Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standard- lahusest, mis sisaldab glükoosi täpselt . · Standardlahusest valmistasin kolm lahjemat glükoosilahust ehk lahjendust järgmiselt. kontsentratsiooniga standardlahust pipeteerisin sobiva suurusega katseklaasi 2,5 ml, millele pipeteerisin 7,5 ml destilleeritud vett. Katseklaasi sulgesin korgiga ning loksutasin glükoosilahust kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Tehtud lahjendusest pipeteerisin 5 ml lahjendatud glükoosilahust teise kuiva katseklaasi ning pipeteerisin sinna sama palju destilleeritud vett. Jällegi sulgesin katselaasi korgiga ja loksutasin kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Tehtud teisest lahjendusest pipeteerisin 5 ml lahust kolmandasse katseklaasi ning samuti 5 ml destilleeritud vett. Jällegi sulgesin katseklaasi korgiga ning loksutasin segamini. Antud lahjenduste katseklaasid olid vastavalt märgistatud.
Töö käik Mulle oli antud tundmatu mahuga vedelik, mille sees oli tundmatu massihulk etanooli. Kõigepealt lahjendasin antud lahust kuni 250ml kriipsuni. See oli esimene lahjendus. Seejärel valmistasin ette kolm 150 ml kolbi, milles oli 10 ml K2Cr2O7 ning 5ml kontsentreeritud väävelhapet. Väävelhappe lisamisel lahus kuumenes. Jahutasin seda mõnda aega ning lisasin etanooli lahuse. Saadud lahus värvus roheliseks, mistõttu lahjendasin etanoolilahust veelgi, lisades esialgsest lahjendusest 10 ml ning lisades destilleeritud vett 250ml kriipsuni. Teise lahjenduse lisamisel kaaliumdikromaadile ning kontsentreeritud väävelhappele, lahus roheliseks ei värvunud, seega sain seda kuumutada. Lasin lahusel keema minna ja sellest hetkest kuumutasin 10 minutit. Seejärel valasin kogu kolvi sisu 500 ml koonilisse kolbi ning lisasin 300 ml destilleeritud vett (millega 150ml kolvi sisu üle loputasin). Saadud lahusesse lisasin 1,0 grammi kaaliumjodiidi ja lasin sel lahustuda 2 minutit
segamini. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks: Valmistasin 1,0 mg/ml kontsentrasiooniga glükoosi lahusest 3 lahjendust: 0,25, 0,125 ja 0,062 mg/ml. 0,25 mg/ml lahjendus: pipeteerisin puhtasse katseklaasi 2,5 ml glükoosi standardlahust ja lisasin dest. vett 7,5 ml, panin katseklaasi korgi peale ja loksutasin. Pipeteerisin esimest lahjendust 5 ml teise katseklaasi, kus oli juba 5ml destilleeritud vett ning loksutasin, nii sain 0,125 mg/ml lahjenduse. Teisest lahjendusest pipeteerisin 5 ml kolmandasse katseklaasi, kus oli samuti 5 ml destilleeritud vett ning loksutasin. Sain kolmanda lahjenduse, 0,062 mg/ml. Reaktsiooni läbiviimine (toatemperatuuril): 1. Markeerisin 6 kuiva ja puhast katseklaasi ja asetasin need statiivi. 2. Katseklaas nr. 1: pipeteerisin sinna 1 ml destilleeritud vett (kontrollproov, mis näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni). 3. Katseklaasid nr. 2 ja 3: 1 ml greibimahla lahust (paralleelproovid). 4
