10. Millistel juhtudel on vajalik kasutada molekulaarseid meetodeid?- kui mikroskoopia võib anda valepositiivseid tulemusi- gonorröa; viiruste; aeglane bakterite kasv-mükobakterid; seroloogia võib anda valeposit.tulemusi-klamüüdia; subtüpeerimine, klassikalise meetodi mdal tundlikkus 11. Mida tähendab lühend PCR?- polymerase chain reaction e. polümeraas ahelreaktsioon 12. Nimeta PCR etapid, mitu korda harilikult neid korratakse?- DNA denaturatsioon; praimeri seostumine-annealing; DNA süntees->20-30 korda 13. Kuidas nimetatakse PCR analüüsil temperatuuriga DNA vesiniksidemete lõhkumist?- Denaturatsioon 14. Kuidas nimetatakse PCR analüüsil praimerite seondumise etappi?- annealing 15. Millist kliinilist materjali saab kasutada PCR meetodil haigustekitaja tuvastamiseks?- röga, lima, seemnevedelik (DNA) 16. Millised on etapid haigustekitaja tuvastamiseks kliinilisest materjalist PCR meetodil?-algmaterjalisd
· Meditsiinis geneetiliste haiguste diagnoosimiseks DNA-analüüs polümeraasi (PCR) ahelreaktsiooni meetodil · Tänapäeva molekulaarbioloogia üks põhimeetoditest · Meetodi aluseks on DNA-s olevad STR järjestused · Leiab rakendamist fundamentaaluuringutes, kliinilises ja ka kohtupraktikas · Võimaldab mõne tunniga tekitada miljoneid koopiaid DNA järjestusi PCRi etapid · DNA denaturatsioon - kaksikheeliks laguneb kaheks üksikahelaks · Annealing e. praimerite seostumine DNA-le · DNA fragmendi süntees termostabiilse DNA polümeraasiga PCR-i eelised · Lihtne ja kiire kasutada · Väga tundlik meetod · DNA puhtus pole väga oluline · Võimalik kasutada algmaterjalina väga erinevaid asju ja aineid PCR-i puudused · Vajadus eelnevalt teada DNA järjestust,mille alusel sünteesida praimerid · PCR-i fragmendid jäävad suhteliselt lühikeseks · DNA replikatsiooni käigus võivad tekkida
"master-mix" (üks segu ~10 üliõpilase peale) järgnevatest komponentidest: 62 l H2O 10 l 10x Taq polümeraasi puhvrit 8 l 25 mM MgCl2 10 l 2 mM dNTP 5 l mõlemat nii T3 ja T7 praimerit (100 ng/l) ja viimasena lisa 1 l (5 ühikut) Taq polümeraasi (hoida jääl). Seejärel kanna saadud kogus 9-10 l kaupa kümnesse PCRi mikrotuubi laiali. (3) Lisa PCR tuubi 1 l (1-2 ng) lahjendatud DNA-d. (4) Paiguta tuubid PCRi masinasse ja vali profiil (denaturatsioon 95 oC 30s, hübridisatsioon ehk annealing 50 oC 30s ja ekstensioon 72 oC 1 min; 20 tsüklit). Alusta PCR'i. (5) Samal ajal valmista ...% geel. 40 ml TBE puhvri kohta on vaja kaaluda ... g agaroosi. Valmistamist vaata tööst nr 3. (6) PCRi lõppedes (<1 tund), analüüsi 1/5 saadud produktist agaroosgeelil. Selleks pipeteeri 10 l 1 x TBE foreesipuhvrit (lilla) + 2 l PCR tuubist kokku 12 l, kanda kõik geelile. Geelile lisada kindlasti molekulmassi marker ja kontroll PCR (amplifikatsioon tühjalt pBS SK+
