Väike tuuma RNA( snRNA) - oluline eukarüootsete geenide esmaste transkriptide protsessingul küpseks mRNA ks enne eksporti tuumast tsütoplasmasse Väike interfereeriv RNA( siRNA) osaleb transkrriptsioonijärgses geenide vaigistamises RNA on disainitud kasutamiseks ja siis hävitamiseks Nukleaasid: Ensüümid, mis degradeerivad nukleiinhapet, lõhkudes fosfodiestersidemeid. Eksonukleaasid lagundavad nukleiinhappe ahelat kas 5' või 3' otsast (5'eksonukleaasid ja 3'eksonukleaasid). Endonukleaasid lagundavad nukleiinhapet, lõhkudes fosfodiestersidemeid ahelasiseselt Nukleiinhapete struktuurid: - Primaarstruktuur: Lämastikaluste järjestus polünukleotiidahelas - Sekundaarstruktuur : Polünukleotiidahela ruumilie struktuur - Tertsiaalstruktuur: Polünukleotiidahela ,,pakend" rakus v rakutuumas DNA molekuli võimalikud sekundaarstruktuurid: - Lineaarne kaksikspiraalne (biheeliks) - Tsükliline kaksikspiraalne
sissetungi korral jm Mõned nukleaasid on DNA või RNA spetsiifilised, mõned järjestusspetsiifilised, mõned mittespetsiifilised DNaas desoksüribonukleaas, hüdrolüüsib DNA molekule RNaas ribonukleaas, hüdrolüüsib RNA molekule Nukleaasid Vastavalt hüdrolüüsitava sideme asukohale jaotatakse nukleaasid: Eksonukleaasid katalüüsivad terminaalse nukleotiidi eemaldamist 3´ eksonukleaasid 5´ eksonukleaasid Endonukleaasid katalüüsivad ahelasisese fosfodiestersideme hüdrolüüsi produktiks 3´ fosfaadiga nukleotiid produktiks 5´fosfaadiga nukleotiid Nukleaasid Ensüüm substraat klass spetsiifika Pankrease RNA endo(I) 3´ Pyr ribonukleaas A Põrna DNA, RNA ekso(II) 5´ots, aluse
kaudu). 4-5 tundi peale infektsiooni algust leidub nakatatud rakus juba arvukalt valmis virione. Virionide pungumist rakumembraanist ei esine. Rakkude lüüs algab 4 tundi ja lõpeb 8-10 tundi peale infektsiooni algust. Seda teevad viiruse kodeeritud ensüümid (vähemalt 5 erinevat; osa neist pakitakse ka virioni ja võivad olla olulised uue raku nakatamisel) Rakkude lüüsimise tulemusena vabaneb iga nakatatud raku kohta 200-350 uut PFU-d. Endonukleaasid ja DNA metüültransferaasid Chlorella viiruse DNA sisaldab 5mC ja 6mA jääke positsioonides, mis erinevad peremehe DNA metüleerimissaitidest. See metüleerimine toimub viiruse poolt kodeeritud 5mC ja 6mA- metüültransferaaside poolt. Lisaks modifikatsiooni-ensüümidele (mõnel viirusel kuni 18 erinevat) kodeerib PBCV-1 veel ka DNA-sait-spetsiifilisi endonukleaase (restriktaase). Seega on vetikate viirused esimeseks mitte-prokarüootseks restriktaase kodeerivaks süsteemiks.