Standardlahusest valmistasin kolm lahjemat glükoosilahust. Selleks kasutasin samm-sammult lahjendamist: Nagu skeemilt näha, toimisin järgnevalt: võtsin 2,5 ml standardlahust ning lisasin 7,5 ml destilleeritud vett ja loksutasin hoolikalt läbi. Sain lahuse kontsentratsiooniga 0,25 mg/ml. Seejärel võtsin saadud lahusest 5 ml järgmisesse katseklaasi ning lisasin juurde 5 ml destilleeritud vett ja loksutasin. Sain lahuse kontsentratsiooniga 0,125 mg/ml. Viimaks võtsin saadud teisest lahjendusest 5 ml lahust ning lisasin 5 ml destilleeritud vett, loksutasin. Kolmanda lahjenduse sain kontsentratsiooniga 0,062 mg/ml. Värvusreaktsiooni läbiviimine Reaktsiooni tööreaktiiviga viisin läbi katseklaasides toatemperatuuri juures. Selleks asetasin katseklaaside statiivi 6 puhast, kuiva katseklaasi ning nummerdasin need. Katseklaasi nr 1 pipeteerisin 1 ml destilleeritud vett, katseklaasidesse nr 2 ja 3 1 ml mee tõmmist ning
Steriilse pipetiga võetakse koonilisest kolvist 1 ml jõevett ning viiakse esimesse katseklaasi. Lahust segatakse hoolikalt 30 sekundit Vortex mikseril. Saadakse lahjendus 10¹, mis viiakse nii Petri tassi kui ka järgmisesse katseklaasi, kus saadakse lahjendus 10². Saadud lahus segatakse ning viiakse uue steriilse pipetiga kahte tassi kui ka katseklaasi. 10³ lahus segatakse ning külvatakse tassi. Järgmisena tuleks lisada tõmbekapi all lahust. Coli-laadseid baktereid määratakse jõevee lahjendusest 10¹ ja 10². Mikroobide üldarv aga lahjendustest 10² ja 10³. 1 ml kraanivett lisatakse kahte Petri tassi ning saadakse lahjendus 10¹ ehk 10. Ühte tassi valatakse lahust coli-laadsete bakterite, teise mikroobide üldarvu määramiseks. Mõlematel lahjendustel lastakse seista, kuni need tahenevad. Seejärel viiakse tassid inkubaatorisse. Coli-laadseid hoitakse 37º ja mikroobe 22º juures 48-72 tundi.
Töö ettevalmistamine: Reagentideks on: substraadiks suhkrulahus ja ensüümiks invertaasi lahus. Ensüümi lahus valmistatakse 0,1-0,5% (või kuni 2%) invertaasi lahusena atsetaatpuhvris (0,1M), mille pH 4,8. Sahharoosi algne 0,1M lahus valmistatakse puhvris, mille pH 4,8. Sellest valmistatakse lahjendusega omakorda madalama kontsentratsiooniga lahus (näiteks 0.05M, 0.025M või 0.0125M sahharoosi lahus). Lahjendamine toimub samuti puhvriga. Vajadusel tehakse viimasest lahjendusest veel kord üks lahjendus veelgi väikesema substraadi kontsentratsiooni (näiteks 0.00625M) saamiseks. Töö teostamine: Esmalt täidetakse polameetri toru lähtesuhkrulahusega selleks et määrata lähtepöördenurk (alghetke t = 0 väärtus) . Seejärel valatakse lähtelahus polameetri torust välja ja puhastatakse see. Reaktsioonisegu valmistamiseks lisatakse eraldi katseklaasis 25 ml-le määratletud kontsentratsiooniga (näiteks 0
korda suunaga ülalt alla ning sama protseduur kuiva tampooniga tampooni ots 30 ° nurga all testitava pinna suhtes hõõruge aeglaselt kuid piisava tugevusega Tampoonid asetatakse katseklaasi, mis sisaldab 5 ml lahjendusvedelikku nt. Maximum Recovery Diluent või füsioloogiline lahus murdke steriilselt ära ülemine osa ning sulgege katseklaas Laboris teostatakse tavaliselt üksnes proovi 1:10 ja 1:100le lahjendus (enamasti piisab üksnes 1:10le lahjendusest, sest kui siin kasvab välja liigselt baktereid siis on tegemist liiga mustade pindadega. MIKROOBIDE JAGUNEMINE HINGAMISTÜÜBI ALUSEL JA VASTAVALT HAPNIKULE REAGEERIMISELE Obligatoorsed aeroobid: vajavad elutegevuseks hapnikku Fakultatiivsed anaeroobid: kasvavad ka hapnikudefitsiidis, lülitudes ümber käärimisele või anaeroobsele hingamisele; parim kasv siiski aeroobsetes tingimustes Obligatoorsed anaeroobid: kasvavad ainult hapnikuvabas keskkonnas