Sellise termotöötluse abil saadakse valamisel ja sepistamisel tekkinud jämedateralisest struktuurist peeneteraline. Poollõõmutus Suurema süsinikusisaldusega terase (0,5% ja enam) kuumtöötluse kui ka normaliseerimise tulemusena moodustub struktuur, mis on liiga kõva nii külm- kui ka lõiketöötlemiseks. Nimetatud juhtudel ja teraste korral kasutatakse madalamatemperatuursemat mittetäielikku lõõmutamist e. poollõõmutust (partial annealing, incomplete annealing). Kuna sellise lõõmutamise peaeesmärgiks on terase kõvaduse vähendamine ja plastsuse suurendamine, siis nimetatakse seda ka pehmelõõmutuseks (soft annealing). Selle tulemusena saadakse üleeutektoidteraste struktuuris terajad (sferoidaalsed) tsementiidiosakesed. Eriti oluline on selliste karbiidiosakestega struktuur kiirlõike- ja kõrglegeerteraste korral. Poollõõmutust kasutatakse kõrgsüsinikteraste (üleeutektoidteraste) sisepingete
"master-mix" (üks segu ~10 üliõpilase peale) järgnevatest komponentidest: 62 l H2O 10 l 10x Taq polümeraasi puhvrit 8 l 25 mM MgCl2 10 l 2 mM dNTP 5 l mõlemat nii T3 ja T7 praimerit (100 ng/l) ja viimasena lisa 1 l (5 ühikut) Taq polümeraasi (hoida jääl). Seejärel kanna saadud kogus 9-10 l kaupa kümnesse PCRi mikrotuubi laiali. (3) Lisa PCR tuubi 1 l (1-2 ng) lahjendatud DNA-d. (4) Paiguta tuubid PCRi masinasse ja vali profiil (denaturatsioon 95 oC 30s, hübridisatsioon ehk annealing 50 oC 30s ja ekstensioon 72 oC 1 min; 20 tsüklit). Alusta PCR'i. Tegime 15 tsüklit. (5) Samal ajal valmista 1,2% geel. 40 ml TBE puhvri kohta on vaja kaaluda 0,6 g agaroosi. Valmistamist vaata tööst nr 3. (6) PCRi lõppedes (<1 tund), analüüsi 1/5 saadud produktist agaroosgeelil. Selleks pipeteeri 10 l 1 x TBE foreesipuhvrit (lilla) + 2 l PCR tuubist kokku 12 l, kanda kõik geelile.
b. 95 kraadi juures 10 sekundit – DNA denatureerimine c. 56 kraadi juures 20 sekundit praimerite hübridiseerimine d. 72 kraadi juures 1 minut – ekstensioon e. Korrata alates punktist b. 24 korda. f. 10 minutit 72 kraadi juures, et pikendada poolikuks jäänud PCRi produktid Millist template DNA-d ja praimereid kasutasin? Mille järgi valitakse PCR praimerite hübridiseerimise ehk annealing temperatuur? Milline sulamistemperatuur on praimeril l 5’- GCCATCTCATGCCCATCGC -3’ standardtingimustel ja millist hübridiseerimistemperatuuri kasutaksin? Kuidas need leidsin? Hübridiseerimise temperatuur ja aeg sõltub kasutavate praimerite sulamistemperatuurist, amplifitseeritava DNA konsentratsioonist ja reaktsioonisegu koostisest. Antud järjestuse sulamistemperatuuriks on 59,3 kraadi, mille leidsin: http://eu.idtdna.com/site/Order/oligoentry/set? seq=GCCATCTCATGCCCATCGC
ja omadusi. See on laialt levinud meetod nii terase omaduste muutmiseks nii materjalil kui ka lõpptoodetel. Termotöötluse abil on võimalik luua sama keemilise koostisega erinevate mehaaniliste omadustega teraseid. Termotöödeldavuse eeldused. - struktuurimuutus tardolekus (kalestunud struktuur) - lahustuvuse muutus või faasimuutus tardolekus Termotöötlus jaguneb kaheks PROTSESSI termotöötlus ja TUGEVDAV termotöötlus Protsessi termotöötlus Lõõmutamine- Lõõmutus (annealing) on niisugune termotöötlemise viis, kus terast kuumutatakse üle faasimuutuste temperatuuride Ac1, Ac3 (Acm) või üle Trekr järgneva aeglase jahutamisega, tavaliselt koos ahjuga. Lõõmutuse peamine eesmärk on vajalike omaduste tagamine terase ümberkristalliseerimise ja sisepingete kaotamise tagajärjel. Normaliseerimine- Normaliseerimine on selline termotöötluse viis, mille korral terast kuumutatakse 30...50 °C üle faasipiiri Ac3 (Acm), seisutatakse sellel temperatuuril ja
