alaühiku asend ruumis Saperonid Tugivalgud Valgu funktsioonid Kolmedimensioonilise struktuur Ühedimensiooniline järjestus Ligand Ensüümid Kõrgmolekulaarsed bioloogilised katalüsaatorid Interaktsioonid Valgusüntees Mitmeasteline protsess Ribosoomid Valkude eraldamise meetodid Väljasoolamine erinevad valgud sadestuvad erineva soolakontsentratsiooni juures Dialüüs eraldamine läbi poolläbilaskva membraani Geelfiltratsioonkromatograafia suuremate ja väiksemate molekulide erinev liikuvus läbi geeli Ioonivahetuskromatograafia laenguga valkude seondumine kolonni Afiinsuskromatograafia valkude afiinsus spetsiifiliste keemiliste rühmade suhtes Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia Valkude keemilised omadused Valkude denatureerumine-pöördumatu muutmine Küsimused Mis on valgud? Mis on valkude ülesanne? Mis on kõige suurem valk? Mis on valkude denatureerumine? Mis on saperonid?
2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Teooria Geelkromatograafia ehk geelfiltratsioonkromatograafia põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende molekulmassi suuruse järgi. Erineva molekulaarmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise poorse geeli erineva kiirusega. Meetodit kasutatakse makromolekulide lahutamisel ja proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil. Protsess viiakse läbi kinnises süsteemis kolonnis, mis on täidetud pundunud geelikraanulitega, mille pooride suurus on võrreldavad lahuses sisalduvate makromolekulide suurusega.
TÖÖ 2.1: AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEET ODIL Juhendajad: Kaia Kukk Priit Eek Teooria Geelkromatograafia ehk geelfiltratsioonkromatograafia on üks kromatograafia meetoditest, mille põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine ehk fraktsioneerimine nende molekulmasside, täpsemalt molekulide enda suuruste järgi. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks, kusjuures proov
TTÜ Keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool YKL0060 Laboratoorne töö: nr. 4 Töö pealkiri: 2.2 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Õpperühm: YAGB22 Töö teostaja: Õppejõud: Töö teostatud: 12.04.2010 Protokoll esitatud: 16.05.2010 2.2 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Töö teoreetilised alused: Geelkromatograafia ehk geelfiltratsioonkromatograafia on segu komponentide lahutamise ehk fraktsioneerimise meetod, mis põhineb aine molekulmassidel ja nende erineval jaotumisel liikuva ja liikumatu faasi vahel. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise , võimalikult ühesuguse poorsusega geeli. Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse (vastavalt molekuli suurusele).
TTÜ Keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool Töö nr. 2.1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL Geelkromatograafia e geelfiltratsioonkromatograafia on kromatograafia meetod, mille põhimõtte on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende molekulmassi suuruse järgi. Erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks. Geelkromatograafias viiakse protsess läbi kinnises süsteemis, mis on täidetud pundunud
Õpperühm: Töö teostaja: YAGB22 MIHKEL HEINMAA Õppejõud: Töö teostatud: Protokoll esitatud: MALLE KREEN 1/03/2010 15/03/2010 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL (2.2) TEOORIA Geelkromatograafia ehk geelfiltratsioonkromatograafia (aka molekulaarsõel, eksklusioonikromatograafia) põhimõtteks on lahuses sisaldavate ainete lahutamine nende molekulmassi suuruse järgi. Erineva molekulaarmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise poorse geeli erineva kiirusega. Meetodit kasutatakse makromolekulide lahutamisel ja proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil. Protsess viiakse läbi kinnises süsteemis kolonnis, mis on täidetud pundunud geelikraanulitega, mille
Tallinna Tehnikaülikool Bioorgaanilise keemia õppetool 2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Tallinn 2013 2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Töö teoreetilised alused Geelkromatograafia ehk geelfiltratsioonkromatograafia on segu komponentide lahutamise ehk fraktsioneerimise meetod, mis põhineb aine molekulmassidel ja nende erineval jaotumisel liikuva ja liikumatu faasi vahel. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise , võimalikult ühesuguse poorsusega geeli. Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse (vastavalt molekuli suurusele).
