DNAst) 5. Lisa 0,2ml E2 lahust ning pipeteeri mitu korda edasi-tagasi. E2-s sisalduv SDS solubiliseerib (lahustab pisikesteks puhvris ujuvateks mullikesteks e.mitsellideks) bakteriraku membraani fosfolipiidid ning denatureerib valgud. Naatriumhüdroksiid aga denatureerib DNA struktuurid. Lahus muutub"tatiseks" 6. Inkubeeri laua peal 3 minutit. Selle aja jooksul muutub lahus selgemaks. Juhul, kui inkubeerida üle 5 minuti, saad saagise hulka bakteri genoomseid järjestusi ning vähenab plasmiidse DNA hulk, mis korrektselt järgmises etapis renatureerub (puhastamise saagis väheneb!). 7. Pipeteeri peale 0,3 ml E3 lahust ja raputa segu kuni see on täiest ühtlane. Peaksid nägema helbeid, mitte valkjaid triipe lahuses. 8. Tsentrifuugi 10 min maksimumpööretel toatemperatuuril (RT) eppendorfi
Rakud ei ole saastanud ega surnud ning nende tihedus on umbes 20%. 1. Pesta rakke 1x PBSiga (PBS on sobiva pH-ga ja osmootset tasakaalu hoidev lahus). Selleks rakkudelt imeda vaakumiga sööde (tassi kallutades), pipeteerida 4 ml PBSi tassi külje vastu, et rakud lahti ei tuleks, loksutada õrnalt ning rakkudelt imeda vaakumiga PBS. PBSiga pestakse rakke selleks, et eemaldada surnud rakud, söötmejäägid ja seerum. 2. Lisada 0,2 ml trüpsiin-EDTA lahust, inkubeerida mitte rohkem kui 5 min. Trüpsiin on proteaas, mis lõikab katki rakuadhesiooni valgud ning aitab rakud plastiku küljest lahti saada. Kui liiga kaua inkubeerida hakkab ka raku teisi valke lõikama. Et pärast inhibeerida trüpsiini toimimist, lisatakse 1 ml söödet (DMEM + 10% FBS + PEST). Suspendeerida rakud automaatpipetiga tassi küljest lahti. 3. Tassile peab jääma rakkude tihedus 10%. Meie hinnatud rakkude tihedus on 20%. Seega
3.2 PCRi produkti puhastamine 1. Lõikasin UV-laual skalpelliga minu bänd välja. Proovisin seda tega võimalikult hoolikalt, et tükk oleks võimalikult väike ja sisaldaks kogu DNAd. 2. Eelnevalt kaalusin tuubi (1,01g), panin selle tuubi sisse oma geelitükk, ning kaalusin neid kokku. Sain, et lõiku kaal on 1,18g – 1,01g = 0,17g. 3. Lisasin 0,1g geeli kohta 0,3 ml, ehk 17*0,3 = 0,51ml = 510 µl ADPd (Agarose Dissolving Buffer), mis lahustab geeli, ning panin inkubeerida 55 C 5 juures geeli täeliku sulamiseni. Vahepeal nipsutasin tuubi, et kiirustada sulamist. 4. DNA – geeli – puhveri segu pipeteerisin Zymo-SpinTM kolonni (mis oma korda koosneb kolonnist ja kogumistopsist. Kolonn sisaldab ränifiltri, läbi mille me laseme oma segu jooksma. DNA seostub räniiksiidi osakestega, sellega ta ei saata kogumistopsi, vaid jääb kolonni filtri peale. Kolonni saagis minu DNA lõigule on vahemikus 70-90%) ja
0+ = 26 600 / 0,65 = 40 900 26 600 / 0,7 = 38 000 25 000 / 0,65 = 38 400 25 000 / 0,7 = 35 700 Sest 1 suvistest jääb ellu 65-70% kalavastsed = 40 900 / 0,5 = 81 800 40 900 / 0,6 = 68 200 38 000 / 0,5 = 76 000 38 000 / 0,6 = 63 300 38 400 / 0,5 = 76 800 38 400 / 0,6 = 64 000 35 700 / 0,5 = 71 400 35 700 / 0,6 = 59 500 Vastus: Inkubeerida on vaja 59 500 81 800 karpkala vastset. Võib ka kasutada tabelit 11. õpikus lk 70. 20 000 = 26-31%, vastsed X = 100%, X = 64 500 76 900 vastset 3.. Karpkalakasvataja asustas 1 ha tiiki 200 kaheaastast 350 g raskust karpkala, mille ta ostis hinnaga 100 kr/kg. Kui palju ta võiks saada kasvatatud kala müügist kasu, kui müüb seda sügisel turuhinnaga 40 kr/kg ja ei kuluta söödale ega arvesta oma töökulu ega maksa käibemaksu? 200 x 0,35 kg x 100 = 7000 krooni
