o Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks- need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad- ,,kleepuvad otsad" o Selliste otstega DNA juppe on komplementaarsuse tõttu võimalik liita o Erinevate DNA-de liitmisel saadakse rekombinantne DNA · Kuidas aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? o Üle viidavale geenile on markergeen külge pandud · Näiteks kasutatakse GFP (helenduv) geeni markerina o Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp-koodoneid, on sisetatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui tka GFP-valk on valmis. · Nii saab üle viidud geeni avaldumist organismis kindlaks teha · Helenduv kärss · GM-bakterid toiduainetetööstuses o Ensüümid o Maitsetugevdajad o Magustajad o Värvuse parandamiseks o Paksendajad o Säilitusained o Happesuse regulaatorid · GM-bakterid meditsiinis
Forees 1. Kandsime ettevalmistatud valguproove ettevaatlikult geelitaskutesse (20 l). Protokollisime, millisesse taskusse, millise proovi kandsid. 2. Asetasin foreesivannile kaasi, ühendasime juhtmed vooluallikaga ning lülitasime vooluallikas sisse (pinge 180V, voolutugevus 30 mA). NB! Täida elektriaparaatidega töö ohutuseeskirjasid! 3. Foreesi viiakse läbi üldjuhul niikaua, kuni markerina kasutatav broomfenoolsinine on geeli lõpuni jõudnud (tavaliselt ~1 tund 180 V juures). Elektroforeesi kulgu tuleb jälgida ning tuleb veenduda, et geel üle ei kuumeneks (alanda pinget 150V-ni). 4. Lülitasime foreesiaparaat elektrivõrgust välja, kogu puhvrivannidest puhver kokku ja valasime tagasi puhvri pudelisse, võtsime geeli aparaadist välja, eraldasime klaasplaadid teineteisest väga ettevaatlikult kasutades väikest spaatlit. 5
tekivad üheahelalised otsad – “kleepuvad otsad”.Selliste otstega DNA juppe on komplemen-taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita.Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA SLAID 6: RESTRIKTAASIDE JOONIS eelmisele slaidile sarnane seletus joonise põhjal SLAID 7: KUIDAS GEENID KOHALE VIIA? SLAID 8:KUIDAS ARU SAADA KAS GEEN ON ÜLE KANDUNUD? 1)Üle viidavale geenile on markergeen ka külge pandud (näiteks helenduv-GFP) 2)Nüüd kasutataksegi GFP geeni markerina: Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp-koodoneid, on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFP-valk on valmis. 3)Nii saab iga valgu translatsiooni toimumist organismis uurida. SLAID 9: Erinevaid meetodeid on tegelikult ligi 15, aga räägin põgusalt enim kasutatavatest. Loomadel: Embrüonaalsete tüvirakkude meetod: DNA paljastamine, rakkude süstimine teiste rakkude blastotsüsti, embrüosiirdamine, järglaste DNA uurimine N:hiired
plasmiid Kuidas geenid kohale viia? 1. Bakteri plasmiidiga 2. Viirustega Kui neile on soovitud geen lisatud, nime- tame teda geenivektoriks. 3. Kullapüstoliga 4. Taimedesse Agrobakteriga Viirusvektor viib soovitud geeni rakku Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? Üle viidavale geenile on markergeen külge pandud. Näiteks kasutatakse GFP (helenduv) geeni markerina: Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp-koodoneid, on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFP-valk on valmis. Nii saab üle viidud geeni avaldumist organismis kindlaks teha: vaatad ja näed, et helendub! Fluorestseeruv valk GFP on saadud meduusist. O.Shimura eraldas esimesena Nobeli preemia 2008 Plasmiid, mis sisaldab GFP-geeni ja antibiootikumiresistentsust määravat geeni Inimese kasvajat põhjustavale geenile on
· Teine viis geene paigale toimetada on plasmiidide kasutamine (plasmiid = bakterrakkude DNA molekul). Geenitehnoloogia rakendusi Molekulaargeneetiline diagnostika Põhineb enamasti mutantsete geenide äratundmisel DNA-proovide abil. DNA-kiibid võrdlus DNA-lõigud, millega patsiendi geene kõrvutada saab tuvastada haiguse ja siis vastavalt määrata ravi (Rinnavähk, huntingtoni tõbi jne). Helenduvad geenid on lisatud vaid markerina, et kindel olla geenide ülekandes. DNA-sõrmejälgede diagnostika Võrreldakse 10 või enama lookuse pikkust : Lookusi saab DNA-st välja lõigata ja paljundada. See proov pannakse geeli. Geel pannakse elektrolüüsivanni. Lookus mingi kromosoomi mis tahes lõik, milles on tuvastatav mingi geneetiline element. PCR metootika võimaldab mõne raku olemasolu korral paljundada kindlat DNA-lõiku mõne tunni jooksul miljonis koopias, mis annab võrdlevaks uurimiseks piisavalt materjali.
