coli'ga. Avastas DNA sünteesi mehhanismi in vitro Vajalik neli komponenti: 1. dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP (deoxyribonukleosiid 5'trifosfosfaadid) (suhkuralus + 3 fosfaati) 2. DNA matriits 3. DNA polümeraas I (Kornbergi ensüüm) (DNA polymeraas II ja III avastati veidi hiljem) 4. Mg 2+ (optimeerib polümeraasi aktiivsuse) 1959: Arthur Kornberg (Stanford University) ja Severo Ochoa (NYU) DNA süntees: 1. DNA polümeraas I katalüüsib fosfodiester sideme moodustumist deoksüriboosi 3'OH (viimasel nukleotiidil) ja dNTP 5'fosfaadi vahel · Energia saadakse kahe fosfaatrühma vabanemisel 2. DNA polümeraas I "leiab ülesse" õige komplementaarse dNTP kogu elongatsiooni vältel · kiirus 800 dNTP/sekundis · Madal vale paardumiste määr 3. Sünteesi suund alati 5' 3' DNA elongatsioon: DNA elongatsioon: Polümeraasid
Nukleotiidide lühiiseloomustus Nukleotiidid on nukleiinhappe monomeerid. Nukleiinhapped on kõrgmolekulaarsed ühendid, milles nukleotiidijäägid on omavahel seotud fosfodiester sidemetega. Jaotus: DNA desoksüribonukleiinhape (koosneb desoksüribonukleotiididest) RNA ribonukleiinhape (koosneb ribonukleotiididest) Nukleotiidid on kolmekomponend ilised süsteemid, mis koosnevad: 5C suhkrust ehk pentoosist N-alusest ühest või mitmest fosforhappe jäägist Nukleotiiddi koosnevad kolmest komponendist: a. viiesüsinikuline suhkur e pentoos: · RNA´s riboos, · DNA´s- desoksüriboos (teise süsiniku juures OH asemel on H) b. lämmastikalus:
mitmed nukleotiidid on liitensüümides mittevalguliseks osaks (tavaliselt kohaks, kus toimub reaktsioon) 4. osad nukleotiidid on antibiootilise toimega (tapavad baktereid) 5. tsüklilise ehitusega nukleotiidid nt cAMP on biosignaalide vahendajad (virgatsühendid ehk käskjalad) 6. disainitud ehitusega nukleotiidid on kasvajate vastased ravimid (keemiaravi ehk kemoteraapia) Nukleiinhapped On kõrgmolekulaarsed ühendid, milles nukleotiidijäägid on omavahel seotud fosfodiester sidemetega. Jaotus: 1. DNA - desoksüribonukleiinhape 2. RNA - ribonukleiinhape Füüsikalis- keemilised omadused: 1. Suur molekulmass, mis annab lahustele viskoosse iseloomu 2. Laeng, mis on negatiivne 3. Lahustuvus 4. Hüdrulüüsuvus, tek vabad nukleotiidid 5. Nukleiinhapete kõrgemat järku struktuurid denatureeruvad DNA koostis ja ehitus 1. Koostis a) pentoos: desoksüriboos b) lämmastikalused, mida on 4 jag: puriinalused ehk kahetsüklilised (adeniin A ja
A adeniin (adenosiin) G guaniin (guanosiin) C tsütosiin (tsütidiin) T tümiin (tümidiin) Suhkrujääk desoksüriboos, fosforhappejääk. RNA-l on tümiini asemel uratsiil, seega A, G, C ja U; suhkrujääk riboos, fosforhappejääk. Nukleosiid: alus+suhkur Nukelotiid: alus+suhkur+1-3 fosfaatrühma Sidemed nukleotiidide vahel: lämmastikaluse ja suhkru vahel on glükosiidne side nukleotiidide vahel on fosfodiester sidemed H ja O vahel on vesinikside DNA struktuur: 4 desoksüribonukleotiidi A adenosiin G guanosiin C tsütidiin T tümidiin Paardumine vesiniksidemete abil: A ja T kaksikside G ja C kolmikside DNA kaksikahelad pole paralleelsed, kuid on komplementaarsed. Kaksikahelad on paremale pöörduvad. Molekulaarsed vaod: väike vagu, suur vagu. RNA on üheahelaline, DNA on kaheahelaline.