PCR-i puhul on vaja teada lühikesi järjestusi kahel pool sünteesitavat piirkonda. Külgnevate järjestuste järgi on sünteesitud komplementaarsed praimerid, tavaliselt 1525 nukleotiidi pikkused oligonukleotiidid. Nende seondumine DNA-ga on vajalik, kuna alad, kuhu praimerid kinnituvad, on fragmentide sünteesi initsiaatoriteks. Praimerid seonduvad komplementaarsusprintsiibi alusel mõlemale poole piirkonda. 2. Praimerite seondumine DNA ahelatega. Praimerite seondumine ehk annealing toimub 5070 °C juures. Selleks, et kinnitustemperatuur mõistlik oleks, tulebki praimerid teha 20 nukleotiidi pikkused. Sellisel juhul ongi nende sulamistemperatuur vajalikus vahemikus. 3. DNA süntees. Kui praimerid on amplifitseeritava DNA järjestuse kahelt poolt kindlaks teinud ja piiranud, sünteesib termostabiilne DNA polümeraas praimerite 3' otsast alates mõlemale DNA üksikahela fragmendile komplementaarse fragmendi, kasutades selleks segusse lisatud nukleotiide
puudused, restriktaasid ja nende kasutamine DNA analüüsil. Kasutatakse puhastatud DNA polümeraasi, oligonukleotiidseid parimereid ja dNTP-sid. Põhineb kolmel järjestikulisel reaktsioonil erinevatel temperatuuridel ning tsükleid korratakse umbes 30 korda. Kõigepealt denatureeritakse temperatuuri tõstmisega (tavaliselt 95C kraadi). Mahajahtumisel saavad praimerid seonduda komplementaarselt, see on annealing. Järgneb uue DNA fragmendi süntees DNA polümeraasi ja dNTP-de lisamisega. qPCR – DNA ja RNA paljundamiseks. Hinnatakse automaatselt kohe tekkiva amplifikatsiooni produkti hulka. Kasutatakse fluoressentsi detekteerivat termotsüklerit. Kasutatakse geeni ekspressiooni hindamiseks ning mutatsioonide ning SNPde leidmiseks RT-PCR – reverse transcriptase PCR, RNA kopeeritakse
Praimerid on valitud selliselt, et nad ei moodustaks omavahel dimeere (ehk ei oleks omavahel komplementaarsed) ning oleksid komplementaarsed lõiguga paljundataval DNA-l, millega praimerid seonduvad ning kust algab replikatsioon. b) Kasutatud PCR-i programm: 1. 95 o C 15 minutit ensüümi (polümeraasi) aktiveerimiseks 2. 95 o C 10 sekundit denatureerimine ehk ahelate lahku kuumutamine 3. 56 o C 20 sekundit praimerite hübridiseerumine DNAle (annealing) 4. 72 o C 3 minutit komplementaarse DNA ahela süntees (primeri ekstensioon) 5. Korda alates 2. punktist veel 21 korda Esimese etapi pikkus sõltub valitud ensüümist, me kasutasime Hot FIREPol DNA polümeraasi, mis aktiveerub pärast 15 minutit inkubeerimist 95 o C juures. Teine etapp on vajalik selleks, et kas lisatud template DNA või eelmises tsüklis sünteesitud DNA ahelad denatureeruks, see peab olema võimalikult lühike. Kolmanda etapi (annealingu) pikkus sõltub
