Valgukiibid Veera Tychkova VI rühm Valgukiipid: mis need on? ● Suure tootlikusega meetod ● Kasutatakse valkude vastastikmõju ja aktiivsuse jälgimiseks ning nende funktsiooni uurimiseks suures ulatuses ● Suur valkude arv saab olla jälgitud paralleelselt ● Kiip koosneb: tugipinnast (nagu alusklaas), nitrotselluloos membraanist, helmest või mikrotiiterplaadist, mille küljes on seotud valkude järjestus. ● Proovi molekulid on märgistatud fluorestseeruva värviga ning lisatud reastusele ● Iga reakstsioon proovi ja fikseeritud valgu vahel kiirgab fluorestsents värvi, mida loeb laser skanner ● Valgukiibid on kiired, automatiseeritud, ökonoomsed, ülitundlikud Reastuse loomine ● Valgud on reastatud kõvale aluspinnale nagu mikroskoobi alusklaasid, membraanid, helmed ● Selline pind pakub tuge valkudele, mis hakkavad sinna kinnituma. ● Valgud on natiivses konformatsioonis.
Ergastav valgus juhitakse läbi filtri uuritava objektini. Filter laseb läbi ainult kindla lainepikkusega valgust, mis on sobiv fluorokroomi ergastamiseks. Emiteeritud valgus sorteeritakse palju tugevamast ergastavast valgusest teise filtri abil. 4. Nimeta erinevaid võimalusi rakukomponentide märgistamiseks fluorokroomidega? Fluorestseeruvad värvid: Difundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. Näiteks DNA värvid propiidiumjodiid, Hoest, DAPI jt. Immuunofluorestsents: Kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy, jne.) konjugeeritud antikehasid. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, esmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis seostuvad primaarse antikeha konstantsete regioonidega. Fluorestseeruvad valgud: Selleks ekspresseeritakse rakkudes uuritava valgu ja fluorestseeruva valgu liitvalku. Samas kannatab ka PFA-ga fikseerimist ja saab vaadata ka fikseeritud rakkudes. 5
Desoksüribonukleotiid – DNA kui polümeeri monomeer, koosneb lämmastikalusest (A, T, C või G), monosahhariidist (desoksüriboos) ja fosforhappejäägist. Didesoksüribonukleotiid – eelmisest ühe hapnikuaatomi võrra vaesem ühend. Komplementaarsus – lämmastikaluste kindel üksteisele vastavus. • Uuritav DNA • Desoksüribonukleotiidid • Didesoksüribonukleotiidid (ddA,ddT,ddC,ddG) nt fluorestseeruva värviga märgitud • DNA polümeraas jt ensüümid, nt helikaasid jm, mis tekitavad DNA üksikahelad 13. PCR (polümeraasne ahelreaktsioon) - kuidas toimub, mida tarvis? Praimer. Tuubis segatakse kokku: nukleotiidid (kõiki nelja erinevat), DNA-polümeraas, oma DNA lahus, praimerid - lühikesed DNA lõigud, mis on komplementaarsed analüüsitava DNA-piirkonna mõlema “otsaga”. Tuub pannakse 3 tunniks PCR-masinasse
Kui sellel eesmärgil kasutatakse: a) Allogeenseid rakke, siis on tegemist samalt indiviidilt pärit rakkudega; b) Ksenogeenseid rakke, siis on tegemist teiselt liigilt pärit rakkudega. 15. Kuidas luua selliseid transgeenseid taimi, et meie poolt sisestatud tunnus ei kanduks taimede paljunemisel õietolmuga edasi? a) Sisestada meid huvitav transgeen plastiidide genoomi b) Kasutada geeni sisenemise kontrolliks rohelise fluorestseeruva valgu (Green Fluorescent Protein- GFP) geeni c) Sisestada meid huvitav transgeen taime genoomi lillkapsa mosaiigi viiruse (Cauliflower Mosaic Virus) CaMV 35S promootori kontrolli all d) Viia vektori koosseisus taime genoomi teatud antibiootikumi (näit. hügromütsiini) resistentsusgeen 16. Bioremediatsiooni mikroobide või taimede abil on võimalik teha? a) In vivo b) In vitro c) In situ d) Ex situ 17
Sinise valgusega ergastades saame rohelise fluorestsentsi ja rohelise valgusega ergastades saame punase fluorestsensi. Iga fluorokroomi iseloomustavad neeldumis- ja emissioonispektrid. Enamus molekule rakus ei fluorestseeru ja seetõttu kasutatakse fluorestseeruvaid märgiseid. • Fluorestseeruvad värvid – diffundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. N. DNA värvid propiidiumjodiid, Hoechst, DAPI jt • Immuunofluorestsents – kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy jt) konjugeeritud antikehasid. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, esmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis seostuvad primaarse antikeha konstantsete regioonidega. See võimaldab signaali amplifitseerimist, sest ühe primaarse antikehaga saab seostuda mitu sekundaarset antikeha. Samuti kaob siis ära vajadus iga primaarse antikeha fluorokroomiga konjugeerimiseks.