Tiina Randla 20.02.2017 05.03.2017 arvestatud: 2.1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL Kromatograadia on segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva (mobiilse) ja liikumatu (statsionaarse) faasi vahel. Kromatograafilisi meetodeid kasutatakse laialdaselt amiohapete, valkude, süsivesikute jt ainete segude lahutamisel. Geelkromatograafia ehk geelfiltratsioonkromatograafia on üks kromatograafia meetoditest, mille põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine ehk fraktsioneerimine nende molekulmassi suuruse järgi. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks, kusjuures proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil
suurusega molekulid sisenevad osadesse pooridesse ja osadesse nad ei mahu ning nende retentsiooniaeg on suurte ja väikeste molekulide vahepealne eluent: pH < 9, peab lahustama analüüsitavaid aineid, detektor: HPLC detektorid Lahutamine põhineb molekulide suurusel; Statsionaarsel faasil on kontrollitud pooride suurus. Suuremad molekulid elueeruvadvarem, nad ei mahu täidise pooridesse; Kasutatakse valkude ja polümeeride molekulmasside määramisel. Geelfiltratsioonkromatograafia- liikuv faas vesi. Geelpermeatsioonkromatograafia- liikuv faas orgaaniline solvent
Statsionaarse faasina võib kasutada adsorbenti, ioniiti, biospetsiifilist sorbenti, poorset geeli või kandja pooridesse seotud vedelikku. Sõltuvalt statsionaarse faasi iseärasustest ja lahutatavate ainete ning faaside vahelistest vastasmõjudest eristatakse järgmisi kromatograafia liike: jaotuskromatograafia, adsorptsioonkromatograafia, afiinsuskromatograafia, ioonvahetuskromatograafia, geelkromatograafia. 2. Selgitage geelkromatograafia meetodi põhimõtet. Geelkromatograafia e geelfiltratsioonkromatograafia on üks kromatograafia meetoditest, mille põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine e fraktsioneerimine nende molekulmassi suuruse järgi. Meetodit tuntakse ka molekulaarselte, aga samuti eksklusioonkromatograafia nime all. Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide (bio- või tehispolümeerid) lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks, kusjuures proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil. 3
• Toite- ja varuvalgud – piima kaseiin, muna ovoalbumiin jt 10. Kromatograafia, elektroforees Kromatograafilised meetodid baseeruvad biomolekulide korduval selektiivses jaotumises kahefaasilises süsteemis. Kromatograafiat kasutatakse, et eraldada segunenud ained üksteisest. Siinkohal siis on vaja valgud eemaldada lahusest e rakuekstraktist. Ioonvahetuskromatograafia, õhukese kihi kromatograafia, pöördfaaskromatograafia, geelfiltratsioonkromatograafia. Geelelektroforeesi põhimõte – lahutamine poorses keskkonnas elektrivälja toimel. Kasutatavad polüakrüülamiid geel ja agaroos. Isoelektriline fokuseerimine. Biomolekulide detekteerimise meetodid geelis. Geel värvitakse valgu spetsiifilise värviga/spets antikehad. 11. Nukleotiidid Nukleiinhapped on biomakromolekulid, milles nukleotiidijäägid on seostunud fosfodiestersidemega. Inimkehas on kaks nukleiinhapet – DNA ja RNA. Nukleotiidid
· Toite- ja varuvalgud piima kaseiin, muna ovoalbumiin jt 10. Kromatograafia, elektroforees Kromatograafilised meetodid baseeruvad biomolekulide korduval selektiivses jaotumises kahefaasilises süsteemis. (1 seisev ja liikuvad faasid). Kromatograafiat kasutatakse, et eraldada segunenud ained üksteisest. Siinkohal siis on vaja valgud eemaldada lahusest e rakuekstraktist. Ioonvahetuskromatograafia (laeng), õhukese kihi kromatograafia, pöördfaaskromatograafia, geelfiltratsioonkromatograafia (valkude sadestumine suuruse järgi. Geelelektroforeesi põhimõte lahutamine poorses keskkonnas elektrivälja toimel. (1 aine liigub teiste suhtes, liikuma panev jõud- elekter). Kasutatavad polüakrüülamiid geel ja agaroos. Isoelektriline fokuseerimine. Biomolekulide detekteerimise meetodid geelis. Geel värvitakse valgu spetsiifilise värviga/spets antikehad. Geeli sisu peab olema aluseline, kõik valgud aluselises KK on neg. laenguga- ioonid liiguvad 11
