kui küll olenematra, mis eesmärgil reaktsioon läbi viidi. PCR produkt eraldatakse lahusest elektroforeesiga agargeelis. PCR-i saab kasutada ka diagnostilisel eesmärgil: teatud DNA vôi RNA järjestuse (viiruste vôi bakterite) avastamiseks uuritavas materjalis vôi näiteks geenidefektide avastamiseks genoomis. Tema tundlikkus on teoreetiliselt selline, et kui uuritavas materjalis on üks DNA-molekul, mille järjestus ühtub materjalile lisatava praimeriga, siis me selle ka avastame. PCR- on kôrvaletôrjumas DNA sondide meetodit geneetiliste haiguste uurimisel, viirusinfektsioonide tuvastamisel ja mikroobide tüpiseerimisel.
Me teeme transformatsiooni 37 kraadi juures, Sambrook´i raamatus 42 kraadi juures. 2.2) Millisel juhul võib bakterikoloonia sisaldada rekombinantset plasmiid, kuid samas koloonia värvus on ikka sinine. Kuidas määrata, et selles koloonias on rekombinantne plasmiid? Bakterikoloonia võib sisaldada rekombinantset plasmiid, kuid samas koloonia värvus on ikka sinine, juhul, kui insert on väga väike ja ei muuda lugemisraami või kui järjestuses ei ole Stop-koodonit. PCR, ühe või teise praimeriga sekveneerida järjestus, restriktsiooniga on võimalik määrat ,et selles koloonias on rekombinantne plasmiid. 5 2.3) Mis juhtub, kui jätta Amp panemata? Meie bakterid on resistentsed Amp-le. Amp abil surevad teised bakterid ära ja me saame lihtsalt eristada vajalikud kolooniad. 2.4) Rakkude kompetentsus on nende võime vastu võtta DNA-d/plasmiidi. Ligeerimissegu transformatsiooniks võiks rakkude kompetentsus olla vähemalt 106. See tähendab, et 1 mikrogrammi
dNTP-desoksü, ddNTP-didesoksü (2' ja 3' asendites vesinikud, terminaatornukleotiid). ddNTP ei inkorporeeru nii hästi, pannakse lahusesse suure kontsentratsiooniga (ülehulgas). 5.2) Kui ddNTP inkorporeerub kasvavasse DNA ahelasse, miks ekstensioon termineerub? 3' otsas on vesinik, ei saa moodustuda fosfodiesterside järgmise nukleotiidiga. 5.3) Pikemad järjestused (>1000 nt) sekveneeritakse järestuse otstest kahe erineva vastassuunalise praimeriga kahes erinevas katseklaasis. Miks ei teostata sekveneerimist kahe erineva praimeriga ühes katseklaasis? Sest järjestused kuhjuksid üksteise peale ning pildi pealt pole neid kerge eristada. 5.4) Sekveneeritav DNA sade lahustatakse formamiidis, mis sisaldab 5 mM lõppkontsentratsiooniga EDTA-d (FA+EDTA lahus). Kui palju on vaja pipeteerida 800 l FA+EDTA tegemiseks 0,5 M EDTA lahust? 8 l. Kokkuvõte: Mastermix oli millegi pärast inaktiveerunud ning DNA-d ei õnnestunud sekveneerida.