Transformatsiooni võime kadus. 3. Nukleotiidide ehitus DNA-s ja RNA-s? Nukleiinhapped koosnevad nukleotiididest, jagatakse: - RNA (ribonukleiinhape) leidub peamiselt tuuma tuumakeses ja üksikute molekulidena tsütoplasmas - DNA (desoksüribonukleiinhape) paikneb tuumas, mitokondrites, kloroplastides - DNA ja RNA on negatiivse laenguga tänu fosfaatrühma laengule nukleotiidides 4. Kuidas toimub fosfodiester sideme moodustumine nukleotiidide vahele? Nukleotiidid polünukleotiidahelas on kovalentselt seotud fosfodiestersidemete kaudu. 2 polünukleotiidahelat on omavahel seotud vesiniksidemete kaudu, mis tekivad lämmastikaluste vahel. Alustevaheline paardumine on spetsiifiline: A paardub T-ga ja G paardub C-ga. Seega koosnevad kõik aluspaarid ühest puriinist ja pürimidiinist. Lämmastikaluste spetsiifilise paardumise määrab ära see, et vesiniksidemed saavad
(8) Kuumuta 95 oC, 2-3 min (DNA denatureerub, ahelad eralduvad) ja jahuta jääl. (9) Säilita selliselt saadud fluorestsents-märgitud DNA 4oC juures, kuni automaatsekvenaatorisse panemiseni. 12 Lisaülesanded: 5.1) Sekveneerimissegu sisaldab nii dNTP kui ddNTP, mis on nende erinevus? dNTP- desoksüribonukleotiid- OH rühm puudub 2´asendis. ddNTP- didesoksüribonukleotiid- OH rühm puudub 2´ja 3´ asendites. Kuna ddNTP-l pole OH rühma 3´asendis ta ei ole võimeline moodustada fosfodiester sideme järgmisega nukleotiidiga. 5.2) Kui ddNTP inkorporeerub kasvavasse DNA ahelasse, miks ekstensioon termineerub? Kui ddNTP inkorporeerib kasvavasse DNA ahelasse, termineerub ekstensioon, sest ddNTP-l pole OH rühma 3´asendis ja ta ei ole võimeline moodustada fosfodiestersideme järgmise nukleotiidiga. 5.3) Pikemad järjestused (>1000 nt) sekveneeritakse järestuse otstest kahe erineva vastassuunalise praimeriga kahes erinevas katseklaasis
valime sellise restriktaasi, mis lõikab katki sobivaid järjestusi. Kuidas me teame DNA nukleotiidset järjestust? Sequencing sekveneerimine. DNA nukleotiidse järjestuse väljaselgitamise meetodi mõtles välja F.Sanger. metoodika baseerub sellel, et Sanger võttis kasutusele nn modifitseeritud nukleotiidid. /ribonukleotiidis on nii 3' positsioonis ja 2' positsioonis on riboosi jäägi küljes OH rühmad, desoksüribonukleotiidis on hapnik puudu 2' positsioonist puudu. OH rühm on vajalik fosfodiester sidemete moodustamiseks./ Modifitseeritud nukleotiidil puudub OH rühm ja ahela polümeriseerimine sellest nukleotiidist edasi ei ole võimalik. Seda didesoksüribonukleotiidi saab ahelasse lülitada seepärast, et 5' positsioonis oleva süsiniku juures olevad fosfaatrühmad, mis moodustavad keemilist sidet, seega saab seda nukleotiidi panna eelmise normaalse nukleotiidi otsa, kui järgmist lülitada pole võimalik, kuna puudub vaba 3' hüdroksüülrühm.
