0,001 2 = 100% = 0,035% 2,859 0,0006 3 = 100% = 0,012% 4,8687 126394,416 4 = 100% = 2,952% 4281849,433 195689,877 5 = 100% = 3,448% 5675505 137805,879 6 = 100% = 3,915% 3519726,867 RI arvutuskäik: () - () = 100 + 100 [ ] (+1) - () 1) Esimene aine piik asub kromatogrammil heptaani (C7) ja oktaani (C8) vahel, kus tR7 ja tR8 on heptaani ja oktaani retentsiooniajad (aine aeg - tRZ) 2,859 - 2,341 1 = 100 7 + 100 [ ] = 752,06 752 3,336 - 2,341 2) Teine aine piik asub kromatogrammil oktaani (C8) ja nonaani (C9) vahel, kus tR8 ja tR9 on oktaani ja nonaani retentsiooniajad (aine aeg - tRZ) 4,408 - 3,336 2 = 100 8 + 100 [ ] = 880,179 880
Proovi hulk 0,5 l Töö käik: Tutvuda aparatuuriga; kontrollida aparatuuri tööks valmisolekut. Analüüsida alkaanide segu C5 C10. Analüüsida tundmatut orgaaniliste ainete segu, viies läbi kolm paralleelproovi. Valemid: 1) Leida tundmatute piikide retentsiooniindeksid RIPT , kasutades lihtsustatud valemit: RI PT =100 · z+100 · [ t R (x)-t R( z) t R( z+1) -t R (z) ] Otsitav 1. aine asub kromatogrammil heptaani (C7 ) ja oktaani (C8) vahel, kus tR7 ja tR8 on heptaani ja oktaani retentsiooniajad: aine aeg-t R 7 RI =100· 7+100 · t R 8-t R 7 6,515-4,897 RI =100· 7+100 · =¿ 769,56 7,223-4,897 Otsitavad ained teine ja kolmas asuvad kromatogrammil heptaani (C8 ) ja oktaani (C9) vahel, kus tR8 ja tR9 on oktaani ja nonaani retentsiooniajad: 8,660-7,223
Tulemused ja nende interpreteerimine: A. Kasutatud kolonni iseloomustavad parameetrid: · Täidise material ja mark: Destraan Sephadex G-75 · Täidist iseloomustuv pundumistegur k : k=0,1 · Täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L=32,5cm. d=1,9cm. · Täidise kogumaht Vt : Vt=92,1cm3. · Maksimaalne elueerimismaht Vxmax: Vxmax=82,89 · Fraktsioonide arv: n=42 B.Kromatogramm: C. Kromatogrammil näidatakse: Komponentid väljusid sellises järjekorras, sellepärast et Dekstraansinise molekulmass on kõige suurem, Müoglobiini molekularmass on suurem kui DNP-aspartaati molekulmass, aga väiksem kui Dekstraansinine. Kõige kiiremini väljuneb kõige suurema molekulmassiga aine. Kõige rohkem segus oli müoglobiini sisaldus, see on nähtav kromatogrammil. Dekstraansinine oli kõige väiksema sisaldusega aine segus. Vxmin= 24 ml=Vv Vx=46 ml Vxmax=78 ml D.