Kui molekul absorbeerib elektromagneetilist kiirgust ja tõuseb stabiilselt energiatasandilt kõrgemale ebastabiilsele tasandile, siis ta annab losaenergia ära soojendusenergiana kokkupõrgetel teise molekulidega. Fluoromeetrias mõõdetakse uuritava aine fluorestsentsi intensiivsust: Kus F- fluorestsentsi üldine intensiivsus (kvanti/sec) Jo erfastava valhuse intensiivsus (kvanti/sec) C lahuse konts (mooli/l) (E) molaarne neeldumiskoeff b- fluorestseeruva kihi paksus (cm) fluorestsentsi kvant-saagis (sõltub aine om-st) Valem kehtib lahuse suhtes, mille opt.tihedus D ei ületa 0,05, millele vastab opt.läbitavus 89%, sest suure opt.tiheduse juures kiirgus ei levi lahuses ühtlaselt. Lahuse konts peab olema 10-5-10-6, siis flurestsentsuse ja konts vahel kehtib lineaarne sõltuvus. Suuremate konts puhul sõltuvus kaob ja ilmneb fluor.nõrgenemine.
olemasolu kinnitamiseks. Märgistatud proov hübridiseeritakse denatureeritud kromosomaalse DNAga in situ. Vaadatakse fluorestsentsmikroskoobiga. CGH – comparative genomic hybridisation – kasutatakse uuritavas DNA proovis teatud geenide või DNA lõikude koopiaarvu muutuste või deletsiooni leidmiseks. Hübridiseeritakse 2 eri päritoluga suguluses olevat DNA proovi (1 kasvaja-DNA nt) võrdses koguses, mis on märgistatud erinevate fluorestsentsmärkidega. Hinnatakse fluorestseeruva värvi suhet teise värviga. Anomaaliad: aneupoidsuse korral esineb kõrvalekaldeid üksikute kromosoomide kordsuses – trisoomia +21 Downi sündroom, +13 Patau, +18 Edwards. Monosoomia – üks X turneri sündroom. 51. Geenid, sugupuud ja populatsioonid: monogeene ja multigeene pärilikkus, Mendeli järgi viis põhilist sugupuu struktuuri, Hardy-Weinbergi valem ja selle kasutamine. Monogenne pärlikkus – ühe tunnuse määrab üks geen. Mendeli tüüpi tunnused
Markeri tüüp di-, tri-, tetranukleotiid, Bialleelsed markerid kordusmarkerid Alleelide arv markeri kohta Tüüpiliselt >5 Tüüpiliselt 2 Detekteerimismeetod geel/kapillaarelektroforees Sekveneerimine, mikrokiip Multipleksi võimalus >10 markerit mitme Potentsiaalselt 1000 SNPd fluorestseeruva värviga kiibil 3. STR markerite iseloomustus (korduste tüübid, alleelide tähistamine, alleelide eristamine). · Dinukleotiid · Trinukleotiid · Tetranukleotiid · Pentanukleotiid · Heksanukleotiid Alleele eristatakse pikkuse alusel ehk mõõdetakse DNA juppide pikkusi. Mida suurem on 2 alleeli pikkuse erinevus, seda väiksem võib lahutustundlikkus olla. Näiteks 1 nukleotiidilise
Sinise valgusega ergastades saame rohelise fluorestsentsi ja rohelise valgusega ergastades saame punase fluorestsensi. Iga fluorokroomi iseloomustavad neeldumis- ja emissioonispektrid. 142. Enamus molekule rakus ei fluorestseeru ja seetõttu kasutatakse fluorestseeruvaid märgiseid. Fluorestseeruvad värvid – diffundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. N. DNA värvid propiidiumjodiid, Hoechst, DAPI jt Immuunofluorestsents – kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy jt) konjugeeritud antikehasid. 143. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, asmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis seostuvad primaarse antikeha konstantsete regioonidega. See võimaldab signaali amplifitseerimist. 144. 145. Esimene päev – rakkude fikseerimine 1. Valmistada vajalikud lahused:
permeabiliseerimise (kestad läbilaskvaks), proovi hübridiseerimise ja analüüsiga fluorestsents mikroskoobis (või FACS) 24. Patogeenide testimine 16S rDNA abil Kasutatakse universaalseid märklaudu: Ribosomaalse rRNA geenid 16S rDNA või 23S rDNA DNA mikrokiip kujutab endast väikest 2-mõõtmelist DNA fragmentide kõrgtihedat maatriksit, mis on kindlas järjekorras sünteesitud või trükitud klaas või silikoon kiibile. DNA fragmentide hübridiseerumine fluorestseeruva prooviga detekteeritakse spetsiaalse aparatuuriga. Kliinilises praktikas ei ole DNA kiibid bakterite/viiruste diagnostikas erilist kasutust leidnud (liiga keeruline, ebakindel). Affymetrix, Qiagen , Nanochip (16S rDNA) pakuvad erinevaid mikrokiipidel põhinevaid lahendusi mikroobide testimiseks 25. Mendeli seadused Mendeli I seadus ehk ühetaolisuse seadus- Homosügootsete vanemate ristamisel saadakse
säilitatakse ja neist moodustavad sünteetilised pangad (uued juhtühendid teistele biokatsetele). Dekonvolutsioon - aktiivsete ühendite tuvastamine ja eraldamine bioaktiivsete ainete segust. Mikromanipulatsioon eri tüüpi ja kujuga tahked kandjad, igal neist on ühte tüüpi produkt. Kandjad saab füüsiliselt eraldada, produktid lahutada kandjalt ja testida. Tihti kasutatakse kolorimeetrilisi reaktsioone, aktiivsed komponendid eristuvad (nt sidumine fluorestseeruva markeriga ensüümi või retseptoriga) kolorimeetriliselt, eraldatakse ning produkt ka. Positsiooni skäneerimine e iteratiivne optimeerimine. Eelduseks on optimeeritava juhtühendi olemasolu, kusjuures juhtühend jagatakse alaühikutest, varieeritakse üht alaühikut ning leitakse selle optimum. Esimese alaühiku fikseerimise järel optimiseeritakse teist alaühikut. Eeldusteks on:
Fluorestsentsmikros-koobis on valgusallikaks elavhõbedalamp, mis annab lühilainelist kiirgust (paljudel lainepikkustel). Immuunfluorestsents: Elavhõbedalambiga valgustatakse helendavate värvainetega märgistatud antikehasid. Epitope tagging – märgitud liitvalkude (fusion proteins) tehnoloogia. Liidesega valk ehk liitvalk (näiteks lisatakse uuritvale valgule – täpsemalt seda kodeerivale dna-le fluorestseeruva valku nagu green fluorscent protein - gfp kodeeriv dna või peptiide järjestuse (kuni 8-12 aminohapet, nt flag, muc, v5, e2 (tartus välja töötatud!) Dna, nende tag’ide äratundmiseks on olemas kommertsiaalselt saadaval antikehad. Niisugust ‘’tägitud’’ valku kodeeriv cdna viiakse tootmiseksbakteri- või eukarüootsetesse rakkudesse. Epitoop –immunoloogias see osa (uuritavast) valgust, mida (spetsiaalselt