insert seda ensüümi kodeeriva järjestuse „ära rikkunud“. 47. Ligeerimiseks tuleb pipeteerida kokku ligeerimissegu (5 μl), segada pipeti või vorteksi abil, vajadusel fuugida ning jäta ligeerimiseks järgmise päevani +4 °C juures. Ligeerimissegu: 1 μl puhastatud PCRi produkti 1 μl pSTBlue-1 vektorit (9 ng/μl) 0,5 μl 10x puhvrit 1 μl T4 DNA ligaasi (sünteesib fosfodiester sidemeid) 1,5 μl MQ vett 48. 49.Transformeerimine 50. Eesmärgiks on peale ligeerimist saadud DNA molekuli viimine kompetentsetesse E. Coli bakterisse ja see on oluline selleks, et saaksime kiiresti ja odavalt ning väga väikese vigade hulgaga palju seda plasmiidi (paljundame seda bakteris). Bakterid on eelnevalt töödeldud divalentsete katioonidega (Ca2+, Mn2+), mis muudab rakuseina laengu positiivseks. Plasmiidse DNA lisamisel kinnitub see rakuseinale
”Rakubioloogia II” aineprogramm. DNA struktuur ja funktsioonid. Nukleotiidide koostisosad (lämmastikalused, suhkur, fosfaatgrupp). Lämmastikalused puriinid:adeniin,guaniin 2-tsüklilised Lämmastikalused pürimidiinid:uratsiil, tümiin, tsütosiin- ühetsüklilised Suhkur:pentoos-riboos või desoksüriboos Nukleosiid: alus + suhkur (dAMP,dGMP) Nukleotiid: alus 1´ + suhkur + fosfaatgrupp 5´ Keemilised sidemed DNA kaksikheeliksis. Nukleiinhappe teke: fosfodiester sidemetega ühendatud 5´algus 3´ lõpp süsinikega. Uus nukleotiid lisatakse 3´otsa. Nukleotiidide vahel on vesinikside DNA polünukleotiidisete üksikahelate keemiline polaarsus. DNA kaksikahelas olevate polünukleotiidide vastassuunalisus e. Antiparalleelsus- kaksikahel, üks kulgeb 5´3´ ja teine 3´5´ Nukleotiidide komplementaarsuse printsiip- lämmastikaluste võime omavahel seonduda jamoodustada paar A=T(U), G=C
pärineb emamolekulist ("vana"), teine on sünteesitud ("uus") kahesuunaline (bidirectional) - sisaldab kahte replikatsioonikahvlit ehk replikatsiooniharki, mis liiguvad vastassuunas poolkatkendlik (semidiscontinuous) üks ahel (nn juhtiv ahel) kopeerub katkematult, mahajääv ahel kopeerub segmentide kaupa (Okazaki fragmendid), mis seejärel omavahel ühendatakse Replikatsiooni ensüümid: DNA polümeraasid - katalüüsivad 3'®5' fosfodiester- sidemete sünteesi : DNA polümeraas III - peamine replikatsiooni ensüüm, vajab RNA praimereid ; 10 subühikut, kiirus kuni 1 kb/s DNA polümeraasid I, II ja V - osalevad peamiselt vigade parandamisel DNA Polümeraas I lõikab praimerid välja ja täidab lüngad Helikaasid kaksikheeliksi lahtikeeramine DNA güraas e. topoisomeraas lahtikeerdumisest tingitud pingete kompenseerimine, st DNA ahela läbilõikamine ja taas-ühendamine