· vältida lähisugulusristamist, kasutades eri vanusega sugukalu; · kasutada järglaste saamiseks võimalikult suurt arvu sugukalu (minimaalselt 50, võimaluse korral 150300, pikaajalise kaitseprogrammi puhul 500); · kasutada võimalusel võrdset arvu emas ja isassugukalu; · ühe emaskala mari jagada 2 või enamaks osaks ja iga osa viljastada eri isaskala niisaga; vältida erinevate isaskalade niiskade segamist; · viljastatud portsjonid inkubeerida eraldi ja ka kasvatada võimaluse korral eraldi, et tagada kõigi vanempaaride võimalikult võrdne esindatus järgmise sugukalade põlvkonna moodustamisel. 3.3. Haiguste leviku vältimine · Asustusmaterjali võib tuua vaid tervetest (st haigusvabadest) kalakasvandustest. · Ei ole soovitav kasutada asustusmaterjali tootmiseks kalakasvandusi, kus on esinenud ohtlikke viirus ja bakteriaalhaigusi (VHS, furunkuloos).
8. Kuidas saab identsifitseerida/selekteerida baktereid rekombinantse plasmiidiga, kui plasmiidil on geenid, mis vastutavad nii ampitsilliini kui ka tetratsükliini resistentsuse eest ja sisend asub järjestuses, mis kodeerib tetratsükliini resistentsust? Selleks, et tuvastada huvipakkuva järjestusega baktereid, tuleb nende kolooniate osad asetada keskkonnale, kuhu lisati eelnevalt tetratsükliini ja inkubeerida. Need kolooniad, mis jäävad ellu ei sisalda huvipakkuva järjestust, kuna nende tetratsükli suhtes resistentsed geenid töötavad. Need, mis hukkuvad, sisaldavad huvipakkuva järjestuse. Saadud tulemusi võrreldakse esimese peetritassiga ja tuvastatakse, mis kolooniat sisaldavad järjestust. 9. Selgita alfa-komplimentatsiooni. Millised omadused peavad olema vektoril ja peremeesrakkul selle toimimise jaoks?
housekeeping geenid ehk siis konseveerunud järjestused. 5. Millised kulturaalsed omadused on abiks mikroobide indentifitseerimisel? Koloonia kuju, suurus, värvus, konsistents, pind, läbilõige. 6. Kuidas on võimalik testuda kultuuris liikuvust ja endospooride esinemist? Liikuvus – ripptilgas. Hugh-Leifsoni sööde/süsivesikute kasutamise põhisööde – tehakse pistekülv. Endospooride esinemine – külvatakse toitepuljongiga katseklaasi, inkubeerida 80 kraadi juures ja inkubeerida termostaadis, et spoorid idaneksid. Teha väljakülv R2A agarile ja sealt omakorda preparaat. 7. Kuidas testitakse suhkrute kasutamist? O/F testiga. 8. Mis on käärimine? Orgaaniliste ühendite lagundamine anaeroobses tingimuses 9. Miks on käärimistesti vaatluseks optimaalne aeg umbes kaks päeva peale külvamist? Kui hiljem vaadata, siis kasvukeskkonnas olevate teiste substraatide aluselised laguproduktid varjutavad tekkinud happelise reaktsiooni 10