Faagid on aga „elusad“ organismid, mis on võimelised evolutsioneeruma. Kui mõnes bakteris tekib resistentsus mõne kindla faagi suhtes, siis võivad toimuda selles faagis mutatsioonid, mis võimaldavad ületada tekkinud resistentsuse barjääre. Näiteks kui tekivad mutatsioonid bakterite endonukleaasides, mille tõttu lagundatakse bakterisse sattunud faagi DNA, siis võivad faagis vastukaaluks tekkida mutatsioonid DNA-s, mille tõttu ei ole enam bakterite endonukleaasid võimelised degradeerima faagi DNA-d (Carlton, 1999). Uute faagisüsteemide arendamine on palju odavam kui uute antibiootikumide välja töötamine ning erinevalt antibiootikumidest, ei mõjuta faagid ning nende produktid eukarüootseid rakke. Seega kõrvalmõjusid esineb faagiteraapias vähem kui antibiootikumidega ravimisel (Matsuzaki, 2005). Bakteriofaagide genoomide modifitseerimine Bakteriofaagide antimikroobsete omaduste võimendamiseks on välja töötatud erinevaid tehnikaid
W. Arber leidis, et T4 paljunemine on osades E. coli tüvedes restrikteeritud (piiratud) E. coli tüve B rakkudes paljundatud faagi edasine paljunemine on takistatud tüve K rakkudes ja vastupidi Restriktsiooni-modifikatsiooni süsteem bakterites Restriktaasid – endonukleaasid, mis fragmenteerivad DNA-d spetsiifilistest kohtadest Metülaasid – modifitseerivad nukleotiide restriktaaside poolt äratuntavatest 4 – 6 bp pikkustest DNA järjestustest, kaitstes DNA-d restriktaasi eest Rakus lagundatakse võõrast DNA-d, mis ei ole antud bakteritüve restriktaasi eest kaitstud E. coli tüves RI on kirjeldatud restriktaas EcoRI ja sellele vastav
NB! RNA molekulid on loodud peale kasutamist hävitamiseks. DNA-l puudub 2'- OH, mistõttu ta on stabiilsem. NB! Geneetiline materjal peab olema stabiilne! · RNA - on vastupidav lahjades hapetes - hüdrolüüsub lahjas leelises · DNA - on vastupidav leeliste suhtes - lahjades hapetes depurineerub, st puriinnukleotiidides ,N-glükosiidside hüdrolüüsub Eksonukleaasid hüdrolüüsivad otsmisi (terminaalseid) fosfodiestersidemeid; Endonukleaasid hüdrolüüsivad ahelasiseseid fosfodiestersidemeid. Restriktaasid Spetsiifilised endonukleaasid, esinevad bakterites vajalikud neile kaitseks võõra DNA sissetungi vastu II ja III tüüpi restriktaasid lõikavad DNA mõlema ahela teatavaid fosfodiestersidemeid Võivad potentsiaalse lõikamispunkti (saidi) juures ära tunda 4...6 ("six- cutter") või rohkem aluseid Leiavad laialdast kasutamist geenitehnoloogias DNA SEKUNDAARSTRUKTUUR
Leukoplast on värvusetu ja selle ülesandeks on varuaine tärklise talletamine. b)tsentraalvakuoolid – peamine ülesanne on vee säilitamine, samuti kindlustab see raku siserõhu ehk turgori, seal toimuvad lõhustumisprotsessid, noore raku vakuoolides on toitained. c)Lisaks rakumembraanile ümbritseb taimerakku ka rakukest. See koosneb taimede puhul tselluloosist (seentel kitiinist). See annab rakule kuju ja kaitseb välismõjutuste eest. 40. Restriktaasid on endonukleaasid, mis kaitsevad rakke võõra DNA eest. Nad tunnevad ära lühikesi spetsiifilisi DNA-järjestusi ja lõikavad molekuli katki. On olulised geenide kloonimise seisukohalt. Nende avastamise eest said Hamilton Smith ja Daniel Nathans 1978 Nobeli preemia. 41. DNA kloonimise etapid Uuritava geeni isoleerimine Viimine isereplitseeruvasse geneetilisse elementi Amplifikatsoon ehk molekulide paljundamine Uuritava geeniga rekombinantsete kloonide selektsioon. 42