), mis sisaldab 2 makroergilist sidet ja kummagi hüdrolüüsil vabaneb 40 kJ energiat. Monofosfaatses vormis võib ATP olla nukleiinhappele ehitusüksuseks (tsükliline adenosiinmonofosfaat e cAMP). Orgaanilised ühendid Nukleiinhapete strukutuuri tasemed: Kõik nukleiinhapped omavad 3 tüüpi struktuure: a) primaarstruktuur nukleotiidide seondumine lineaarsesse ahelasse fosfodiester sidemete abil st P-happejäägid seonduvad üle pentooside; b) sekundaarstruktuur paardunud eriahelad või samad ahelad A=T G=C c) tertsiaalstruktuur juhul kui NH omandab kindla ruumilise kujundi. Toimub enamasti teiste molekulide kaasabil, peamiselt nukleoproteiinses vormis. 5.4. Ülesanded ja tähtsus · DNA ülesanne on päriliku info säilitamine ja edasi andmine võimalikult muutumatul kujul. · RNA ülesanded:
), mis sisaldab 2 makroergilist sidet ja kummagi hüdrolüüsil vabaneb 40 kJ energiat. Monofosfaatses vormis võib ATP olla nukleiinhappele ehitusüksuseks (tsükliline adenosiinmonofosfaat e cAMP). Orgaanilised ühendid Nukleiinhapete strukutuuri tasemed: Kõik nukleiinhapped omavad 3 tüüpi struktuure: a) primaarstruktuur – nukleotiidide seondumine lineaarsesse ahelasse fosfodiester sidemete abil st P-happejäägid seonduvad üle pentooside; b) sekundaarstruktuur – paardunud eriahelad või samad ahelad A=T G= C c) tertsiaalstruktuur – juhul kui NH omandab kindla ruumilise kujundi. Toimub enamasti teiste molekulide kaasabil, peamiselt nukleoproteiinses vormis. 5.4. Ülesanded ja tähtsus DNA ülesanne on päriliku info säilitamine ja edasi andmine võimalikult muutumatul kujul. RNA ülesanded:
), mis sisaldab 2 makroergilist sidet ja kummagi hüdrolüüsil vabaneb 40 kJ energiat. Monofosfaatses vormis võib ATP olla nukleiinhappele ehitusüksuseks (tsükliline adenosiinmonofosfaat e cAMP). Orgaanilised ühendid Nukleiinhapete strukutuuri tasemed: Kõik nukleiinhapped omavad 3 tüüpi struktuure: a) primaarstruktuur nukleotiidide seondumine lineaarsesse ahelasse fosfodiester sidemete abil st P-happejäägid seonduvad üle pentooside; b) sekundaarstruktuur paardunud eriahelad või samad ahelad A=T G=C c) tertsiaalstruktuur juhul kui NH omandab kindla ruumilise kujundi. Toimub enamasti teiste molekulide kaasabil, peamiselt nukleoproteiinses vormis. 5.4. Ülesanded ja tähtsus · DNA ülesanne on päriliku info säilitamine ja edasi andmine võimalikult muutumatul kujul. · RNA ülesanded:
pärilikkusaine. DNA on hilisema tekkega kuna rna oli väga ebastabiilne. Nucleotiid = monomeerid, millest on ehitatud DNA ja RNA. Koosnevad kolmest komponendist. 1. Pentoos (5-süsinikuga) suhkur. DNA = deoksüriboos, RNA = riboos. 2.Lämmastikalused: Puriinid, Adeniin (A), Guaniin(G) Pürimidiin: Tsütosiin (C), Tümiin (T,)Uratsiil (U; RNA 3. Fosfaat rühm seob 5' süsiniku. Nukleotiidid on omavahel ühendatud fosfodiester sidemega. See on kovalentne side ühe nukleotiidi fosfaatrühma(5' C) ja teise nukleotiidi suhkru vahel (3' C). See on tugev side ja seepärast on nukleotiidide ahel väga stabiilne. Näevad välja suhteliselt ühesugused. Kui nad omavahel ühinevad läbi fosfodiestersideme, on nad keemiliselt erinevate otstega seotud. DNA mudel: kuus põhiomadust 1. Kaks polünukletiidset ahelat on keerdunud omavahel kellaosuti suunas (parempoolselt) 2