Pesen sadet etanoolidga. Suspendeerin 30 µl MQs. Mis juhtub erinevate biomolekulidega aluselises keskkonnas? Aluselise keskkonna loob E2 lahus. Selle tagajärjes bakteriraku membraani fosfolipiidid moodustavad mitsellid ja valgud denatureeruvad. NaOH denatureerib DNA kõrgemat järku struktuurid. Kuidas tagada, et välja puhastuks vaid meid huvitav plasmiidne DNA, mitte bakteri enda genoomne DNA. Peale E2 lahuse lisamist ei tohi liiga kaua inkubeerida. Muidu denatureerub ka plasmiidne DNA mis järgmises etapis sadeneb. Laboris puhastati plasmiidset DNA’d, aga saadud plasmiidi kogus tuli liiga väike. Mida korduskatses teisiti teha? E1 lahuse lisamise järel tuleb veenduda et lahusesse ei jääks tükke. Kõik peab olema piimjas mass. Muidu need tükid ei lüüsu täielikult. Jälgida, et peale E2 12 lisamist ei inkubeeriks liiga palju. Jälgida, et etanooliga pesteks kogemata sadet
· Aitavad DNA molekuli keerdus hoida · Reguleerivad geeni ekspressiooni (loeng 3, 5 -genoom, ploidsus; epigeneetika) Meetodid: PCR - Polymerase chain reaction (PCR). Vaja praimereid, mis on disainitud sisestatud geeni järgi. 1. Inkubeeritakse sihtmärgi DNA-d 94 kraadi juures 1 minut, et eraldada ahelad. 2. Lisatakse praimerid, nukleotiidid ja DNA polümeraas 3. Praimerid kinnituvad üksikutele DNA ahelatele 60 kraadise ikubatsiooni ajal ühe minuti jooksul 4. Inkubeerida 72 kraadi juurres 1 minut, selle aja jooksul moodustub 2 koopiat sihtmärgi DNA-d 5. Korratakse veel kuumutamise-jahutamise tsüklit, et teha veel 2 koopiat sihtmärgi DNA-d (loeng 6 meetodid) Geelelektrofrees - Southern Blot - Testib, kas sisestatud geen on terve ja `ühes tükis', õiges suunas (orientation), ja koopia arvu. DNA kodeeriva järjestuse alusel disainitakse proov, millega hübridiseeritakse transgeense taime DNA-d
http://www.fermentas.com/, ja lisamaterjalid. Restriktaasi 10 x puhver (lisatakse 1/10 reaktsiooni mahust) T4 DNA ligaas 5 u/l (Fermentas, vt. lisa), hoitakse jääl 5 x Ligeerimispuhver (Fermentas) Töö käik: (märgista kõik oma katsetuubid nii, et tunned need pärast ära; näiteks initsiaalidega) (1) Kahe üliõpilase peale restrikteerida ~120 ng genoomset DNA-d Cfr42I-ga: 12,5 l genoomset DNA-d + 1,5 l restriktaasi 10 x puhvrit kokku 15 l; segada, fuugida ja inkubeerida 37oC 60 min + 1 l restriktaasi Cfr42I (jääl) (2) Peata restriktsioon kuumutades 65 oC 20 min (restriktaas inaktiveerub). Tsentrifuugi, et eemaldada kaanelt kondenseerunud veeaur ja seejärel sega lahuse ühtlustamiseks. (3) Ligeerimisreaktsiooniks pipeteeri järgmisi komponente sellises järjekorras (teostab iga üliõpilane): 3 l restrikteeritud genoomset DNA-d + 1 l Cfr42I restrikteeritud pBS SK+ plasmiidi (10 ng) (teostatud juhendaja poolt)
T4 DNA ligaas 5 u/l (Fermentas, vt. lisa), hoitakse jääl 5 x Ligeerimispuhver (Fermentas) Töö käik: (märgista kõik oma katsetuubid nii, et tunned need pärast ära; näiteks initsiaalidega) (1) Kahe üliõpilase peale restrikteerida ~120 ng genoomset DNA-d Cfr42I-ga: Restriktsioon-ferment, mis lagundab DNA molekuli kindlates kohtades. 12,5 l genoomset DNA-d + 1,5 l restriktaasi 10 x puhvrit kokku 15 l; segada( segame Vortexiga), fuugida ja inkubeerida 37oC 60 min + 1 l restriktaasi Cfr42I (jääl) (restriktaasi 10x puhver tähendab seda, et lahuse kontsentratsioon on 10 korda suurem ,kui vaja on.) (2) Peata restriktsioon kuumutades 65 oC 20 min (restriktaas inaktiveerub). Tsentrifuugi, et eemaldada kaanelt kondenseerunud veeaur ja seejärel sega lahuse ühtlustamiseks. (3) Ligeerimisreaktsiooniks pipeteeri järgmisi komponente sellises järjekorras (teostab iga üliõpilane):