ensüümi toimel). Töö ettevalmistamine: Reagentideks on: substraadiks suhkrulahus ja ensüümiks invertaasi lahus. Ensüümi lahus valmistatakse 0,1-0,5% (või kuni 2%) invertaasi lahusena atsetaatpuhvris (0,1M), mille pH 4,8. Sahharoosi algne 0,1M lahus valmistatakse puhvris, mille pH 4,8. Sellest valmistatakse lahjendusega omakorda madalama kontsentratsiooniga lahus (näiteks 0.05M, 0.025M või 0.0125M sahharoosi lahus). Lahjendamine toimub samuti puhvriga. Vajadusel tehakse viimasest lahjendusest veel kord üks lahjendus veelgi väikesema substraadi kontsentratsiooni (näiteks 0.00625M) saamiseks. Töö teostamine: Esmalt täidetakse polameetri toru lähtesuhkrulahusega selleks et määrata lähtepöördenurk (alghetke t = 0 väärtus) . Seejärel valatakse lähtelahus polameetri torust välja ja puhastatakse see. Reaktsioonisegu valmistamiseks lisatakse eraldi katseklaasis 25 ml-le määratletud kontsentratsiooniga (näiteks 0
mida mõõtsid kursusekaaslased sama katset läbi viies, siis võib eeldada, et esimene lahjendus on korrektselt läbi viidud. Selle lahjenduse läbiviimisel ei olnudki suurt võimalust eksida, kui juhendit täpselt järgida. Tundub, et mul võis jääda esimene lahus korralikult läbiloksutamata, et kontsentratsioon ühtlustuks, sest teise lahjenduse optiline tihedus on võrreldes kursusekaaslaste omadega ja võrreldes ka esimese lahusega liiga väike. Rääkimata kolmandast lahjendusest, kus optiline tihedus on juba nullilähedane. Seega võis probleem suure tõenäosusega sisse tulla lahjenduste valmistamisel. Kuna kunstlikult valmistatud graafik pole täiesti korrektne, siis on kahjuks võimatu arvutada ka hüpoteetilist glükoosisisaldust (graafiku trendline ei anna arvutamiseks paraku päris korrektset valemit).
ensüümi toimel). Töö ettevalmistamine: Reagentideks on: substraadiks suhkrulahus ja ensüümiks invertaasi lahus. Ensüümi lahus valmistatakse 0,1-0,5% (või kuni 2%) invertaasi lahusena atsetaatpuhvris (0,1M), mille pH 4,8. Sahharoosi algne 0,1M lahus valmistatakse puhvris, mille pH 4,8. Sellest valmistatakse lahjendusega omakorda madalama kontsentratsiooniga lahus (näiteks 0.05M, 0.025M või 0.0125M sahharoosi lahus). Lahjendamine toimub samuti puhvriga. Vajadusel tehakse viimasest lahjendusest veel kord üks lahjendus veelgi väikesema substraadi kontsentratsiooni (näiteks 0.00625M) saamiseks. Töö teostamine: Esmalt täidetakse polameetri toru lähtesuhkrulahusega selleks et määrata lähtepöördenurk (alghetke t = 0 väärtus) . Seejärel valatakse lähtelahus polameetri torust välja ja puhastatakse see. Reaktsioonisegu valmistamiseks lisatakse eraldi katseklaasis 25 ml-le määratletud kontsentratsiooniga (näiteks 0