elueerimismaht Vx on vaadeldavad kolonnis kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf. Valem on selline: Rf=Vx-Vxmin/Vxmax-Vxmin, kusjuures Rf väärtused peavad jääma vahemikku 0...1. Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelise sõltuvuse graafik. Ainete väljumismahtusid näitavad nende fraktsioonide elueerimismahud, milles vastava aine kontsentratsioon on kõige kõrgem. Kromatogrammil on see ,,tipule" vastav maht. Praktikumis kasutatakse klaaskolonne, mis on juba eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Väiksema poorsusega, st tihedamad, Sephadex'i margid on mehaaniliselt tugevamad ja võimaldavad kolonni suhteliselt kiiret voolutamist. Kolonni alumine osa on täidetud klaasvillaga, et täidis ei saaks välja voolata. Kolonn on statiivi küljes ning selle alla peab mahtuma katseklaas. Täidise kõrgus on tavaliselt 25-30 cm ja täidise
152 31 2 1.392 32 2 1.447 33 2 1.155 34 2 0.798 35 2 0.493 36 2 0.259 Kromatogramm 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 C.Kromatogrammil näitan: Kõigepealt märkisin tabelisse värvidega, mis lainepikkustel neid mõõdetud sai. Sinised-670 nm, prune-410nm ja kollaseid- 360nm. Esimese kolonnist väljuva aine (esimene kõver kromatogrammil) , dekstraansinise, väljumismaht on minimaalne elueerimismaht Vv=Vx;min. See võrdub kolonni vaba mahuga ehk graanulitevahelise mahuga. Ta väljus esimesena, sest tema molekulid on liiga suured ning ei mahu geeli pooridesse, tema molekulmass on suurim
[ 6,774−5,183 RIPT, esimene= 100∗7 +100∗ 7,565−5,183 = ¿ 766,79 ] (tolueen, 765) [ 9,649−7,565 RIPT, teine= 100∗8+100∗ 9,757−7,565 = ¿ 895,07 ] (o-ksüleen, 895) [ 10,295−9,757 RIPT, kolmas= 100∗9+100∗ 11,522−9,757 = ¿ 930,48 ] (isopropüülbenseen, 927) Ainete %-lise sisaldus oli antud kromatogrammil ning sisaldub arvutustele eelnevas tabelis. Valem normalisatsiooni meetodil aine %-lise koguse leidmiseks on järgmine: Ax X= ∗100 A1 + A 2+ …+ A i Järeldused: Alkaanide segu järgi arvutatud retensiooniindeksite põhjal on kolme tundmatu aine seguga proovis järgmised ained: tolueen, 26,838%, 1,2-dimetüülbenseen ehk o-ksüleen, 36,245% ning isopropüülbenseen, 36,918%. Nagu võiski eeldada, väljusid ained keemistemperatuuride tõusu järgi
Proovi maht: 20 l Proovi süstimiseks vajalikud parameetrid: Eluent: 30% atsetonitriili, 70% vett ja 0,1% äädikhape vesilahus Standardne voolukiirus: 70 l/min Lainepikkus: 280 nm Saasteainete identifitseerimine: Orgaaniliste ainete identifitseerimine vees on keeruline protseduur. Konkreetset ainet on väga lihtne identifitseerida, kui on olemas autentne võrdlusaine ehk standardaine. Selleks süstitakse vedelikkromatograafi uuritav proov ning standardlahused. Edasi võrreldakse kromatogrammil proovi ja standardlahuste retentsiooniaegu. Retentsiooniaeg on aeg, mis on vajalik ½ aine koguse elueerimiseks kolonnist. Ainete retentsiooniajad on põhimõtteliselt individuaalsed, s.t. et piigi retentsiooniaja järgi saab kindlaks teha aine, mis sellele piigile vastab (joon. 1). Joon. 1. Tüüpiline kromatogramm Saasteainete kvantitatiivne määramine: Saasteainete kvantitatiivse sisalduse määramiseks kasutatakse välisstandardmeetodeid, kus
hindamiseks. (standardi suhtes). Kujutab ennast ühe aine Rf väärtuse suhet standardiks võrtud aine Rf väärtusesse. Valitakse standard nii, et Rs jääks piiridesse 0,5-2. Kasutatakse orienteeruvaks samastamiseks Rs = Rfproov/Rfstandard.. Tegelik samastamine toimub analüüsitava aine ja sama aine autenstse näidise üheaegsel kromatograf-l ühel plaadil. Kui proovid on identsed, on laikude valiums ühesugune ja neil on võrdsed Rf väärtused. Segu kui tegu on sama ainega, siis peab kromatogrammil ilmuma vaid üks laik. Kromat-seks tuleb valida selliseid tingimused (sorbendi materjal ja eluendi koostis) et Rf väärtus erineks nullist (aine ei lahku stardijoonelt) ja ühest (aine liigub frondijooneni). Lisanditel ja põhiainel peavad olema erinevad Rf väärtused. KROMATOGRAMMI ANALÜÜS. Kromatogramm kõver, mis moodustab rea piike nii palju pike, kui palju oli uuritavaid aineid. Esimene piik on liikumatu faasiga mitteseondunud aine piik.