Tavaliselt on Hg aurude osarõhk mitte suurem kui 1%, kuigi gaasilahenduse kiirgus pärineb peaaegu täielikult elavhõbeda aatomitest. Enamus gaaslahendusel tekkivast kiirgusest on ultraviolettkiirgus lainepikkusel 253.7 nm, mis vastab kvantide kiirgusele elektronorbitaalilt 6p 6s-ile üleminekul. Lisaks kiirgab ergastatud Hg aatom ka nähtavas kiirguses (404.7, 435.8, 546.1 ja 578.0 nm), mistõttu Hg lambi spekter on sinakasvioletne. Päevavalguslambi sisekülg on kaetud spetsiaalse fluorestseeruva värviga luminofooriga, mis muudab lambi ultraviolettkiirguse valguseks. Luminofoor neelab suurema energiaga lühilainelisi kvante ja kiirgab tagasi madalama energiaga pikalainelisemaid kvante. Kiiratava valguse spektraalne koostis sõltub lambi siseküljele kantud luminofooride koostisest. Näiteks CaMgWO4(Pb) kihiga kaetud lambid (L-30) annavad sinakasvioletset valgust spektrimaksimumiga 442 nm, ZbBeSiO3(Mn) kihiga
rakkudest sisaldavad kromosomaalseid muutusi. Ei saa identifitseerida kromosomaalseid ebanormaalsusi mis on tasakaalus. Langenud tundlikkus tänu test rakkude kontaminatsioonile normaalsete rakkude poolt. • SNP-kiibid – kasutatakse populatsiooni siseste polümorfismide detekteerimiseks. Kiip sisaldab immobiliseeritud alleel-spetsiifilisi oligonukleotiidi sonde. Fragmenteeritud proov märgistatakse fluorestseeruva märgisega ning detekteeritakse hübridisatsiooni signaali alusel. Saab töödelda tuhandeid proove madala kuluga Saab detekteerida haruldasi ja levinud CNVsid madala valede tulemuste tasemega kasutades viit sondi regiooni kohta. Kiire Vähi genoomi mosaiikne struktuur muudab CNVde tuvastamise keerulisemaks Sondide jaotus ei ole homogeenne – spetsiifiline regioon jääb sidumata,
mikrotorukeste tõmbamises) 29. Milliste mootorvalkude ja milliste tsütoskeleti valkude interaktsioon toimub loomaraku tsütokineesis? Müosiin ja aktiin – kontraktiilne rõngas. Tsütohalasiin B on mikrofilamentide moodustumist takistav ühend. See ühend seetõttu takistab tsütokineesi. Meetodid rakubioloogias Milliseid geenitehnoloogilisi meetodeid kasutatakse valgu lokalisatsiooni muutuse jälgimiseks elusas rakus? Valk märgistatakse fluorestseeruva aminohappe järjestusega, mida valk endaga kaasas veab ja mida on fluorestsentsmikroskoobis näha. Kuidas toimite, kui tahate näha ühe spetsiifilise valgu lokalisatsiooni rakus? Monoklonaalsete antikehade kasutamine. Mille poolest erineb uuritavast objektist tavalise fluorestsentsmikroskoobi abil saadav kujutis konfokaalse fluorestsentsmikroskoobi abil saadavast kujutisest? Võimaldab kõrgkvaliteedilist kujutist ka suhteliselt paksust koematerjalist, ei ole vaja teha üliõhukesi lõike
- UV-C 100280 nm - UV-B 280320 (280315) nm - UV-A 320400 (315400) nm Nahahaiguste mõjustamisel kasutatakse UVB ja UVA spektrit. Valgusravi tehakse kliinikutes või spetsiaalsetes päevakeskustes. Võimalik on osta spetsiaalseid aparaate ka kodus kasutamiseks, kuid see eeldab eelnevat spetsialisti konsultatsiooni ja teadlikku patsienti, kes on võimeline ravi adekvaatselt ise jälgima. Raviprotseduuri ajal seisab patsient lahti riietatult spetsiaalses kabiinis, mis sisaldab fluorestseeruva valgusega torusid. Silmad peavad olema kaitstud prillidega. Meestel on kaetud genitaalid. Ravi teostatakse tavaliselt 3x/näd, Igal korral, sõltuvalt nahareaktsioonist, doosi veidi tõstetakse. Protseduuride ja ravi pikkus on igale patsiendile individuaalne, lähtudes tema nahatüübist, haiguse eripärast ja haiguse alluvusest ravile. UVB ravi UVB ravi on lubatud igas vanuses inimestele ning ka raseduse ja rinnaga toitmise ajal.
