Tõmbejõud FL=qE; (anoodi suunas) q - iooni laeng, E - elektrivälja tugevus E=U/l; U - pinge, l - kaugus elektroodide vahel. Tasakaaluolekus on mõlemad jõud võrdsed ja tingimusest FT=FL saab leida, et ioon hakkab liikuma kiirusega v=(q/6πηr)E Iooni liikuvus on seega μ=6πηr Affiinsuselekroforees Põhineb valdavalt makromolekulide biotseptsiifilistel interaktsioonidel ja komplekside moodustumisel, muutes molekuli elektroforeesseid omadusi. CE variandid: CZE, geelelektroforees ja isoelektriline fokuseerimine. Pinge 30 kV ja voolu 200 yA. Otsad sisend- ja väljundpuhvrite anumates Kapillaarisisene detekteerimine UV-detektoritega (ka MS, LIF, juhtivusdetektor). Lihtsaim KE vorm. Kapillaarile rakendatakse ühtlast pinget/voolu, ning selle pinge tulemusena lahutub sisestatud proov tsoonideks, lahutudes massi-laengu suhte alusel. KGE, kapillaar geelelektroforees - molekulaarsõela loomine, kasutades polümeerilahuseid. Võimaldab muidu massi-laengu suhte alusel
aminhappe C-terminaalsest otsast. Kümotrüpsiin lõikab aromaatsete kõrvalahelatega aminohapete juurest; trüpsiin positsiivset laengut kandvate aminohapete juurest. Spetsiifiline aktiivsus – ensüüm katalüüsib talle spetsiifilist reaktsiooni ja spetsiifiliste molekulidega?. Nt. eksonukleaasne aktiivsus, peptidaasne aktiivsus? Geelfiltratsioon Ioonvahetuskromatograafia Afiinsuskromatograafia SDS geelelektroforees – geelelektroforees naatrium dodetsüül sulfaadiga (Sodium Dodecyl Sulfate); SDS annab valkudele tugeva negatiivse laengu, mistõttu on elektroforeesil võimalik eristada valke vaid nende massi järgi. Tavalisel geelelektroforeesil eristuvad valgu massi ja laengu järgi – mida väiksem mass ja suurem laeng, seda kiiremini liiguvad geelis. Isoelektriline fokuseerimine – elektroforeesi geeli on moodustatud pH gradient; sellel geelil
Iga kultuuri puhul kasutatakse uut pipetiotsikut. Rep-PCR viiakse läbi eelnevalt valmistatud Mastermixi segu kasutades. Mastermixi segu jaotatakse PCR katsutitesse. Igasse katsutisse lisatakse 1 l kultuurisuspensiooni ja kontrollproovi pipeteeritakse 1 l MilliQ vett. Proovid tsentrifuugitakse ja asetatakse termotsüklerisse PCR reaktsiooni läbiviimiseks. PCR kestab tunde, seepärast jäetakse proovid üleöö reageerima ja järgmisel päeval viiakse läbi agaroos- geelelektroforees. Selleks valmistatakse geel, mille sisse tehakse süvendid proovide ja markerite jaoks. Geeli ühte auku kantakse 5 l proovi. Markerite jaoks mõeldud pesadesse pannakse 3 l markerit. Geeli voolutatakse 60 minutit. Seejärel visualiseeritakse UV laual ja tehakse foto. Uuritakse vöötkoode: kas ja kuivõrd on vöötide mustri alusel võimalik teha järeldusi mikroorganismide suguluse kohta. Püütakse tuvastada samasse liiki kuuluvate mikroorganismide tüvede vahelisi erinevusi.
Iga kultuuri puhul kasutatakse uut pipetiotsikut. Rep-PCR viiakse läbi eelnevalt valmistatud Mastermixi segu kasutades. Mastermixi segu jaotatakse PCR katsutitesse. Igasse katsutisse lisatakse 1 l kultuurisuspensiooni ja kontrollproovi pipeteeritakse 1 l MilliQ vett. Proovid tsentrifuugitakse ja asetatakse termotsüklerisse PCR reaktsiooni läbiviimiseks. PCR kestab tunde, seepärast jäetakse proovid üleöö reageerima ja järgmisel päeval viiakse läbi agaroos- geelelektroforees. Selleks valmistatakse geel, mille sisse tehakse süvendid proovide ja markerite jaoks. Geeli ühte auku kantakse 5 l proovi. Markerite jaoks mõeldud pesadesse pannakse 3 l markerit. Geeli voolutatakse 60 minutit. Seejärel visualiseeritakse UV laual ja tehakse foto. Uuritakse vöötkoode: kas ja kuivõrd on vöötide mustri alusel võimalik teha järeldusi mikroorganismide suguluse kohta. Püütakse tuvastada samasse liiki kuuluvate mikroorganismide tüvede vahelisi erinevusi.