Retsensiooniruumala VR - mobiilse faasi ruumala, mis on vajalik kuni aine piigi maksimumi ilmumiseni. Surnud aeg tm - aine retsensiooniaeg, kui puudub interaktsioon statsionaarse faasiga, liigub sama kiiresti kui mobiilne faas. 10. Protsessi lahutuvus (definitsioon, valem) Lahutuvus - kolonni võimsus lahutada kaks piiki. 11. Mahtuvusfaktor (definitsioon, valem) Mahtuvusfaktor ehk retsensiooni faktor on piigi asukoha mõõduks kromatogrammil ning on konstantne antud tingimustes antud ühendile. 12. Selektiivsus (definitsioon, valem) Selektiivsus - see on kromatograafilise süsteemi omadus `keemiliselt' eristada kahte erinevat ainet. 13. Efektiivsus (definitsioon, valem) Efektiivsus arvestab retsentsiooniaega ja piigi laiust. Teoreetiliste taldrikute arv (N) on kolonni efektiivsuse numbriline näitaja. 14. Gaasikromatograafia põhimõte
eluaadi kogumaht kuni DNP-aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx3= Vxmax= 33 + 2 29= 91 ml Arvutatud Vxmax= 91,8 cm3 Mõõdetud Vxmax= 91 cm3 Müoglobiini liikuvusteguri Rf väärtus, kasutades arvutuslikku Vxmax väärtust Rf= (Vx-Vxmin)/(Vxmax-Vxmin)= (49-37)/(91,8-37)0,22 Järeldused Katse põhjal võis kindlaks teha, et suurim molekulmass on dekstraansinisel, talle järgneb väikese vahega müoglobiin ning väikseimat molekulaarmassi omab DNP-aspartaat. Kromatogrammil on ainete kontsentratsioonide üleminekud kindlalt piiritletud ning sujuvad.
Olenevalt ainest, tuleb indikaatorlaikude visualiseerimiseks kasutada erinevaid meetodeid. Kui lahutatud ained UV-kiirguses fluorestseeruvad, võib nende asukohad kindlaks teha UV-lambi abil. Kui aga lahutatud ained ei fluorestseeru, võib kasutada spetsiaalseid UV-kiirguses fluorestseeruvaid kromatograafilisi plaate. Sellisel juhul jäävad indikaatorlaigud UV-lambi all nähtavaks tumedate aladena üldisel fluorestseeruval taustal (plaadil). Teatud ained muutuvad kromatogrammil tumedate laikudena nähtavaks joodikambris ilmutamisel. Ideaaljuhul on kõik segu komponendid ruumiliselt lahutatud ja paiknevad kromatogrammil selgepiiriliste väikeste laikudena. Jaotuskoefitsient, Rf (retention factor) jaotuskoefitsient (retentsiooni koefitsient), aine poolt kromatograafilisel plaadil läbitud tee pikkuse ja vooluti frondi poolt läbitud tee pikkuse suhe. Võimaldab väljendada individuaalse aine liikumist
67. Kvalitatiivne ja kvantitatiivne analüüs. Kvalitatiivne analüüs Uuritakse, millised ained on uuritava objekti sees. Ainete retentsiooniajad on individuaalsed. Piigi retentsiooniaja järgi saab kindlaks teha aine, mis sellele piigile vastab. Võrreldakse mõõdetud retentsiooniaega tuntud aine retentsiooniajaga. Kvantitatiivne analüüs Uuritakse kui palju on aineid objekti sees . Sisestandardi korral lisatakse proovile ainet, mille kogus on teada ja mille piik kromatogrammil ei kattu teiste piikidega. Välisstandard – kalibratsioon standardlahustega Välise standardi meetod on analoogiline, kuid standardipiigi pindala mõõtmiseks sooritatakse kromatograafiline analüüs, kus prooviks on ainult standard. Sisestandardi meetod on eelistatavam, kuna analüüsi tingimused on ühesugused nii proovi komponentide kui ka standardi jaoks. 68. Analüüsiobjekt ja proov.