Nukleiinhapped- on polümeerid, mille monomeerideks on nukleotiidid. Nukleiinhappeteks on : 1) RNA (ribonukleiinhape) geneetilise informatsiooni kandja, mis koosneb ribonukleotiididest. 2) DNA (desoksüribonukleiinhape)- geenetilise informatsiooni vahendaja, mis koosneb desoksüribonukleotiididest. 4.Nukleotiidide lühiiseloomustus Nukleotiidid on nukleiinhappe monomeerid. Nukleiinhapped on kõrgmolekulaarsed ühendid, milles nukleotiidijäägid on omavahel seotud fosfodiester sidemetega. Jaotus: DNA desoksüribonukleiinhape (koosneb desoksüribonukleotiididest) RNA ribonukleiinhape (koosneb ribonukleotiididest) Nukleotiiddi koosnevad kolmest komponendist: a. viiesüsinikuline suhkur e pentoos: · RNA´s riboos, · DNA´s- desoksüriboos (teise süsiniku juures OH asemel on H) b. lämmastikalus: · RNA´s- Adeniin, Guaniin, (C) tsütosiin, Uratsiil. · DNA´s- Adeniin, Guaniin, (C) tsütosiin, Tümiin. c. fosfaatrühm.
()-riboos ()-desoksüriboos (RNA) (DNA) 2. Milline suhkur kuulub DNA koostisesse (ka RNA kohta)? DNA RNA (desoksüriboos) (riboos) 3. Joonistage DNA ahelas nukleotiidijääke ühendav keemiline side (ka RNA kohta). pildil RNA, DNA ka ühendatud fosfodiester sideme kaudu. 4. Kas DNA on füsioloogilise pH juures: a) laenguta b) positiivse laenguga c) negatiivse laenguga 5. Milline nukleotiid on kujutatud joonisel, kas ta kuulub DNA või RNA koostisesse (kõik neli NMP-d ja neli dNMP-d)? Guanosiin( 5´monofosfaat.) DNA koostises. 6. Kas joonisel toodud nukleotiidis esineb puriin või pürimidiin lämmastikalus? (kokku 5 erinevat). Pürimidiin; tsütosiin adeniin(püriin) guaniin(püriin) tümiin(pürimidiin)
ATP on universaalne energiasalvesti (mitte allikas!), mis sisaldab 2 makroergilist sidet ja kummagi hüdrolüüsil vabaneb 40 kJ energiat. Monofosfaatses vormis võib ATP olla nukleiinhappele ehitusüksuseks (tsükliline adenosiinmonofosfaat e cAMP). Nukleiinhapete strukutuuri tasemed: Kõik nukleiinhapped omavad 3 tüüpi struktuure: a) primaarstruktuur nukleotiidide seondumine lineaarsesse ahelasse fosfodiester sidemete abil st P-happejäägid seonduvad üle pentooside; b) sekundaarstruktuur paardunud eriahelad või samad ahelad A=T G=C c) tertsiaalstruktuur juhul kui NH omandab kindla ruumilise kujundi. Toimub enamasti teiste molekulide kaasabil, peamiselt nukleoproteiinses vormis. 5.4. Ülesanded ja tähtsus · DNA ülesanne on päriliku info säilitamine ja edasi andmine võimalikult muutumatul kujul. · RNA ülesanded: mRNA info viimine tuumast valgu sünteesikohta ribosoomidele;
3. tsüklilised nukleotiidid vahendavad biosignaalne. Osad reageerivad oma vahel. cAMP, see väike c näitab, et tegu on tsüklilisega. Virgatsühend 4. osa nukleotiide kuuluvad liitensüümide koostisse, võimaldab teostada ensüüme aktiivsemalt. 5. kunstlikult disainitud nukleotiide kasutatakse kasvajate ravimitena. Nukleiinhapped On kõrgmolekulaarsed biopolümeerid, milles kuleotiidi jäägid on omavahel seotud fosfodiester sidemetega. Jaotus: · DNA · RNA Koostis: DNA pentoos RNA Desoksüriboos 1 hapniku riboos aatom vähem kui riboosis Lämmastikalused 2 tsüklilised(puriinalused) Adeniin:A Adeniin:A