Kloneerimine Vektor - DNA molekul mida kasutatakse geneetlise materjali kandjana (viib DNA teise rakku) Neli tüüpi: Plasmiid Bakteri või viiruse faag Kosmiidid Kunstlikud kromosoomid BAC, YAC) Sisaldab: OriC (Origin of replication) multikloneerimise koht (multiple cloning site) Marker geen Restriktsiooni ensüümid - Nö. ,,DNA käärid". Tunnevad ära teatud DNA järjestuse ja katkestavad ahela ( Eco Ri). Bakterid produtseerivad ensüüme nimega restriktsioonilised endonukleaasid. Need ensüümid lõikavad DNA ahelat kindlate 4 - 8 aluspaari pikkuste järjestuste juurest. Funktsioon: kaitsta baktereid faagide sissetungi eest, lagundades nende DNA enne, kui faag jõuab mikroobi kahjustada. Omaenese restriktaaside suhtes on bakterid resistentsed, sest bakteri enda genoomis on need järjestused kaitstud adeniini ja tsütosiini jääkide metüleerimisega. (loeng 6 meetodid) Geeni ekspressiooni disain - Promootori ja terminaatori valik Marker geen ja reporter geen
riboos 14. Nukleaasid on ensüümid, mis hüdrolüüsivad nukleiinhappe fosfodiestersidemeid. Milles seisneb ekso- ja endonukleaaside toimespetsiifika erinevus? Eksonukleaasid hüdrolüüsivad otsmisi ehk terminaalseid fosfodiestersidemeid. Endonukleaasid hüdrolüüsivad nukleiinhapete ahelasiseseid ehk mitte-terminaalseid fosfodiestersidemeid. 15. Iseloomustage järgmiste ensüümide toimet (kirjeldage katalüüsitavaid reaktsioone). Vajadusel illustreeriga vastust joonise või skeemi abil. a) Endonukleaas Rnaas A endonukleaasid hüdrolüüsivad nukleiinhapete sisemisi fosfodiestersidemeid. Powerpoindist võetud tabel: Ahelate lõikamise loogika üldiselt:
koopiaid. (4) DNA fragmendi nukleotiidide järjestuse määramine (sekveneerimine- ingl k. sequencing), mis vôimaldab määratleda geenide NH-lise koostise, nende täpse asukoha kromosoomis, aga ka geeni poolt kodeeritavate valkude aminohappelise koostise. (5) Insenergeneetika- geenide DNA järjestuse muutmine ja muudetud geenide vôi uute geenide viimine rakkudesse ja organismi. Organismide geneetiline modifitseerimine. 3. Mis on restriktaasid? Restriktaasid (sait-spetsiifilised endonukleaasid) on ensüümid, mis lõikavad DNA-d spetsiifilise nukleotiidse järjestuse järgi. 4. DNA kloonimine, millised on isepaljunevad süsteemid DNA kloonimiseks. DNA kloonimise all môistame teatud DNA lôigu paljundamist. Selleks kasutatakse isepaljunevaid süsteeme vôi polümeraas-ahelreaktsioooni. Isepaljunevate süsteemidena (nimetatakse ka vektoriteks) kasutatakse tavaliselt baketerite plasmiide vôi viiruseid- bakteriofaage. Vajalik DNA-lôik ühendatakse vektoriga ja
92. DNA tandeemsed ja palindroomsed järjestused. Mõõdukalt kordistunud DNA piirkonnad (12,5 % genoomist) on sellised, kus igat lõiku on 104 - 105 koopiat. Siia kuulub geneetilist infot mittekodeerivaid alasid, mis asetsevad genoomis rühmiti (tandeemsed kordused) või ka hajusalt laiali (hajuskordused ehk polündroomsed kordused). Palindroomsed - geneetilised laused, kus teatud sümmeetriateljest paremale ja vasakule lugedes on järjestus sama. 93. Restriktaasid. Ekso- ja endonukleaasid. Nukleaasid - ensüümid, mis degradeerivad nukleiinhapet, lõhkudes fosfodiestersidemeid. Restriktaasid - rõngasmolekulist lineaarse vormi tagasi moodustumine alusspetsiifilise endonukleaasi toimel. Eksonukleaasid- eemaldavad nukleotiide DNA ahela otsast (lagundavad nukleiinhappe ahelat kas 5' või 3' otsast (5'eksonukleaasid ja 3'eksonukleaasid) Endonukleaasid- atakeerivad ja võtavad ära nukleotiide DNA ahela seest. 94. DNA polümeraas I omadused. Kornbergi polümeraas