kus 3’ otsas on adeniin ja 5’ otsas on tümidiin ning vektori ja inserdi ligeerimisel toimub A-T otste paardumine. 2. Segasin kõik vortexiga, fuugisin ning asetasin segu PCRi masinasse. 3. PCRi programmi kirjutamine: 1. 95 °C 15 minutit – polümeraasi aktiveerimine 2. 95 °C 10 sekundit – DNA ahelate denatureerimine 3. 56 °C 20 sekundit – praimerite seondumine DNAle (annealing) 4. 72 °C 3 minutit – DNA süntees 5. Kordamine alates 2. punktist 21 korda 22. Selline sünteesiaeg valitakse sõltuvalt polümeraasist. HotFIRE Pol sünteesib keskmiselt 1 kb DNAd 1 minuti jooksul ning selline aeg valitakse nii, et kõik järjestused jõudsid paljuneda ( näiteks meil oli kõige pikem produkt – 2400 aluspaari). 23.DNA lahutamine agaroosgeelis 24. Eesmärgiks on visualiseerida oma produkti ning hinnata selle suurust. DNA lahutamisel
65 NUKLEIINHAPPE DENATURATSIOON. PCR reaktsiooni toimumiseks peab sihtmärgina kasutatav nukleiinhape olema üheahelaline. Sihtmärgina kasutatav DNA vabastatakse mikroorganismist kas kuumutamisel, keemilisel või ensümaatilisel meetodil. Prokarüootsete organismide, eriti bakterite puhul võib DNA vabastamiseks bakterirakku kuumutada üle 90°°C. PRAIMERI SEOSTUMINE (ANNEALING). Praimer on lühike nukleiinhappe lõik (oligonukleotiid pikkusega 20-30 nukleotiidi), mis vastavalt komplementaarsusele seostub (annealing) teatud kindla nukleiinhappe järjestusega. Igal mikroorganismi liigil, geenil, operonil on mingi unikaalne järjestus, mida on võimalik määrata sekveneerimisel, leida need andmed andmebaasidest (GENBANK jne.). Praimerid valitakse ja disainitakse nii, et nad asetseksid huvipakkuvast geenist või
rada. Alustuseks toimub kaheahelaline katkestus Spo11 poolt, millele järgneb 5’otste lõikamine. Seejärel toimub ahela invasioon, kus üleulatuv 3’ots tungib homoloogilise DNA osa vahele kus ei ole toimunud katkestust. Tekivad X kujulised Holliday struktuurid, mis ühendavad kahte DNA molekuli. Toimub mismatch parandus. DSBR mudeli järgi võivad tekkida nii ristsiire kui konversioon. Toimub 10% sagedusega. • SDSA – synthesis-dependent strand annealing – ehk süntees-sõltuva ahela seondumine. Esimesed sammud on samad kui DSBR puhulgi: DSB, 5’otste lõikamine, ahela invasioon. Toimub 3’üleulatuva ahela paardumine homoloogilise järjestusega – invasioon. Siin ei teki Holliday struktuuri, moodustub D-loop. Toimub sissetunginud 3’otsa pikendamine piki homoloogset DNA dupleksit DNA polümeraasi vahendusel, nii et toimub D- loop’i translokatsioon. Nagu edasi liikuv mull. Toimub ligeerimine ja
PLOS ONE | www.plosone.org 1 June 2013 | Volume 8 | Issue 6 | e66601 Intragenomic Profiling Using Multicopy Genes River Ro~uge (specimen R); the Gulf of Finland drainage basin: denaturation at 95uC for 45 s, annealing at 55uC or 61uC for 45 s, Stream Vanamo~isa (specimens V1, V2, V3, V4, V5 and V6); the and extension at 72uC for 1 min with a final extension at 72uC for Moonsund Sea and the Gulf of Riga drainage basin: River Lokuta 10 min. (specimen L), River Pedetsi (specimens Pe1 and Pe2) and River The success of PCR amplifications was initially evaluated by Ko~pu (specimens K1 and K2)
annaabi.ee 
