· Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 32,2 cm ja diameetri d 1,9 cm, kasutades joonlauda. Arvutasin täidise kogumahu Vt = 91,296. · Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k * Vt = 9,1296 ja kolonnile iseloomuliku max elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 82, 16665. · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 41,08. · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr. I: Dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. · Avasin kolonni väljavooluava ja reguleerisin voolutuslahuse tilkumiskiiruse klambri abil piiridesse 0,7 1,0 ml/min (eesmärgiks koguda iga fraktsioon ubmes 2-3 minutiga). Proovi sisestamine ja kolonni voolutamine:
Kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark G-75 k = 0,1 Fraktsioneerimispiirkond: 3000 80000 D Materjal: dekstraan Täidise kõrgus L = 33 cm Täidise diameeter d = 1,8 cm ; r = 0,9 cm Täidise kogumaht Vt = r 2 L = 0,9 2 33 = 83,98cm3 Geelmaatriksi maht Vg = k Vt = 0,1 83,98 = 8, 40cm3 Maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt - Vg = 83,98 - 8, 40 = 75,58cm3 Fraktsioonide üldarv V max 75,58 n= x = = 37, 78 38 2 2 Voolutuslahuse koostis 50 mMTris-HCl 150 nM NaCl pH = 7,5 Uuritava proovi koostis Dekstraansinine (sinine) Müoglobiin (pruun) DNP-aspartaat (kollane) Töö kolonniga Kõigepealt avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava, et voolutuslahuse nivoo oleks võrne täitegeeliga. Samal ajal reguleeritakse kolonni voolukiirus reguleerimisklambri abil õigeks (soovitav voolukiirus 0,7-1,0 ml/min, millele vastab 1 tilk nelja sekundi jooksul). Voolutuslahus
· märgitakse üles Sephadex täidise mark ja pundumistegur k · mõõdetakse geelsamba kõrgus L ja diameeter d · arvutatakse täidise kogumaht Vt · arvutatakse geelmaatriksi maht Vg = k*Vt ja maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg · arvutatakse fraktsioonide arv n, kui ühe fraktsiooni mahuks võetakse 2 ml, n = Vxmax / 2 · võetakse vastav hulk 2 ml-ga märgistatud ja nummerdatud katseklaase · läheduses hoitakse voolutuslahuse pudel koos sobiva pipetiga, märgitakse üles voolutuslahuse koostis · varutakse väike keeduklaas, kuhu kogutakse täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist väljutatakse kolonnist Segu komponentide lahutamine: · avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava, samal ajal reguleeritakse kolonni voolukiirust · kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava · kogutud lahust pole vaja säilitada
· Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 16,8 cm ja diameetri d = 2,7 cm r= 1,35cm, kasutades joonlauda. Arvutasin täidise kogumahu Vt = L·r2 = 114,45 · Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k * Vt = 11,44 ja kolonnile iseloomuliku max elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 103,01 · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 53 · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr. I: Dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. · Avasin kolonni väljavooluava ja reguleerisin voolutuslahuse tilkumiskiiruse klambri abil piiridesse 0,7 1,0 ml/min (eesmärgiga koguda iga fraktsioon umbes 2-3 minutiga). Proovi sisestamine ja kolonni voolutamine:
Vg = 0,1 · 124,4 cm3 = 12,44 cm3 Vxmax = 124,4 cm3 12,44 cm3 = 111, 96 cm3 Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2ml; seega n = Vxmax / 2 = 111,96 cm3 / 2 = 55, 98 56 Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastava hulga kindla mahu järgi ( 2ml ) kalibriitud katseklaase ja numereerisin need. Kolonni lähedusse paigutasin voolutuslahutuse ehk eluendi pudeli ja märkisin üles voolutuslahuse koostise: 50 mM Tris HCl 150mM NaCl pH = 7,5 Varusin väikse keedkulaasi, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal oleva eluendi, mis enne uuritava segu sisestamist kolonnist välja lasin. 2.2. Segu komponentide lahutamine Avasin ettevaatlikult kolonni väjavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt kolonnist välja tilkuma. Reguleerisin kolonni voolukiiruse optimaalseks. Kui