siRNA (väike interfeeriv RNA) osaleb transkriptisoonijärgses geenide vaigistamises. 5. Nukleiinhapete hüdrolüüs. RNA onvastupidav lahjades hapetes, hüdrolüüsitakse lahja leelise poolt. DNA on vastupidav leeliste suhtes; lahjades hapetes depurineeritakse, st hüdrolüüsitakse puriinnukleosiidide N- glükosiidside. Polünukleotiidahelate lõikamine. Eksonukleaasid hüdrolüüsivad fosfodiestersidet terminaalsete jääkide juurest. Endonukleaasid hüdrolüüsivad nukleiinhapete sisemisi (mitte-terminaalseid) fosfodiestersidemeid. Restriktsiooniensüümid. Bakterid kaitsevad ennast võõra DNA sissetungi eest restriktsiooniensüümide e restriktaaside abil. II ja III tüüpi restriktaasid lõikavad DNA ahelaid kindlates kohtades. Ensüümid võivad ära tunda 4-6 või rohkem aluseid potensiaalse lõikamissaidi juures.
Noorel rakul on kest õhuke, raku vananedes see pakseneb. Raku kestades on poorid, milel kaudu toimub ainevahetus. Naaberrakkude tsütoplasmad ühenduvad tsütoplasmaväätide ehk plasmodesmide kaudu. Taimerakus on vakuoolid, plastiidid(proplastid, kloroplastid, kromoplastid, leukoplastid), ribosoomid, karedapinnaline ja siledapinnaline tsütoplasma võrgustik, tuum, mitokonder, Golgi kompleks, tsütoplasma, lüsosoomid. 43. Restriktaasid. Ehk endonukleaasid lagundavad nukleiinhapet, lõhkudes suhkur-fosfaat selgroos nukleotiidide vahelist sidet ehk fosfodiestersidet ahelasiseselt, mitte otstest. Restriktaase toodavad bakterid. Restriktaasid on järjestusspetsiifilised. 44. DNA kloneerimise etapid. 1. Lõigatakse nii vektorit B-saidis(vektoriteks kasutatakse tihti plasmiide) kui ka uuritavat DNA- d retriktaasiga, mis genereerib "kleepuvad" otsad. (kui nii kloneerimisvektori DNA-d kui ka
DNA kaksikheeliksit denatureerivad tegurid on: kõrge temperatuur, keskkonna pH(<3 või >10), ioonjõud ja tugevad vesiniksidemete moodustajad. Nukleiinhapete hüdrolüüs RNA vastupidav lahjades hapetes, hüdrolüüsitakse lahja leelise poolt DNA vastupidav lahjades leelistes, lahjades hapetes depurineeritakse Polünukleotiidahelaid lõigatakse nukleaaside abil. Eksnukleaasid hüdrolüüsivad fosfodiestersidemeid terminaalsete jääkide juurest, endonukleaasid sisemiste fosfodiestersidemete juurest. Bakterid kasutavad enda kaitsmiseks võõra DNA eest restriktaase, lõikavad DNA ahelaid kindlate järjestuste kohalt. RNA · rRNA ribosoomne RNA, ribosoomi struktuuri ja funktsiooni alus, moodustavad umbes 2/3 ribosoomi ehitusest. Toimib toena ribosoomi valkudele. · tRNA transporti RNA, kannab aminohappeid valgusünteesis, ristikulehekujuline sekundaarstruktuur. tRNA's leidub palju ebaharilikke ribonukleosiide