tundetuks umbrohumürkide suhtes siirdatakse taime geen, mis kodeerib mürki lagundavat ensüümi. Selliselt muundatud taimed ei hävi taimemürkide kasutamisel, küll aga teised taimed, mis umbrohumürgiga kokku puutuvad. Neid GM-taimi nim. herbitsiiditolerantseteks. MARKERTAIMED- Geenisiirdamise õnnestumise kergemaks tuvastamiseks ja GM-taime äratundmiseks ühendatakse vajaiku siirdgeeniga mõnu markergeen,mis avaldub erilise tunnusena. Nt tubakataim,,millele on siiratud markerina lutsiferaasi kodeeriv geen jaanimardikalt. See ensüüm lõhustab lutsiferiini, tekitades helenduva ühendi, kui taime kastetakse lutsiferiini sisaldava veega. GEENITERAAPIA ehk geenravi seisneb enamasti normaalselt taliteva geeni siirdamises raske geneetilise puudega inimese mingi koe(organi) rakkudesse. Osal juhtudel seisneb ravi ka mutantse geeni avaldumise vaigistamises. Siiratakse sama liigi geene, neid geene siiratakse üksnes somaatilistesse rakkudesse ega pärandata järglastele.
Seleks täidsime puhvrikambrid jooksupuhvriga (0,25 M TRIS, 1,92 M glütsiin, 0,1% SDS, pH 8,3) ning eemaldasime kammi. Forees: 1. Igasse taskusse kandsime 20 µl valguproovi. Viimasse taskusse panime 3 µl foreesredeli - Thermo Scientific PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder. 2. Asetasime foreesivannile kaas, ühendasime juhtmed vooluallikaga ning lülitasime vooluallikas sisse (pinge 150V, voolutugevus 30 mA). 3. Jätsime foreesiaparaati üheks tunniks kuni markerina kasutatav broomfenoolsinine on geeli lõpuni jõudnud. 4. Lülitasime foreesiaparaati elektrivõrgust välja, kogusime puhvrivannidest puhver kokku ja valasime tagasi puhvri pudelisse. 5. Võtsime geeli aparaadist välja, ettevaatlikuslt eraldasime klaasplaadid teineteisest. 6. SDS-i eemaldamiseks pesime geeli veega 10 minutit, loksutasime geeli veega, vahetades vett 10 min jooksul 3 korda. 7. Panime geel ööseks Coomassie G250 värvilahusesse. 8. Valasime värvilahus tagasi purki
GMO-sid on 2. tüüpi 1. organismid kellesse on viidud võõra liigi geene transgeensed org. 2. Organismid kelle geen on rikutud nii ,et ta ei avaldu ja muutus pärandub edasi- nokautorganism kuidas saab geene kohalt viia? Transgeensete organismide puhul · bakteri plastiididega · viirusega · kullapüstoliga · taimedesse agrobakteriga( kasvajat tekitav bakter taimel) Üle viidavale geenile on markergeen külge pandud. Näiteks kasutatakse GFP(helendav ) geeni markerina. Seda saadakse süvavee meduusidest. Kui uuritava geeni lõppu , enne stoppkoodonit on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne ,kui ka GFP -valk on valmis Bakterid toodavad inimese valke alates 1978. aastast · esimene oli insuliin · Inimese kasvuhormoon · erütropoietsiin aneemia raviks · interferoon , mis reguleerib immuunsüsteemi · vere hüübimisfaktorid · Difteeria ja teetanuse vaktsiin
Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Kuidas geenid kohale viia? Bakteri plasmiidiga Viirustega Kui neile on soovitud geen lisatud, nime- tame teda geenivektoriks. 3. Kullapüstoliga 4. Taimedesse Agrobakteriga Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? Üle viidavale geenile on markergeen ka külge pandud (näiteks helenduvGFP) Nüüd kasutataksegi GFP geeni markerina: Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp- koodoneid, on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFPvalk on valmis. Nii saab iga valgu translatsiooni toimumist organismis uurida. Miks bakterirakus ei hakka inimese geen kohe tööle? Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis on intronid ja eksonid. Pärast transkriptsiooni lõigatakse intronid välja ja ainult kokkuliidetud eksonid
Rekombinantne plasmiid Kuidas geenid kohale viia? 1. Bakteri plasmiidiga 2. Viirustega Kui neile on soovitud geen lisatud, nime- tame teda geenivektoriks. 3. Kullapüstoliga 4. Taimedesse Agrobakteriga Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? Üle viidavale geenile on markergeen ka külge pandud (näiteks helenduv-GFP) Nüüd kasutataksegi GFP geeni markerina: Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp- koodoneid, on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFP-valk on valmis. Nii saab iga valgu translatsiooni toimumist organismis uurida. Miks bakterirakus ei hakka inimese geen kohe tööle? Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis on intronid ja eksonid. Pärast transkriptsiooni lõigatakse intronid välja ja ainult kokkuliidetud eksonid moodustavad
kui seni arvatud. Kuigi liikidevaheline hübridiseerumine teeb liikide piiritlemist fülogeneetilise analüüsi abil keerulisemaks, vähendades toetust ristuvate liikide klaadidele, annab just fülogeneetiline liigikontseptsioon kõige kindlama evolutsioonilise baasi seente süstemaatikale. Liikidevahelised hübriidid on identifitseeritavad teatud markerite abil. Epichloë/ Neotyphoideum liikide puhul on kasutatud hübriidsete tüvede tuvastamiseks markerina ß-tubuliini geeni (tub2) (Schardl & Craven, 2003). Kim et al. (2001) kasutasid geenidevahelise speisserregiooni (intergenic spacer, IGS) RFLP mustreid perekonna Armillaria liigisisese ja liikidevahelise hübridiseerumise tuvastamiseks. Fülogeneetilistest uuringutest nähtub, et iga heteroploid omab mingit osa või kogu geneetilist materjali, mis on pärit kahelt või enamalt eellaselt (Moon et al. 2000, 2002; Craven et al. 2001a).