probleemsed). Kõigil alleelides ei ole täispikka kordusühikut osaliste kordusühikutega alleelide tähistamine: täiskorduste arv punkt aluste arv osalises korduses DEF: Alleelid, millel pole aluskordusmotiivi täpseid kordusi või esinevad kordusmotiivi järjestuse variandid või mõlemad Võivad esineda insertsioonid, deletsioonid, aluse vahetused Järjestuse variatsioon võib esineda korduse sees, külgnevas alas või praimeriga seondumise alas Võib põhjustada PCR ebaõnnestumist, kuid praimeriga seondumise sait on muteerunud: null-alleelid Alleelid esinevad, kuid ei amplifitseeru nukleotiidi muutuse tõttu praimeri seondumissaidis heterosügootse isiku võib nii vale-homosügootseks määrata kaks PCR praimerite komplekti annavad erinevad tulemused probleemid andmebaaside kasutamisel uute kittide kasutusele võtmisele eelnevad põhjalikud uuringud 5
GTGACT LEGEND Kodeeriv ala on boldis ja allajoonitud Esimene aminohape Reverse praimer Forward praimer Vektori järjestus Milliseid programme kasutasin? Bioedit näitas sekveneerimise tulemusi, leidsin sealt usaldusvahemikud ja hindasin sekventsi kvaliteeti. BLAST andis nukleotiidse järjestuse põhjas vastava geeni ja seejärel vaatasin mis pidi insert on sisenenud, kas on gapse ja mutatsioone. 15 Mis juhtub kui proovid ühes reaktsioonisegus kahe praimeriga korraga sekveneerida? Saame kaks nukleotiidset järjestus mis katavad üksteist ja teevad lugemise võimatuks. Väga pikkade fragmentide sekveneerimiseks kasutatakse forward ja reverse praimereid, kuid eraldi reaktsioonides. Praktiline töö nr. 10: Ümberkloneerimine Eesmärk: Sekveneerimistulemuste põhjal koostada plaan funktsionaalse ekspressioonivektori koostamiseks, millega saaks huvipakkuvat valku (liitvalguna koos GFP-ga) koekultuuri rakuloonides ekspresseerida. Töö käik:
Saadud koopiate arv ulatub aga 30 tsukli jarel juba miljonitesse, mis on piisav mistahes analuusiks. PCR produkt eraldatakse lahusest elektroforeesiga agargeelis. PCR-i saab kasutada ka diagnostilisel eesmargil: teatud DNA voi RNA jarjestuse (viiruste voi bakterite) avastamiseks uuritavas materjalis voi naiteks geenidefektide avastamiseks genoomis. Tema tundlikkus on teoreetiliselt selline, et kui uuritavas materjalis on uks DNA-molekul, mille jarjestus uhtub materjalile lisatava praimeriga, siis on see avastatav. PCR on korvale torjumas DNA sondide meetodit geneetiliste haiguste uurimisel, viirusinfektsioonide tuvastamisel ja mikroobide tupiseerimisel. RNA uurimiseks ja paljundamiseks PCR meetodil on esmalt vajalik RNA transkribeerida DNA-ks, mida saab teha ensuumi-poordtranskriptaasi abil, mida leidub retroviirustest nakatunud rakkudes. Sel moel sunteesitud DNA-st on voimalik saada hiljem taas RNA-molekulid. DNA molekuli nukleiinhappelise (NH) jarjestuse maaramine
miljonitesse, mis on rohkem kui küll olenematra, mis eesmärgil reaktsioon läbi viidi. PCR produkt eraldatakse lahusest elektroforeesiga agargeelis. PCR-i saab kasutada ka diagnostilisel eesmärgil: teatud DNA vôi RNA järjestuse (viiruste vôi bakterite) avastamiseks uuritavas materjalis vôi näiteks geenidefektide avastamiseks genoomis. Tema tundlikkus on teoreetiliselt selline, et kui uuritavas materjalis on üks DNA-molekul, mille järjestus ühtub materjalile lisatava praimeriga, siis me selle ka avastame. PCR- on kôrvaletôrjumas DNA sondide meetodit geneetiliste haiguste uurimisel, viirusinfektsioonide tuvastamisel ja mikroobide tüpiseerimisel. 46. Kromatograafia vt. konspekt (18.11) 47. Elektroforees vt. konspekt (5.11) 48. Nukleiinhapete hübridiseerimine NH hübridiseerimine pôhineb denatureerunud DNA ja RNA renatureerumise fenomenil, mis seisneb selles, et teatud
kuna ensüümi aktiivsus langeb, samuti lôpevad otsa vabad nukleotiidid. Neid juurde pole aga vôimalik lisada. PCR-i saab kasutada ka diagnostilisel eesmärgil: teatud DNA vôi RNA järjestuse (viiruste vôi bakterite) avastamiseks uuritavas materjalis vôi näiteks geenidefektide avastamiseks genoomis. Tema tundlikkus on teoreetiliselt selline, et kui uuritavas materjalis on üks DNA-molekul, mille järjestus ühtub materjalile lisatava praimeriga, siis me selle ka avastame. PCR- on kôrvaletôrjumas DNA sondide meetodit geneetiliste haiguste uurimisel, viirusinfektsioonide tuvastamisel ja mikroobide tüpiseerimisel. 43. Elektrofrees Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas elektrivälja mõjul.