DNA ja RNA on nukleotiidide polümeerid. DNA sisaldab valkude sünteesiks vajalikku informatsiooni, mis on geenides. RNA on vajalik valkude tootmiseks. DNA: lämmastikalused - A adeniin, G guaniin, C tsütosiin, T tümiin, suhkrujääk desoksüriboos, fosforhappejääk RNA: lämmastikalused - A adeniin, G guaniin, C tsütosiin, U uratsiil, suhkrujääk riboos, fosforhappejääk Sidemed: lämmastikaluse ja suhkru vahel on glükosiidne side, nukleotiidide vahel on fosfodiester sidemed, vesinikside on H ja O vahel – mis kaob esimesena kuumutamisel. DNA paardumine vesiniksidemete abil: A ja T → kaksikside; G ja C → kolmikside. Nukleiinhapete ehituskomponendid (monomeerid) ● puriin- ja pürimidiinalused. Inimorganismi nukleotiidides esinevad puriini ja pürimidiini põhiderivaadid on adeniin, guaniin, tsütosiin, uratsiil ja tümiin. ● Nukleosiidid = alus + suhkur. Need on puriin- või pürimidiinaluse ja pentoosi kompleksid.
Aktiivne DNA on DNaasidele kättesaadav, inaktiivne mitte. Aktiivse ja inaktiivse DNaasitud segud Southern blottitakse, ning inaktiivses on näha globiini kohal "auk". 29. Loetle DNA erineva struktureerituse astmed, mis lõpevad kromosoomi tekkega. DNA-ahel: Nukleosiid trifosfaatides on fosfaadid seotud C5'-ga. Suhkru aatomite järgi nimetatakse 5' ja 3' otsteks. Nukleiinhapped sünteesitakse 5' otsast alates 3' suunas nii, et järgmise nukleotiidi vahele tekib fosfodiester side. Polükondensatsioonireaktsioon. DNA sekundaarstruktuur: Antiparalleelne kaksikheeliks, Komplemetaarne paardumine; erinevad vormid: B vorm (tavaline, 1 pööre 10 aluspaari, olulisim omadus on võime painduda pikki telge kui DNA komplekseerub valkudega (kromatiin)), A vorm (kompaktsem, esineb DNA-RNA interaktsioonide korral, 11 aluspaari), Z vorm (vasakukäeline heeliks, annavad lühikesed ahelad ja alternatiivsed nukleotiidid), Kolmikahelaline struktuur
See paar geene on ekspresseeritud lümfotsüütidel, kuna nad on ühinenud antigeeni retseptoritega. RAG proteiinid ei ole ainsad ensüümid. Veel on tähtsad DNA ligase IV, DNA-PKA, KU, endonukleaasid jne. RAG-1 j RAG-2 ühilduvad spetsiifiliselt RSS-dega. RAG-1 tunneb ära spetsiifilise nanomeeri RSS-s. Endonukleaas aktiveerib RAG proteiini kompleksi, mis teeb kaks eraldi seisvat DNA katki 5` juurest, jättes vabaks 3´- OH grupi. See 3`-OH grupp ründab fosfodiester-sidemeid teises seisukohas (stand), tekib DNA ”juuksenõel.” Kaks RSS on ühinenud signaalühenduseks. Kuna see ühendus ei ole puhas, siis tuleb see puhtaks teha, kas RAG proteiinidega või Artemisega (so. mingi valk). DNA parandusensüümid (repair) modifitseerivad avatud juuksenõela, eemaldades nukleotiidide (mingi sõna on siit puudu) ja juhuslikke nukleotiide, kasutades ensüümi TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase). Lõpuks DNA ligaas IV
annaabi.ee 