Mitmesuguste objektide keemilise koostise määramine 41. Kvalitatiivne ja kvantitatiivne analüüs. Kvalitatiivne analüüs Ainete retentsiooniajad on individuaalsed. Piigi retentsiooniaja järgi saab kindlaks teha aine, mis sellele piigile vastab. Võrreldakse mõõdetud retentsiooniaega tuntud aine retentsiooniajaga. Kvantitatiivne analüüs Sisestandard huvipakkuv aine ise (standardi lisamise meetodi puhul) Sisestandardi korral lisatakse proovile ainet, mille kogus on teada ja mille piik kromatogrammil ei kattu teiste piikidega. Välisstandard kalibratsioon standardlahustega Välise standardi meetod on analoogiline, kuid standardipiigi pindala mõõtmiseks sooritatakse kromatograafiline analüüs, kus prooviks on ainult standard. Sisestandardi meetod on eelistatavam, kuna analüüsi tingimused on ühesugused nii proovi komponentide kui ka standardi jaoks. 42. Analüüsiobjekt ja proov.
85. Kromatograafia põhimõte. Kromatograafia on sisuliselt meetodite grupp segudes ainete eraldamiseks uksteisest. Kromatograafia on enam-vahem koige voimsam segude analuusimise vahend, mis olemas on. 86. Mis on kromatogramm ja kuidas saab leida aine hulka kromatogrammilt? Kromatogramm on kromatograafi registreerimisseadme väljund graafiliselt paberil või numbrilisel kujul ja näitab kromatograafiliselt lahutatud komponentide suhtelist sisaldust proovis. Piigi asukoht kromatogrammil näitab aine kolonnist väljumise aega ja piigi suurus näitab, kui palju komponenti proovis on. 87. Kuidas saaks kasutada kromatograafilist meetodit? Pinnanähtused ja adsorptsioon 88. Kolloidsüsteemide jaotus. 89. Kolloidsüsteemide tekke tingimused. 90. Koagulatsioon. Koagulatsioon on kolloidsüsteemi osakeste liitumine suuremateks osakesteks, mis kas settivad lahuses või moodustavad erilise struktuuri koageeli.
Analüütiline keemia 52. Analüütilise keemia eesmärk. Mitmesuguste objektide keemilise koostise määramine. Kvalitatiivne ja kvantitatiivne analüüs. 53. Kvalitatiivne ja kvantitatiivne analüüs. Kvalitatiivne analüüs Uuritakse, millised ained on uuritava objekti sees. Ainete retentsiooniajad on individuaalsed. Kvantitatiivne analüüs Uuritakse kui palju on aineid objekti sees . Sisestandardi korral lisatakse proovile ainet, mille kogus on teada ja mille piik kromatogrammil ei kattu teiste piikidega. 54. Analüüsiobjekt ja proov. Analüüsiobjekt on objekt, mille keemilist koostis me keemilise analüüsi teel määrame:tavaliselt määratakse huvipakkuva osa koostis ja sisaldus, kuna analüüsiobjektid on enamasti liiga suured selleks, et neid tervenisti analüüsiks kasutada •Proov on osa analüüsiobjektist, mida kasutatakse analüüsil. 55. Analüüt ja maatriks. Analüüt on aine, mille sisaldust me analüüsiobjektis määrata soovime, maatriks on
47. Kromatograafia Kromatograafia on sobiv meetod erinevate segude analüüsiks, segudes eraldatakse ained üksteisest. Statsionaarne faas (ehk paigalseisev faas): Kolonnis paiknev aine, mis kolonnist läbi liikuvaid molekule enda külge seob ja siis jälle vabastab. Mobiilne faas (ehk liikuv faas): Vedelik või gaas mis läbi kolonni voolab ja uuritavaid aineid edasi kannab Retentsiooniaeg: Aeg, mis kulub aine sisestamisest tema piigi maksimumi väljumiseni kromatogrammil. 48. Elektroforees - elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Kui osakesed liiguvad elektriväljas katoodile, on see kataforees, kui anoodile, siis anaforees. Seda omadust, et erisuguse suuruse ja laenguga osakesed liiguvad elektroodide vahel erineva kiiruse ja suunaga, rakendatakse aineosakeste üksteisest eraldamiseks vastavalt nende laengule või suurusele
