide - eelkõige piima omadusi. Müügil transgeenne sebrakala. Transgeensetest kaladest tegeldakse peamiselt lõhe, forelli, karpkala ja veel mõne GM liini loomisega. Kõige varem võib oodata sellise Atlandi lõhe müügiletulekut, millesse on viidud Vaikse ookeani lõhe kasvuhormoon külmumisvastase geeni promootori kontrolli al 4
Madalaim 23 %-line GC-sisaldus on teoreetiliselt minimaalne väärtus, mis veel võimaldab kodeerida normaalse aminohappesisaldusega valke. Koodoni 3. positsioonis kasutavad mükoplasmad enamasti A-d või U-d. Mycoplasma ja Spiroplasma liigid kasutavad universaalset stop- koodonit UGA trüptofaani koodonina nagu mitokondrid. Acholeplasma's on UGA stop- koodoniks, trüptofaani kodeerib UGG nagu tavaliselt. Selle erineva koodonikasutuse tõttu ei saa mükoplasmadest kloneeritud geene ekspresseerida E. coli's. E. coli ei lülita UGA kohal valku Trp, vaid termineerib ahela sünteesi. Tekivad mittetäielikud valgud. Füsioloogia Mükoplasmad jagatakse fermentatiivseteks ja mittefermentatiivseteks. Mittefermentatiivsetel mükoplasmadel puudub heksokinaas, fosfofruktokinaas ja aldolaas ja EMP (Embden- Meyerhofi) rada neil ei funksioneeri. Küll aga saavad nad kasutada rasvhappeid ja alkohole ja neid aeroobselt lagundada. Kõigil seniuuritud mükoplasmadel on
Nonsense mediated decay toimub tsütoplasmas. Hulgaliselt on tõendeid selle kohta, et pioneeriv ribosoom transleerib mRNAd, kui tema 5' otsaga on assotseerunud cap-siduv kompleks ning polü(A) saba on assotseerunud tuumse PABPIIga. See on tekitanud oletusi, et esimene translatsiooni tsükkel toimub tuumas kui nonsense-mediated decay järelvalve mehanismi üks komponente. 9. Mis on tagasisidestusmehanism? ja too mõni näide. See on mehhanism, mille alusel rakk ,,otsustab", kas ekspresseerida mingit geeni või mitte. Sõltub ümbritsevatest tingimustest nt kui valku palju, siis ei sünteesita, kui vähe, siis sünteesitakse. 10. Too näiteid positiivsest ja negatiivsest geeni ekspressiooni regulatsioonist. Positiivseid: Histoonide atsetüleerimine Aktivaatori seondumine Negatiivseid: Histoonide deatsetüleerimine Repressori seondumine DNA metüleerimine Up-regulation-protsess mis toimub raku sees, mis on signaalipoolt esile kutsutud, resulteerub ühe või rohkema
Näiteks Pseudomonas aeruginosa kahekomponentse süsteemi sensor GacS on homodimeerina aktiivne ning autofosforüleerub kroonilise infektsiooni korral. Akuutse infektsiooni korral moodustab GacS heterodimeeri RetS-ga, mis pärsib signaali edasikandumist vastuseregulaatorile GacA. 88 Sensor inhibeerib HATPaasset domeeni, kui pole ligandiga seondunud. Kui HATPaasne domeen ekspresseerida eraldi, siis on ta kogu aeg aktiivne. Tavaliselt on tsütoplasmaatiline domeen dimeerina ning autofosforüleerimine toimub in trans, mis tähendab ühe subühiku ATP-d siduv HATPaasne domeen kineerib teise monomeeri HisKa domeenis histidiini jäägi. Siiski on teada ka in cis kineerimist. Tavaliselt kasutatakse fosforüleerimiseks ATP-d, kuid mõni sensor võib kasutada fosforüülimiseks GTP-d. Sensori fosforüülitud histidiini jäägilt kantakse fosfaatjääk üle vastuse regulaatori
jagunevad professionaalseteks ja mitteprofessionaalseteks, vastavalt neil MHC II molekulide alalisest esinemisest või indutseeritavusest. Professionaalseteks APC- rakkudeks on MHC II molekule pidevalt pinnal omavad rakud. Mitteprofessionaalsetel APC-del on võimalik indutseerida MHC II esinemist põhiliselt IFN-gamma abil. Põhimõtteliselt kõik somaatilised rakud ekspresseerivad I klassi proteiine ja on võimelised esitlema endogeenseid antigeene CD8 T rakkudele. Vähesed rakud suudavad ekspresseerida II klassi proteiine CD4 T-helperitele ja on väga olulised kõikides immuunvastustes (professionaalsed). Need on makrofaagid, B lümfotsüüdid ja dendriitrakud. APC-rakud esinevad veres, põrnas, lümfisõlmedes, lümfifolliikulites, kudedes, organites ja nahas. Makrofaagid. Enamik makrofaagitüüpe ekspresseerib II klassi proteiine ja ekspressioon suureneb, kui makrofaag on aktiveerunud. Makrofaagid on laialt levinud nii lümfoid- kui ka mittelümfoidkudedes ja on eriti olulised
annaabi.ee 