on rohkem kui küll olenematra, mis eesmärgil reaktsioon läbi viidi. PCR produkt eraldatakse lahusest elektroforeesiga agargeelis. PCR-i saab kasutada ka diagnostilisel eesmärgil: teatud DNA vôi RNA järjestuse (viiruste vôi bakterite) avastamiseks uuritavas materjalis vôi näiteks geenidefektide avastamiseks genoomis. Tema tundlikkus on teoreetiliselt selline, et kui uuritavas materjalis on üks DNA-molekul, mille järjestus ühtub materjalile lisatava praimeriga, siis me selle ka avastame. PCR- on kôrvaletôrjumas DNA sondide meetodit geneetiliste haiguste uurimisel, viirusinfektsioonide tuvastamisel ja mikroobide tüpiseerimisel. 40. Elektroforees Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas elektrivälja mõjul.
kui küll olenematra, mis eesmärgil reaktsioon läbi viidi. PCR produkt eraldatakse lahusest elektroforeesiga agargeelis. PCR-i saab kasutada ka diagnostilisel eesmärgil: teatud DNA vôi RNA järjestuse (viiruste vôi bakterite) avastamiseks uuritavas materjalis vôi näiteks geenidefektide avastamiseks genoomis. Tema tundlikkus on teoreetiliselt selline, et kui uuritavas materjalis on üks DNA-molekul, mille järjestus ühtub materjalile lisatava praimeriga, siis me selle ka avastame. PCR- on kôrvaletôrjumas DNA sondide meetodit geneetiliste haiguste uurimisel, viirusinfektsioonide tuvastamisel ja mikroobide tüpiseerimisel. Elektroforees. Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektriravi üks alaliike. Nukleiinhapete hübridiseerimine.
on rohkem kui küll olenematra, mis eesmärgil reaktsioon läbi viidi. PCR produkt eraldatakse lahusest elektroforeesiga agargeelis. PCR-i saab kasutada ka diagnostilisel eesmärgil: teatud DNA vôi RNA järjestuse (viiruste vôi bakterite) avastamiseks uuritavas materjalis vôi näiteks geenidefektide avastamiseks genoomis. Tema tundlikkus on teoreetiliselt selline, et kui uuritavas materjalis on üks DNA-molekul, mille järjestus ühtub materjalile lisatava praimeriga, siis me selle ka avastame. PCR- on kôrvaletôrjumas DNA sondide meetodit geneetiliste haiguste uurimisel, viirusinfektsioonide tuvastamisel ja mikroobide tüpiseerimisel. 40. Elektroforees Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas elektrivälja mõjul.