2 Suhkrutel on oluline roll raku molekulaarse äratundmise, regulatsiooni ja kasvu protsessides, millega on seotud paljud haigusseisundid. Bakterid, viirused kasutavad raku pinnal asuvaid süsivesikuid, mis retseptoritena toimivad, peremeesraku äratundmiseks. Äratundmises ei osale vabad sahhariidid, vaid glükokonjugaadid - glükoproteiinid, proteoglükaanid, glükolipiidid. Suhkru osa sellest ulatub membraanist välja, toimides markerina. Oluline roll on glükosfingolipiididel, mis osalevad kasvu regulatsioonis (vähkkasvajad), olles samuti ka inimese veregrupi määrajad. Suhkrud ravimina Paljude antibiootikumide struktuuri osad. Streptomütsiin. Ebahariliku kujuga süsivesikud on tihti vajalikud aktiivse ravimi saamiseks, aeglustades sauti bakteriliini resistentsuse teket. Mehhanism tundmata. Asidotümidiin (HIV), atsükloviir. Digitoksiin (südamepuudulikkus). Loeng II Valgu struktuuritasandid 1
vähkkasvajate, immuunhaiguste ja nakkuste ravis. 2. Western blot valguanalüüsimeetodil kasutatakse antikehasid spetsiifiliste valkude tuvastamiseks. Valguanalüüsi käigus tekib helendust mõõtev signaalsait valgu ja antikeha vahel. 52. Mis on roheline fluorestseeruv valk? Milleks ja kuidas seda kasutatakse? Fluorestseeruvad valgud on valgud, mis helendavad ultraviolettvalgusega valgustamisel. See on hea marker geeniekspressioonil ja valgu asukoha kindlaksmääramisel. See toimib valgu markerina, ta viiakse plasmiidse DNA sees rakku ning sisseviidud DNA-valk saab seostuda just spetsiifilisse kohta rakus. Tänu fluoroessents-efektile on näha see spetsiifiline koht ka valgusmikroskoobis nähtav. 53. Kuidas konstrueerida üht transgeenset looma? Vastavalt soovitud omadustele tuleb vastav geen DNA-s asendada või välja lõigata. Seejärel tehakse mikrsüst plasmiidset DNA-d rakku, mis on viljaststud, kuid mille kaks erinevat geneetilist informatsiooni pole veel ühinenud (pronucleus)
Lohedes on sees juba taevas ja maa, hea ja kuri, algne dualism. Kosmoloogiline polariteet. Jõe ääres palju lohede jälgi. Kui M jõudis kose äärde nägi haigrut, silmitses teda. Haigru vaatas pingsalt jõge. "Mida sa seal näed?", küsis M. Haigru ütleb, et luurab maimusid. M ei usu seda. Kui too ütleb, mida ta näeb siis annab M talle mingi kaelaketi. Haigru on nõus. Seletusmuistend, müteem kus esitatakse lihtsalt mingi looduslik fakt, mida kõik teavad, mingisuguse kosmoloogilise markerina, tähisena, et eelajaloolisel ajal midagi sellist juhtus ja juhuslikult jäi selline jälg... Haigur ütles, et vaatab M op nahka, mis ripub lohede maja ees. Tapsid op ära. M küsib kuidas lohet tappa. Haigur on selline olend nagu peaingel kes õpetab inimest uputusest pääseda. Haigur räägib talle kuidas neid tappa. Hulk õpetusi mis on müütilise aja kontekstis mõistetavad. Oma kuju võidakse alati muuta. Prohvetlik ettenägevus, kõik õeldakse ette, mis juhtuma hakkab