Meetod baseerub segu komponentide erineval liikuvusel mobiilsest ja statsionaarsest faasist koosnevas süsteemis. Kromatograafilise ainete eraldamise eesmärgiks võib olla üksikute komponentide kättesaamine, et nendega midagi edasi teha (nt kasutada ravimi koosseisus). Sellist kromatograafiat nimetatakse preparatiivseks. Biomolekulide puhastamisel on kasutusel näiteks: · ioonvahetuskromatograafia · õhukese kihi kromatograafia · pöördfaaskromatograafia · geelfiltratsioonkromatograafia · afiinsuskromatograafia Elektroforees põhimõte: valkude lahutamine liikuvuse alusel poorses keskkonnas elektrivälja toimel. Osakese elektroforeetiline liikuvus elektriväljas sõltub elektrilisest potentsiaalist ja osakese summaarlaengust. Kuna erinevatel valkudel on samades tingimustes erinev summaarlaeng, lahutuvad nad elektriväljas. Levinum on tahkel kandjal toimuv tsonaalne elektroforees. 11. Nukleotiidid. Nukleotiidid on nukleiinhappe monomeerid
elektrilaengus (vt. eelmine peatükk). Siin liiguvad lahuses olevad valgud läbi poorse materjali (kandja, maatriksi, resiini), mis sisaldab kas positiivselt või negatiivselt laetud funktsionaalrühmi. Valgud, mis omavad resiiniga samamärgilist laengut resiiniga ei seondu ning liiguvad koos lahusega kolonnist välja. Resiini suhtes vastasmärgilise laenguga valgud seevastu jäävad materjali külge kinni ja kolonnist üldse välja ei tule. Nii on algsest valkude segust osa valke eemaldatud. Geelfiltratsioonkromatograafia- geelfiltratsioonkromatograafias lahutatakse valgud teineteisest suuruse ja kuju põhjal. Resiinina kasutatakse siin poorsetest terakestest (graanulitest) materjali, kusjuures terakeste sees olevad poorid ja kanalid moodustavad keeruka labürinditaolise struktuuri, kuhu teatud suurusest väiksemad molekulid ära eksivad. Väiksemad valgumolekulid mahuvad nende pooride ja kanalite sisse ning satuvad otsekui lõksu, kust ekseldes väljajõudmiseks kulub palju aega
antikehi Raku komponentide eraldamine tsentrifuugimise teel. Sade koguneb põhja,supernatant peale Raku komponentide eraldamine pideva ja astmelise tihedusgradiendi abil. Valkude kromatograafilise lahutamise kolme erineva viisi (ioonvahetus-, geelfiltratsioon- ja afiinsuskromatograafia) põhimõte. Ioonvahetuskromatograafia – positiivselt laetud kerakestele seostuvad negatiivselt laetud molekulid. Positiivselt laetud molekulid ei seostu ja tulevad kolonnist läbi. Geelfiltratsioonkromatograafia – väiksed molekulid takerduvad poorsetesse kerakestesse, suured läbivad kolonni vabalt. Afiinsuskromatograafia – keraksetega kovalentselt seotud molekulidele seostuvad neile spetsiifilised molekulid. SDS-polüakrüülamiidgeel elektroforeesi tööpõhimõte. Proov geelile, valgud liiguvad + poole, saab hinnata valkude suurust Valkude ülekanne SDS-polüakrüülamiidgeelilt membraanile ning nende tuvastamine antikehade abil.
NB! Spektrofotomeetriliselt mõõdetavad lahused peavad olema optiliselt selged. Lahuses olevad osakesed hajutavad osa valgusest ja nii osutub, et proov neelab tegelikust rohkem valgust. Hajutamise ulatus oleneb valguse lainepikkusest lühema lainepikkusega kiirgus on rohkem hajutatav. 45 2.1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL Teooria Geelkromatograafia e geelfiltratsioonkromatograafia on üks kromatograafia meetoditest, mille põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine e fraktsioneerimine nende molekulmassi suuruse järgi. Meetodit tuntakse ka molekulaarselte, aga samuti eksklusioonkromatograafia nime all. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide (bio- või tehispolümeerid)
annaabi.ee 