(ühemunakaksikutel identne genotüüp). 2. kontrolltöö 3. 1. Mis on rekombinant-DNA? Restriktaaside abil loodud DNA molekul, mis looduses ei esine. 2. Millised on rekombinant-DNA tehnoloogia põhimeetodid? DNA lõikamine restriktaasidega DNA kloonimine DNA sekveneerimine – nukleotiidse järjestuse määramine Insenerigeneetika – DNA järjestuse muutmine ja GMO-de loomine – muudetud geneetilise materjali viimine organismidesse. 3. Mis on restriktaasid? Endonukleaasid, mis lõikavad DNA-d kindlatest kohtadest (äratundmisjärjestustest – ÄJ). ÄJ on 4-8 bp pikkune DNA järjestus. Kui restriktaasid lõikavad, siis võib tekkida kas EcoRI-ga kleepuvad otsad, millega on lihtsam DNA-d uude kohta ühendada (üleulatuvad) või tömbid otsad SmaI-ga. Igal restriktaasil on oma kindel äratundmisjärjestus. 4. DNA kloonimine, millised on isepaljunevad süsteemid DNA kloonimiseks. DNA kloonimine on teatud DNA lõigu paljundamine
promootorjärjestusega ; praimerit pole vaja Pöördtranskriptaas ehk revertaas sünteesib RNA ahelale komplementaarse DNA; vajab sünteesil praimerit · Muud ensüümid: DNA helikaas katalüüsib DNA ahelate üksteisest eraldumist Nukleaasid degradeerivad nukleiinhappeid, lõhkudes fosfodiestersidemeid Eksonukleaasid lagundavad nukleiinhappeid kas 5' või 3' otsast Endonukleaasid lõhuvad fosfodiestersidemeid ahelasiseselt DNA ligaas ensüüm, mis liidab DNA ahelate otsad, katalüüsides fosfodiestersideme moodustumist 5' fosfaadi ja 3' -OH rühma vahele 49. DNA replikatsiooni kolm mudelit konservatiivne, dispersiivne ja semikonservatiivne. Milline neist mudelitest leidis eksperimentaalselt kinnitust? · Konservatiivne mudel algselt kaksikheeliksilt sünteesitakse uus kaksikheeliks,
Võrreldes PNPaasiga on RNaas II puhul mRNA 3' otsas paiknevate juuksenõelastruktuuride mRNA-d stabiliseeriv toime efektiivsem. 14 Ühe eksonukleaasi suhtes mutantsed rakud kasvavad normaalselt, mõlema ensüümi defektsus on rakkudele aga letaalse toimega. RNaas II ja PNPaas-i topeltmutantide puhul toimub rakkudes 150 1500 nt pikkuste mRNA fragmentide akumuleerumine. Endonukleaasid Endonukleaaside poolt teostatavad atakid määravad sageli mRNA degradatsiooni edasise kiiruse, kuna aitavad kõrvaldada mRNA 3' otsast juuksenõelastruktuure. Sageli lõikavad nad 5' otsa lähedalt, mille tulemusena mRNA destabiliseerub ja allub edasisele kiirele lagundamisele. RNaas E RNaas E on rne geeni produkt. See ensüüm on üks põhilisi mRNA degradatsioonil osalevaid endoribonukleaase. Kuna RNaas E-defektsetes mutantides pikeneb mRNA-de eluiga, viitab see sellele, et
vesiniksidemed. Ei vaja initsiatsiooniks praimerit. 3. Pöördtranskriptaas e. revertaas ensüüm, mis sünteesib RNA ahelale komplementaarse DNA ahela. Vajab sünteesil paimerit. Nukleaasid Ensüümid, mis degradeerivad nukleiinhapet, lõhkudes fosfodiestersidemeid. 1. Eksonukleaasid lagundavad nukleiinhappe ahelat kas 5' või 3' otsast. 5'eksonukleaasid 3'eksonukleaasid 2. Endonukleaasid lagundavad nukleiinhapet, lõhkudes fosfodiestersidemeid ahelasiseselt Restriktsioonilised endonukleaasid e. restriktaasid DNA ligaas ensüüm, mis liidab DNA ahelate otsad, katalüüsides fosfodiestersideme moodustumist 5' fosfaadi ja 3'-OH rühma vahel. DNA replikatsiooni käigus lülitatakse kasvavasse DNA ahelasse inimesel 3000 nukleotiidi minutis, bakteril 30000 nukleotiidi minutis. DNA sünteesil eristatakse 3 etappi - initsiatsioon, elongatsioon ja terminatsioon.