Mõnikord ikterus, võib olla palpeeritav mass (pankrease turse, hiljem pseudotsüst või abstsess). Hemorraagilise pankreatiidiga patsiendil võib lisanduda Grey Turneri (hematoom küljel) või Culleni sümptom (hematoom naba ümber). Diagnoos: Ägeda pankreatiidi diagnoosi saab panna, kui esineb vähemalt kaks kolmest: iseloomulik vöötaoline valu, lipaasi/amülaasi vähemalt 3x tõus, radioloogiliselt sobiv leid. Lipaasi ja amülaasi aktiivsus ei korreleeru haiguse raskusega. Lipaas on markerina spetsiifilisem ja püsib vereringes kauem. UH vajalik kõigile patsientidele biliaarse etioloogia kinnitamiseks/ümberlükkamiseks. Kontrastiga KT patsientidele, kellel diagnoos ebaselge või pole positiivset dünaamikat 48-72t jooksul. Diferentsiaaldiagnoos: Peptiline haavand, kolelitiaas/kolangiit, koletsüstiit, õõnesorgani perforatsioon, soolesulgus, mesenteriaalne isheemia, hepatiit, apenditsiit, äge koronaarsündroom, KATE 17
põhjal restriktsioonisaitide suhtes polümorfne erinevate isolaatide puhul tekivad erineva pikkusega restriktsioonifragmendid. Restriktsioonifragmentide pikkuse polümorfismi RFLP-d on võimalik detekteerida näiteks "Southern blot" analüüsil. DNA restrikteeritakse, fragmendid lahutatakse geelelektroforeesil, kantakse filtrile ja hübridiseeritakse spetsiifilise radioaktiivse DNA prooviga. RFLP-d kasutatakse geneetilise markerina kromosoomide kaardistamisel. Samuti võimaldab RFLP analüüs hinnata, kas ristamisel saadud järglased on vanemtüüpi või rekombinantsed. juhul, kui on tegemist rekombinantidega, saab rekombinatsioonisageduse põhjal arvutada RFLP-de geneetilist distantsi. Sellist analüüsi on rakendatud näiteks taime Arabidopsis geneetilistes katsetes. RFLP markereid kasutatakse ka inimese kromosoomide kaardistamisel. Sel juhul on vaadeldud näiteks markerite segregeerumist suguvõsas
reageerivad nii ss-DNA-ga kui ds-DNA-ga dsDNA väga spetsiifiline SLE-le. dsDNA autoantikehade määramiseks kasutatakse testi Crithidiae luciliae. Antikehad võivad olla nii IgG kui ka IgM klassist. Üheks oluliseks tunnuseks SLE haigetel on anti-dsDNA antikehade esinemine kõrges tiitris. anti-dsDNA antikehad esinevad 70% aktiivse luupusega haigetest. Positiivse testi spetsiifilisus on 95%. Anti-RNP – 30-50% patsientidel eeskätt “overlap” sündroomi markerina Anti-Ro (30%) ja anti-La (15%) võivad esineda ka ANA-negatiivse SLE korral. Sagedamini leitakse neid primaarse Sjörgeni sündroomi korral Reumatoidfaktor – 30-60%-l tavaliselt madalamas tiitris kui RA (reumatoid artriidi) puhul SLE etioloogia on ebaselge. On leitud HLA-DR2 ja HLA-DR3 suuremat esinemissagedust. Vallandavateks teguriteks on peetud infektsioone, stressi, dieeti, keskkonna tegureid, UV-kiirgust. Kliiniline pilt haiguse
see, mis kõige enam mõjutab lõpptulemust. Prioriteediks on varane evakueerimine intensiivravi võimalustega raviasutusse. C – Circulation (vereringe) Hinnake vereringet hüpovoleemia nähtude suhtes. a) Milline on vaimne seisund? Kui patsient on teadvusel ja räägib, on aju verevarustus säilinud. b) Milline on nahavärv? Šokis patsient on iseloomulikult kahvatu ja higine. c) Lugege pulsisagedust: see suureneb verekaotuse markerina enne igasugust süstoolse vererõhu langust. Heas vormis jõulise täiskasvanu pulsisagedus puhkeolekus võib olla 50–60 korda minutis, seega võib pulsisagedus 100 viidata puhkeoleku sageduse kahekordistumisele. d) Radiaalse pulsi olemasolu on tsentraalse verevarustuse tagamiseks piisava süstoolse vererõhu robustne marker. Formaalset vererõhu mõõtmist aneroid-sfügmomanomeetriga võib takistada hindamise jaoks olemasolev aeg.
annaabi.ee 