1²*28=106 cm³ ·Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg=k*Vt=0.1*106=10.6 ja sellest lähtuv kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimistmaht Vx;max=Vt-Vg=106-10.6=95.4 ·Arvutasin fraktsioonide üldarvu, arvestan kindlaks mahuks 2ml. n=Vx;max/2=95.4/2=47.7. (Kuigi selline arvutus, läks mul vaja 36 katseklaasi). ·Asetasin katseklaasistatiivi fraktsiooni arvule vastava hulga kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdan. ·Paigutasin kolonni lähedusse voolutuslahuse (eluendi) pudeli ja märkisin üles selle koostise. Varusin sobiva mahuga (20ml,25ml) pipeti, millega voolutuslahus kolonni viia. ·Varusin väikese (50ml)seisukolvi, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal oleva eluendi, mis enne uuritava segu sisestamist tuli kolonnist välja lasta. Segu komponentide lahutamine Kui ettevalmistused tehtud, avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev
kolonni iseloomustava maksimaalse elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 64cm2 6,4 cm2 = 57,6 cm2. o Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n= Vxmax/2 = 57,6/2 =~29. o Katseklaasistatiivile asetasin fraktsioonide arvule (29) vastava hulga kindla mahu järgi (2 ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin. o Kolonni lähedusse paigutasin voolutuslahuse (eluendi) pudeli ning märkisin ülesse voolutuslahuse koositse tris HCl, 0,15 M NaCl, pH=7,5. Varusin sobiva mahuga pipeti (20 ml, 25 ml), millega voolutuslahust kolonni viia. o Varusin väikse keedukolvi (50 ml) enne uuritava segu sisestamist kolonnist välja lastava kolonni pinnal oleva eluendi jaoks. Lahutasin segu komponendid. Pärast ülalkirjeldatud ettevalmistuste tegemist avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja
Liikuvustegurit Rf kasutatakse nende ainete iseloomustamiseks, mis suudavad geeli pooridesse difundeeruda ja mille elueerimismaht on kindlaks määratud. Rf = Vx - Vx min / Vx max - Vx min Kromatogramm graafiline sõltuvus aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahel Töö käik Esmalt märkida üles vajalikud andmed ning teha arvutused Täidise mark: Sephadex G75 Täidist iseloomustav pundumistegur k= 0,1 Geelisamba kõrgus L= 25,5 cm Kolonni sisediameeter d= 1,6 cm r= 0,8 cm Voolutuslahuse koostis: 0,15M NaCl Proovi koostis: Dextrane blue 6mg/ml, Müoglobiin 6mg/ml, DNP-aspartaat 0,3mg/ml Arvutasin välja: Vt = r2 * L= 3,14 * 0,64 * 25,5 = 51,27 cm3 Vg= k*Vt = 0,1 * 51,27 = 5,127 ml Vx max = Vt Vg = 51,27 5,127 = 46,143 ml N= Vx max /2 = 46,143 /2 = 23,1 tk Pärast ettevalmistuste tegemist avada ettevaatlikult kolonni voolutusava ning kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, siis taas sulgeda kolonni väljavooluava. Kolonn on valmis proovi sisestamiseks.
Pundumistegur k=0,1. Joonlauda abiga mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 17,4 cm ja diameetri D = 2,8 cm. Arvutasin täidise kogumahu Vt = = 76,49 cm3 Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k Vt = 7,65 cm ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 68,84 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 34,42. Nummerdasin kaliibritud katseklaase (35t) Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP-aspartaat 0,3 mg/ml Ettevatlikult avasin kolonni väljavooluava, voolukiirus oli juba reguleeritud 1 ml/min Proovi sisestamine Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 1 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale.
Arvutasin 2 täidise kogumahu Vt = π ∙ r ∙ L = 0,82*23,3* π =46,85 cm3 Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k ∙ Vt = 0,1*46,85= 4,685 cm ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt – Vg = 42,162 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 42,165/2≈21. Võtsin 21 kaliibritud katseklaasi Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP-aspartaat 0,3 mg/ml Ettevatlikult avasin kolonni väljavooluava, voolukiirus oli juba reguleeritud 1 ml/min Proovi sisestamine Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 1 ml uuritavat segu
kogumahu: Vxmax Vt.