vesiniksidemed. Ei vaja initsiatsiooniks praimerit. 3. Pöördtranskriptaas e. revertaas ensüüm, mis sünteesib RNA ahelale komplementaarse DNA ahela. Vajab sünteesil paimerit. Nukleaasid Ensüümid, mis degradeerivad nukleiinhapet, lõhkudes fosfodiestersidemeid. 1. Eksonukleaasid lagundavad nukleiinhappe ahelat kas 5' või 3' otsast. 5'eksonukleaasid 3'eksonukleaasid 2. Endonukleaasid lagundavad nukleiinhapet, lõhkudes fosfodiestersidemeid ahelasiseselt Restriktsioonilised endonukleaasid e. restriktaasid DNA ligaas ensüüm, mis liidab DNA ahelate otsad, katalüüsides fosfodiestersideme moodustumist 5' fosfaadi ja 3'-OH rühma vahel. DNA replikatsiooni käigus lülitatakse kasvavasse DNA ahelasse inimesel 3000 nukleotiidi minutis, bakteril 30000 nukleotiidi minutis. DNA sünteesil eristatakse 3 etappi - initsiatsioon, elongatsioon ja terminatsioon.
Ensüümide kompleksi, mis üheselt teostab somaatilist V(D)J rekombinatsiooni, nimetatakse V(D)J rekombinaasiks. RAG-1 ja RAG-2 on rekombinatsiooni aktivatsiooni geenid, mis sisaldavad lümfotsüüdi-spetsiifilisi rekombinaasi komponente. See paar geene on ekspresseeritud lümfotsüütidel, kuna nad on ühinenud antigeeni retseptoritega. RAG proteiinid ei ole ainsad ensüümid. Veel on tähtsad DNA ligase IV, DNA-PKA, KU, endonukleaasid jne. RAG-1 j RAG-2 ühilduvad spetsiifiliselt RSS-dega. RAG-1 tunneb ära spetsiifilise nanomeeri RSS-s. Endonukleaas aktiveerib RAG proteiini kompleksi, mis teeb kaks eraldi seisvat DNA katki 5` juurest, jättes vabaks 3´- OH grupi. See 3`-OH grupp ründab fosfodiester-sidemeid teises seisukohas (stand), tekib DNA ”juuksenõel.” Kaks RSS on ühinenud signaalühenduseks. Kuna see ühendus ei ole puhas, siis tuleb see
108 Neisseria gonorhoeae on alati looduslikult kompetentsed ning valmis DNA-d rakku võtma. Transformatsiooni etapid võib jagada kaheks: 1. DNA kinnitumine rakule ja sisenemine rakku 2. DNA inserteerumine bakteri genoomi 13.1. Transformatsiooni esimene etapp DNA kinnitumine rakule, sisenemine rakku DNA fragmenteerimine. G(+) liikidel frgamenteerivad endonukleaasid dsDNA enne kinnitumist rakkudele juppideks. B. subtilis'e korral lõigatakse DNA u 18 kbp pikkuseks, S. pneumonia'l u 6 kbp pikkuseks. B. subtilis'el on raku pinnal u 50 DNA kinnitumise kohta, S. pneumonia'l 33-75. DNA kinnitumine. Kuigi rakuga seondub ainult dsDNA, siis rakku transporditakse ssDNA. B. subtilis'el kestab seondumine 1 1,5 minutit, mille järel DNA pole enam nukleaasidele kättesaadav. Rakku kandumise kiirus on 180
annaabi.ee 