29. Milliste mootorvalkude ja milliste tsütoskeleti valkude interaktsioon toimub loomaraku tsütokineesis? Müosiin ja aktiin kontraktiilne rõngas. Tsütohalasiin B on mikrofilamentide moodustumist takistav ühend. See ühend seetõttu takistab tsütokineesi. Meetodid rakubioloogias Milliseid geenitehnoloogilisi meetodeid kasutatakse valgu lokalisatsiooni muutuse jälgimiseks elusas rakus? Valk märgistatakse fluorestseeruva aminohappe järjestusega, mida valk endaga kaasas veab ja mida on fluorestsentsmikroskoobis näha. Kuidas toimite, kui tahate näha ühe spetsiifilise valgu lokalisatsiooni rakus? Monoklonaalsete antikehade kasutamine. Mille poolest erineb uuritavast objektist tavalise fluorestsentsmikroskoobi abil saadav kujutis konfokaalse fluorestsentsmikroskoobi abil saadavast kujutisest? Võimaldab kõrgkvaliteedilist kujutist ka suhteliselt paksust koematerjalist, ei ole vaja teha üliõhukesi lõike
kromosoomide arv. Kromosoomide nähtavale toomiseks kasutatakse erinevaid värve. Kuni 70-ndate aastate alguseni oli kasutusel Feulgen'i reagent, mis on purpurse värvusega ning reageerib DNA-s olevate suhkrujääkidega. Kuigi rutiinseks analüüsiks on see reagent veel praegugi kasutusel, kasutatakse detailsemateks uuringuteks DNA-ga interkaleeruvaid värve. Näiteks quinacrine'ga värvides tulevad kromosoomides esile vöödid. Kuna tegemist on fluorestseeruva värviga, vaadeldakse preparaate UV-kiirguses. Igale kromosoomile on iseloomulik kindel vöödilisuse muster. UV-kiirguses helendavaid vööte on hakatud nimetama Q-vöötideks. Kasutatakse ka mittefluorestseeruvaid värve, näiteks Giemsa värvi. Sel juhul ilmuvad sõltuvalt sellest, kuidas kromosoomipreparaati eelnevalt on töödeldud, kas G- või R-vöödid. R- vöötide puhul värvuvad alad, mis G-vöötide puhul olid heledad ja vastupidi. Inimese karüotüüp
väikesele magnetile katseklaasi küljel. Veel saab läbivoolu tsütomeetriaga mõõta raku DNA ja RNA sisu ja määratleda selle üldist kuju ja suurust. FACS-iga saab samaaegselt teha raku suuruse (hajuv valgus) ja DNA koguse (fluorestsentsi eraldamine DNA- siduva värvi korral) mõõtmisi. Analüüsi käik kontsentreeritud märgistatud rakkude lahus segatakse puhvriga nii, et rakud läbiksid laserkiirt ükshaaval. Mõõdetakse nii fluorestseeruva valguse eraldamist kui valguse hajutamist (suurus ja kuju). Lahus viiakse läbi tila, kus moodustavad pisikesed tilgad, kus on enamasti ainult 1 rakk. Moodustumise ajal antakse igale tilgale negatiivne elektriline laeng, mis on võrdeline selle eraldatud fluorestsentsiga. Ilma laenguta tilgad ja erinevate laengutega tilgad eraldatakse elektrivälja abil ja kogutakse. (ühe tilga sorteerimine toimub millisekunditega)
arv. Kromosoomide nähtavale toomiseks kasutatakse erinevaid värve. Kuni 70-ndate aastate alguseni oli kasutusel Feulgen'i reagent, mis on purpurse värvusega ning reageerib DNA-s olevate suhkrujääkidega. Kuigi rutiinseks analüüsiks on see reagent veel praegugi kasutusel, kasutatakse detailsemateks uuringuteks DNA-ga interkaleeruvaid värve. Näiteks quinakriiniga värvides tulevad kromosoomides esile vöödid. Kuna tegemist on fluorestseeruva värviga, vaadeldakse preparaate UV-kiirguses. Igale kromosoomile on iseloomulik kindel vöödilisuse muster. UV-kiirguses helendavaid vööte on hakatud nimetama Q-vöötideks. Kasutatakse ka mittefluorestseeruvaid värve, näiteks Giemsa värvi. Sel juhul ilmuvad sõltuvalt sellest, kuidas kromosoomipreparaati eelnevalt on töödeldud, kas G- või R-vöödid. R-vöötide puhul värvuvad alad, mis G-vöötide puhul olid heledad ja vastupidi. Inimese karüotüüp
arv. Kromosoomide nähtavale toomiseks kasutatakse erinevaid värve. Kuni 70-ndate aastate alguseni oli kasutusel Feulgen'i reagent, mis on purpurse värvusega ning reageerib DNA-s olevate suhkrujääkidega. Kuigi rutiinseks analüüsiks on see reagent veel praegugi kasutusel, kasutatakse detailsemateks uuringuteks DNA-ga interkaleeruvaid värve. Näiteks quinakriiniga värvides tulevad kromosoomides esile vöödid. Kuna tegemist on fluorestseeruva värviga, vaadeldakse preparaate UV-kiirguses. Igale kromosoomile on iseloomulik kindel vöödilisuse muster. UV-kiirguses helendavaid vööte on hakatud nimetama Q-vöötideks. Kasutatakse ka mittefluorestseeruvaid värve, näiteks Giemsa värvi. Sel juhul ilmuvad sõltuvalt sellest, kuidas kromosoomipreparaati eelnevalt on töödeldud, kas G- või R-vöödid. R-vöötide puhul värvuvad alad, mis G-vöötide puhul olid heledad ja vastupidi. Inimese karüotüüp
annaabi.ee 