analüüs. 44. Kvalitatiivne ja kvantitatiivne analüüs. Kvalitatiivne analüüs Uuritakse, millised ained on uuritava objekti sees.Ainete retentsiooniajad on individuaalsed. Piigi retentsiooniaja järgi saab kindlaks teha aine, mis sellele piigile vastab. Võrreldakse mõõdetud retentsiooniaega tuntud aine retentsiooniajaga. Kvantitatiivne analüüs Uuritakse kui palju on aineid objekti sees . Sisestandardi korral lisatakse proovile ainet, mille kogus on teada ja mille piik kromatogrammil ei kattu teiste piikidega. Välisstandard – kalibratsioon standardlahustega Välise standardi meetod on analoogiline, kuid standardipiigi pindala mõõtmiseks sooritatakse kromatograafiline analüüs, kus prooviks on ainult standard. Sisestandardi meetod on eelistatavam, kuna analüüsi tingimused on ühesugused nii proovi komponentide kui ka standardi jaoks. 45. Analüüsiobjekt ja proov. •Analüüsiobjekt on objekt, mille keemilist koostis me keemilise analüüsi teel
See on enam-vähem kõige võimsam segued lahustamise analüüsimise vahend, mis olemas on. Statsionaarne faas e sorbent e täidis – kromatograafia kolonnis paiknev aine, milles kolonnist läbi liikuvad molekulid absorbeeruvad-desorbeeruvad või adsorbeeruvad- desorbeeruvad. Mobiilne faas – vedelik (eluent) või gaas (kandegaas), mis läbi kolonni voolates uuritavaid aineid edasi kannab. Retentsiooniaeg – aeg, mis kulub aine sisestamisest tema piigi maksimumi väljumiseni kromatogrammil Kui kolonni otsa ühendatud detector, mis on tundlik lahustatavate ainete suhtes, siis saab detektori signaali ajas registreerida: saadakse kromatogramm. Igale individuaalsele ainele vastab maksimum – piik. Õnnestunud kromatografeerimise korral on kõikide analüütide piigid üksteisest lahus. Meetodid: mobiilse faasi järgi: vedelik-kromatograafia; gaasikromatograafia. vastasmõju järgi: adsorptsioonkromatograafia; jaotuskromatograafia; ioonkromatograafia: …
Ba2+ 25 mg/l Eluent: 0,025 M fenüleendiamiindihüdrokloriid/0,025 M HCl 5.4 Ainete identifitseerimine mass-spektromeetriliselt mass Segu lahutamine komponentideks kromatograafiliselt: kromatograafiliselt · Retentsiooniaegade võrdlemine · "Tundmatu" piik kromatogrammil? · Mass-spektromeetriline spektromeetriline detekteerimine: detekteerimine aine molekul viimine gaasifaasi ioniseerimine fragment-ioonide ioonide teke mõõdetakse tekkinud ioonide massi ja laengu suhted, m/z spekter ioonide arvukus = f(m/z) iseloomulik konkreetsele ainele! Analüüsi tulemusena saadakse ainele vastavad mass-spektrid, spektrid, mida võrreldakse
Kromatogramm on kromatograafi registreerimisseadme väljund graafiliselt paberil või numbrilisel kujul ja näitab kromatograafiliselt lahutatud komponentide suhtelist sisaldust proovis. Kromatograafilise kolonni väljundis registreeritakse detektori signaal. See signaal töödeldakse registraatoris ja tulemus esitatakse tavaliselt komponentide kontsentratsiooni ajalisele muutusele vastavate kolmnurgasarnaste piikidena (dc/dt). Ainete piikide vahel on liikuva faasi tsoonid. Piigi asukoht kromatogrammil näitab aine kolonnist väljumise aega ja piigi suurus näitab, kui palju komponenti proovis on. Teatud lisaanalüüsidega on võimalik kromatograafiat kasutada analüüsitava proovi kvalitatiivse ja kvantitatiivse koostise määramiseks. Näiteks võib aineid kindlaks teha (identifitseerida) suhteliste väljumisaegade (retentsiooniaeg) põhjal, kui neid võrrelda teadaolevate ainete andmetega.