on rohkem kui küll olenematra, mis eesmärgil reaktsioon läbi viidi. PCR produkt eraldatakse lahusest elektroforeesiga agargeelis. PCR-i saab kasutada ka diagnostilisel eesmärgil: teatud DNA vôi RNA järjestuse (viiruste vôi bakterite) avastamiseks uuritavas materjalis vôi näiteks geenidefektide avastamiseks genoomis. Tema tundlikkus on teoreetiliselt selline, et kui uuritavas materjalis on üks DNA-molekul, mille järjestus ühtub materjalile lisatava praimeriga, siis me selle ka avastame. PCR- on kôrvaletôrjumas DNA sondide meetodit geneetiliste haiguste uurimisel, viirusinfektsioonide tuvastamisel ja mikroobide tüpiseerimisel. 44. Elektroforees – selle kohta ka Pata slaidides Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas
on rohkem kui küll olenematra, mis eesmärgil reaktsioon läbi viidi. PCR produkt eraldatakse lahusest elektroforeesiga agargeelis. PCR-i saab kasutada ka diagnostilisel eesmärgil: teatud DNA vôi RNA järjestuse (viiruste vôi bakterite) avastamiseks uuritavas materjalis vôi näiteks geenidefektide avastamiseks genoomis. Tema tundlikkus on teoreetiliselt selline, et kui uuritavas materjalis on üks DNA-molekul, mille järjestus ühtub materjalile lisatava praimeriga, siis me selle ka avastame. PCR- on kôrvaletôrjumas DNA sondide meetodit geneetiliste haiguste uurimisel, viirusinfektsioonide tuvastamisel ja mikroobide tüpiseerimisel. 44. Elektroforees selle kohta ka Pata slaidides Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas
· Juhtival DNA ahelal (liiderahel) (leading strand) toimub DNA süntees järjepidevalt, teda pikendatakse järjepidevalt. Süntees 5’-3’ suunas. · Mahajääval ahelal(viivisahel) (lagging strand) toimub DNA süntees katkendlikult, teda saab pikendada RNA praimerite ja spetsiaalse ensüümi praimaasi abil. Süntees toimub 3’-5’ suunas (fragmendid sünteesitakse 5’ - 3’ suunas). 18. Kuidas sünteesitakse liiderahel ja viivisahel Liiderahela sünteesimine - katkematult 1 praimeriga Viivisahela sünteesimine - DNA praimaas sünteesib DNA järjestuse pealt lühikese RNA praimeri. - DNA polümeraas jätkab DNA sünteesi- moodustub Okazaki fragment. - Eesolev RNA praimer asendatakse DNA-ga. - Okazaki fragmentide katkekohad liidetakse DNA ligaasi abil. 19. Mis on Okazaki fragment ja millest ta koosneb? Okazaki fragmendid on lühikesed DNA fragmendid, mis tekivad sünteesi tagajärjel viivisahelal. Koosneb RNA praimerist ning järgnevast DNA polünukleotiidist
analüüsiks. PCR produkt eraldatakse lahusest elektroforeesiga agargeelis. PCR-i saab kasutada ka diagnostilisel eesmärgil: teatud DNA vôi RNA järjestuse (viiruste vôi bakterite) avastamiseks uuritavas materjalis vôi näiteks geenidefektide avas- tamiseks genoomis. Tema tundlikkus on teoreetiliselt selline, et kui uuritavas materjalis on üks DNA-molekul, mille järjestus ühtub materjalile lisatava praimeriga, siis on see avastatav. RNA uurimiseks ja paljundamiseks PCR meetodil on esmalt vajalik RNA transkribeerida DNA-ks, mida saab teha ensüümi- pöördtranskriptaasi abil, mida leidub retroviirustest nakatunud rakkudes. Sel moel sünteesitud DNA-st on vôimalik saada hiljem taas RNA-molekulid. Joonis. Polümeraas-ahelreaktsiooni etapid Pôhilised valdkonnad, kus insenergeneetikal on laiem perspektiiv. 1) Teatud spetsiifiliste molekulide tootmine suurtes hulkades
DNA pikenemine tekitab uue lookuse, kuhu saab seostuda praimer. Tsükli lõppedes on tekkinud kahest originaalist kaks uut DNA koopiat. (D) Teise tsükli ajal seostuvad kõik 4 peale denaturatsiooni tekkinud DNA ahelat praimeriga, algab uus DNA sünteesi etapp. Kaheksast ahelast on kaks pikkusega, mille määrab ära praimerite vaheline kaugus – „lühike“ produkt. Järgmistes tsüklites toimub selle produkti eksponentsiaalne suurenemine. 66
annaabi.ee 