Vxmax saab ka arvutada, teades geelimaatriksi mahtu: Vxmax=Vt Vg
Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht
Vx on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikumisteguriga f: , (0
Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsiooni kogumine toimub käsitsi. Valemid ja nendes kasutatavad lühendid Täidise maht (Vt) Kolonni vaba maht, s.o graanulitevahelise vedeliku maht (Vv) Graanulitesisese vedeliku maht (Vs) Geelmaterjali (maatriksi) maht (Vg) Valem täidise mahu arvutamiseks: Vt=Vv+Vs+Vg Liikuvustegur Rf: Töö käik Pärast kolonni vertikaalsuse kontrollimist märgitakse üles täidiseks oleva Sephadex´i mark ja tegur k ning uuritava lahuse ja voolutuslahuse koostis. Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja diameeter d. Arvutatakse täidise kogumaht Vt, geelmaatrikis maht Vg = k·Vt ning maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt Vg. Arvutatakse fraktsioonide üldarv n (võttes ühe fraktsiooni mahuks 2 ml) n = Vxmax/2. Nummerdatakse vajalik arv (n) kalibreeritud katseklaase. Avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus lastakse voolata kolonni kuni vedeliku tase langeb täidise pinnani, siis suletakse väljavooluava
Täidise kõrgus: Täidise diameeter: · Arvutasin täidise kogumahu . · Arvutasin geelmaatriksi mahu ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustava maksimaalse elueerimismahu . · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml. · Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastava hulga kindla mahu järgi (2 ml) kaliibritud katseklaase ja nummerasin. · Kolonni lähedusse paigutasin voolutuslahuse (eluendi) pudeli ja märkisin üles eluendi koostise. Varusin 25 ml pipeti, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varusin väikese (50 ml) keeduklaasi, kuhu kogusid kolonni täidise pinnal oleva eluendi, mis enne uuritava segu sisestamist kolonnist välja lasin. Segu komponentide lahutamine. · Avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt kolonni alla asetatud anumasse tilkuma.
Geelisamba diameetriks mõõtsin: d=2,8 cm r=1,4 cm Arvutan täidise kogumahu: Vt=r2**L Vt=1,42*3,14*18=110,78 cm3 Arvutan geelimaatriksi mahu: Vg=k*Vt Vg=0,1*110,78=11,08 cm3 Arvutan maksimaalse elueerimismahu: Vxmax=Vt-Vg Vxmax=110,78-11,08=99,7 cm3 Ühe fraktsiooni maht: 2 mL Arvutan fraktsioonide üldarvu: n=Vxmax/2 n=99,7/2=49,85=50 fraktsiooni. Asetasin katseklaasistatiivi vastavalt fraktsioonide üldarvule 50 katseklaasi, mis olid kalibreeritud 2 mL fraktsioonide võtmiseks. Voolutuslahuse koostis: pH=7,5; 20mM Tris/HCl; 0,15M NaCl Segu komponentide lahutamine Avasin kolonni väljavooluava ja lasin täidise kohal oleval voolutuslahusel keeduklaasi tilkuda ise samal ajal jälgides, et ma ei laseks kolonni kuivaks joosta. Vedeliku nivoo ei tohtinud langeda alla geelipinda, mis oleks õhul lasknud geelikihti tungida. Kolonni voolukiirus oli juba optimaalne, st 0,7-1,0 mL/min. Ühe 2 mL fraktsiooni kogumiseks peaks sellise kiiruse juures olema 2-3 min.
Vt = S · L = 2,54 · 31 78,74cm3 · Arvutasin geelimaatriksi maht Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg: Vg = 0,1 · 78.88 = 7,87 cm3 Vxmax = 78,74 7,87 = 70,87cm3 · Arvutasin fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2 = 70,99 / 2 = 35,44 · Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin. · Märkisin voolutuslahuse koostis. Varusin sobiva mahuga (20 ml, 25 ml) pipett, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varusin väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist tuli kolonnist välja lasta. Segu komponentide lahutamine. Kui eelnevad ettevalmistused olid valmis, avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluala ning kolonnis olev voolutuslahus hakkas tilkuma. Sellel ajal reguleesin kolonni voolukiirus, et tilkus
· Arvutasin geelimaatriksi maht Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg: Vg = 0,1 · 78.88 = 7,89 cm3 Vxmax = 78,88 7,89 = 70,99cm3 Selline täpsus pole õigustatud! · Arvutasin fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2 = 70,99 / 2 = 35,45 · Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin. · Märkisin voolutuslahuse koostis. Varusin sobiva mahuga (20 ml, 25 ml) pipett, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varusin väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist tuli kolonnist välja lasta. Segu komponentide lahutamine. Kui eelnevad ettevalmistused olid valmis, avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluala ning kolonnis olev voolutuslahus hakkas tilkuma. Sellel ajal reguleesin kolonni voolukiirus, et tilkus
· Arvutatakse täidise kogumaht Vt. · Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg. · Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2. · Katseklaasistatiivi asetatakse fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdatakse. · Kolonni lähedusse paigutatakse voolutuslahuse (eluendi) pudel ja märgitakse üles voolutuslahuse koostis. Varutakse sobiva mahuga (20 ml, 25 ml) pipett, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varutakse väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogutakse kolonni täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist tuleb kolonnist välja lasta. Segu komponentide lahutamine. Kui ülalkirjeldatud ettevalmistused on tehtud, avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava
annaabi.ee 