Sama protseduuri (denaturatsioon, liitmine ja ahela süntees) korrata 20-45 korda (s.o. 1 million kuni 35 trillionit koopiat). Jahutame 4°C ja säilitame paljundatud DNAd analüüsideks. Kaasaegne automatiseeritud sekveneerimine fluorestseeriva märgiga: 4 värviga märgitud nukleotiidid ühes tuubis ja foreesitakse ühel joonel polüakrüülamiid geelis või siis kapillarides, millistes on geel. UV laser detekteerib värvid ja loeb järjestuse. Järjestus visualiseerub eri värvidega kromatogrammil, mis vastab nukleotiidide järjestusele. Väljund umbes 1200 aluspaari reaktsioonis ja 96 reaktsiooni 3 tunni jooksul. Enamus automatiseeritud sekvenaatoreid laetakse robotitega ja need töötavad 24 tundi järjest. Minimaalne tööjõu kulu. DNA fingerprinting ehk DNA tüpiseerimine (profiling). Ei ole olemas kahte ühesuguse genotüübiga sugulisel teel paljunevat organismi (va. Ühemuna kaksikud) sest: Meioosi I
¾ täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter, ¾ arvutatud täidise kogumaht Vt , ¾ arvutatud maksimaalne elueerimismaht Vxmax, ¾ arvutuslik fraktsioonide üldarv n. B. Tuuakse ära mõõtmistulemuste tabel ja selle alusel koostatakse kromatogramm, st graafiline sõltuvus, mille x-teljel on eluaadi maht (V, ml) ja y-teljel aine kontsentratsioon, väljendatuna eluaadi vastava fraktsiooni absorptsiooni (optilise tiheduse) väärtusena (tähis A või D). C. Kromatogrammil näidatakse: ¾ milline on iga segus sisalduva komponendi elueerumisprofiil ja põhjendatakse, miks komponendid väljusid just niisuguses järjekorras, st selgitatakse, millises oma- vahelises suhtes on komponentide molekulmassid, ¾ milline on eluaadi maht kuni dekstraansinise krgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni (kaasa arvatud) väljumiseni Vxmin = Vv, 56
adsorptsiooni- või jaotusomaduste erinevuste järgi. Moodsamad seadmed ka mõõdavad vastava aine sisalduse proovis. Põhimõte mobiilne faas kannab erinevaid aineid läbi statsionaarse faasi erineva kiirusega, mistõttu ained eralduvad. Jaotus mobiilse faasi järgi: vedelik- ja gaasikromatograafia. Jaotus vastasmõju järgi: adsorptsioon-, jaotus-, ioonkromatograafia, ... Jaotus tehnilise teostuse järgi: kolonn-, planaarkromatograafia. 105. Kuidas saab teada, millistele piikidele kromatogrammil millised ained vastavad? Enamik detektoreid ei võimalda aine identifitseerimist, st tekib piik, aga mis aine oma, me ei tea. Sel juhul identifitseeritakse aine retentsiooniaja järgi eelnevalt peab vastava aine I don't want to know the answers, I don't need to understand retentsiooniaeg teada (määratakse tunnusaine abil). Massispektromeetriline detektor võimaldab sageli aineid identifitseerida ka ilma tunnusaineta.
annaabi.ee 