eelrikastamispuljongi suhe on 1:100 ning inkubeerimise temperatuuriks on 42 °C (>43 °C temperatuur võib olla salmonelladele surmav). Poolvedel sööde, MSRV ja Diasalm baseeruvad samuti RV printsiibil. Tetrationaatpuljongi selektiivsus põhi- neb tetrationaadi, sapisoolade ja briljantrohelise olemasolul. Seleniidil baseeruvaid söötmeid on kasutusel mitmeid, kuid enim poolehoidu on leidnud SC-puljong. Vältimaks SC-puljongi inhibeerivat mõju salmonelladele, tuleb seda inkubeerida 37 °C juures. Selekteerivad plaatsöötmed põhinevad teatud selektiivsetel ainetel ja diferentsiaalanalüüsidel (nt süsivesikute fermentatsioon ja vesiniksulfiidi produkt- sioon). Sel eesmärgil kasutatakse kõige sagedamini briljantrohelise (BR) ja ksüloos-lüsiin-deoksükolaadi (XLD) agarit. Ksüloos-lüsiin-deoksükolaat-tergitool 4 agar sisaldab Proteus spp. ja teiste mitte salmonellade inhibeerimiseks vajalikku ainet (tergitool 4)
koldest), kui kasutada pikka inkubatsiooniaega (3 päeva – 2 nädalat). Seroloogiat võib kasutada kliinilise diagnoosi kinnitamiseks. Neljakordselt kõrgenenud tiiter paarisseerumite puhul, ühekordne kõrge tiiter on diagnostilise väärtusega. Samas võib kõrge tiiter säilida kuid, aastaid. Esinevad ristreaktsioonid teiste bakteritega. Francisella: mikroskoopia ei ole tundlik. PCR on hindamisel. Sööde peab olema tsüsteiiniga rikastatud, on tundlik ja spetsiifiline, kui kaua inkubeerida. Seroloogia diagnoosi kinnitamiseks. Sama jutt, mis eelmisel. Ristreaktsioonid Brucellaga. Ravi ja profülaktika. Brucella. Soovitatav doksütsükliin koos rifampiiniga vähemalt 6 nädalat. Rasedatel, alla 8-aastastel TMP-SMX. Inimeste haigestumist saab kontrollida loomreservuaari kõrvaldamisega vaktsineerimisel, loomade seroloogilisel monitooringul, piimatoodete pastöriseerimisel, laboris ohutusnõuete järgmisel. Francisella
bakteroididele). Anaeroobseks uuringuks saadetud materjalist tehakse alati ka aeroobne külv. Selektiivsete söötmete kasutamine kiirendab tekitajate esialgset identifitseerimist ning kergendab erinevate tekitajate isoleerimist segainfektsiooni korral. Esmaskülve inkubeeritakse anaeroobselt 48 tundi ning kasvu puudumisel veel 48 tundi. Mõningate tekitajate kahtluse korral (näit aktinomükoos) tuleb esmaskülve inkubeerida mitu nädalat enne lõpliku negatiivse vastuse väljastamist. Esialgne samastamine. Võrreldakse omavahel kasvu aeroobselt ja anaeroobselt inkubeeritud söötmetel ning erinevatel selektiivsetel söötmetel; erinevatest anaeroobses külvis leiduvatest pesadest tehakse aerotolerantsuse test, et kindlaks teha, kas on tegemist tõeliste obligaatsete anaeroobidega või fakultatiivsete anaeroobidega. Lõplik samastamine
annaabi.ee 