ensüümi toimel). Töö ettevalmistamine: Reagentideks on: substraadiks suhkrulahus ja ensüümiks invertaasi lahus. Ensüümi lahus valmistatakse 0,1-0,5% (või kuni 2%) invertaasi lahusena atsetaatpuhvris (0,1M), mille pH 4,8. Sahharoosi algne 0,1M lahus valmistatakse puhvris, mille pH 4,8. Sellest valmistatakse lahjendusega omakorda madalama kontsentratsiooniga lahus (näiteks 0.05M, 0.025M või 0.0125M sahharoosi lahus). Lahjendamine toimub samuti puhvriga. Vajadusel tehakse viimasest lahjendusest veel kord üks lahjendus veelgi väikesema substraadi kontsentratsiooni (näiteks 0.00625M) saamiseks. Töö teostamine: Esmalt täidetakse polameetri toru lähtesuhkrulahusega selleks et määrata lähtepöördenurk (alghetke t = 0 väärtus) . Seejärel valatakse lähtelahus polameetri torust välja ja puhastatakse see. Reaktsioonisegu valmistamiseks lisatakse eraldi katseklaasis 25 ml-le määratletud kontsentratsiooniga (näiteks 0
vaja proovi lahjendada. 4. Mida tähendab termin ,,kolooniat moodustav ühik"? See tähendab elusrakkude arvu 1g või 1 ml uuritavas proovis. 5. Kui suur on optimaalne kolooniate arv Perti tassil, et saada objektiivne tulemus plaadimeetodil? Pindkülvi puhul 20-200 kolooniat ning sügavkülvi puhul 30-300 kolooniat 6. Mis on kõige tõenäolisema arvu meetodi põhimõte? Piirlahjenuste ehk tõenäolisema arvu meetod põhineb uuritavast proovist lahjendusrea valmistamisel ja lahjendusest väljakülvide tegemisel vedelsöötmega katseklaasidesse. 7. Millised on kõige tõenäolisema arvu meetodi eelised ja puudused võrreldes plaadimeetodiga? Piirlajenduste eeliseks on see, et saadakse kõrgemad tulemused, kuid plaadimeetod on täpsem. Seega saab puuduseks lugeda ligikaudsust, kuna tulemus antakse 95% statistilise tõenaäosusega. Puuduseks ka töömahukus. 8. Kui palju on vaja lahjendada uuritavat proovi kõige tõenäolisema arvu
Dissotsieerumata happe kontsentratsioon saab võrdseks happe üldkontsentratsiooniga ja [CH3COO‾] saab võrdseks soola üldkontsentratsiooniga. pH=pK + log Csool pK=–logKd Chape Nõrgast alusest ja tema soolast koosnev puhverlahus: [OH‾]=Kd·Calus Csool pH=pK + log Csool pK=–logKd Chape pH väärtus ei sõltu lahjendusest. Puhverlahuse toimemehhanism: 1. võtame etanaatpuhvri ja lisame HCl (tugev hape, dissotsieerub täielikult ioonideks). Lisandunud H+- ioonid seotakse etaanhappe koosseisu, lahuses olevate etanaat-anioonide arvelt. CH3COONa + HCl → CH3COOH + NaCl CH3COO‾ + H+ → CH3COOH 2. lisades tugevat alust NaOH, siis lahuses olevad H+-ioonid seovad lisatud (liigsed) OH-ioonid ja tekib vesi. CH3COOH + NaOH → CH3COONa + H2O H+ + OH‾ → H2O
või patogeensete mikroorganismide loendamiseks). Võrreldes plaadilt lugemise meetoditega (plate count methods) on eeltoodud meetodid vähem täpsed, kuid võimaldavad määrata proovimaterjalis väga vähesel hulgal esinevaid mikro- organisme. Tavaliselt valmistatakse ette kümnekordsed proovilahjendused, mida lisatakse 0,9 ml või 9 ml söötme kohta vastavalt 0,1 ning 1 ml. Iga proovi lahjenduse kohta tuleb teha 35 paralleelseeriat ehk 3-5 proovi igast lahjendusest. Pärast inokuleeritud söötmekatsutite inkubeerimist määratakse iga proovi puhul sihtmärk-organismide olemasolu. Kõige tõenäolisema arvu määramisel kasutatakse tõenäosustabeleid. Seda meetodit kasutatakse sageli fekaalsete indikaatorbakterite (coli-laadsed) arvukuse määramisel. Positiivsete proovidega katsutitesse moodus- tub hapet ja gaasi. Gaasi olemasolu on määratav gaasimullide tekkega klaastoru- kestesse, mis on eelnevalt katsutitesse lisatud. Alternatiivsed meetodid. 1
annaabi.ee 