- EOF ehk elektroosmootne liikuvus (electroosmotic flow), mis on tingitud kapillaari seina pinnalaengust, defineeritakse valemiga: ϵϚ - ν eo = E 4 πη - - KE erimenetlused – capillary zone electrophoresis, kasutatakse näiteks valkude ja peptiidide lahutamiseks ning võte töötab isegi juhul, kui erinevus lahutatavate ainete vahel seisneb vaid ühes aminohappes. Kapillaar geelelektroforees, geel surub alla EOF-i ning kasutatakse DNA lahutamiseks, kuna lahutamine toimub paremini kui mistahes teisel meetodil. Kasutatakse polüakrüülamiidgeeliga täidetud kapillaare. - Aparatuur - peamisteks osadeks on proov, alg- ja sihtpunkt viaalid/nõud, kapillaar, elektroodid, kõrgpingeallikas, detektor: - Sisestamise eriviisid - elektrokineetiline (analüüdilahus viiakse madalama juhtivusega lahusesse (madalam soola kontsentratsioon),
Purusta rakud, Lisa soolalahus, et DNA viia lahusesse, Lisa orgaaniline lahus (kloroform), et valgud ja rasvad eralduks. Tsentrifuugi ja eralda vesifaas. Lisa alkohol ja DNA sadestub välja Resttriktsiooniensüümid tunnevad ära konkreetsed kohad ja lõikavad DNA molekuli vaid sealt -Käärid. Lõikamismuster võimaldab võrrelda kahte taime ja leida ühisosasid või mutatsioone. PCR- polümeraasi ahelreaktsioon, võimaldab luua ühest DNA fragmendist tuhandeid koopiaid. (Kary Mullis). Geelelektroforees- Võimaldab eraldada DNA molekule suuruse järgi DNA on negatiivse laenguga ja seega liigub positiivse elektroodi poole. Mida suurem on DNA fragment, seda aeglasemalt see liigub geelis. Etiidium bromiid geelis võimaldab DNA värvida silmale nähtavaks (UV valguse all) Southern blot- Edwin Southern Testib, kas sisestatud geen on terve ja ühes tükis, õiges suunas ja koopia arvu. DNA kodeeriva
Ehk humoraalne immuunsus toimub B-lümfotsüüdide vahendusel. 44. Genoomika. Molekulaarbioloogia haru, mis tegeleb genoomide uurimisega. Kujunes välja 1980ndail aastail. 45. Transkriptoomika. Uurib geeni ekspressiooniprofiili (geenide aktiivsuse alusel) mikrokiiptehnoloogia abil, mis võimaldab uurida genoomi kõiki geene. 46. Proteoomika. Uurib valke, eriti nende struktuuri ja funktsioone. Üks meetod on ntks valkude kahedimensionaalne geelelektroforees DNA ja valkude lahutamine nende suuruse alusel. 47. Süsteemibioloogia. Bioloogia haru, mis püüab molekulaar-, raku-, organismi- ja teisi tasandeid integreerides mõista, kuidas bioloogilised süsteemid toimivad. 48. Funktsionaalne genoomika. Molekulaarbioloogia haru, mis püüab genoomide sekveneerimisest saadud andmeid geenide ja valkude funktsioonide ning interaktsioonide kohta muuta kasutatavateks. 49. Käitumisgenoomika
rakke – ainurakseid, baktereid, erütrotsüüte, spermatosoide, aga ka plastiide. Oli iseõppija, kellel oli piisavalt raha ja uudishimu. Embrüoloogilistelt vaadetelt animalkulist – arvas, et organism on valmiskujul spermatosoidi peas olemas. 4) 1862 – K.E.von Baer avastas imetaja munaraku ja järeldas, et organismi areng saab alguse munarakust. - Meetodid ja tehnikad: 1) Kloonimine 2) PCR 3) Geelelektroforees 4) DNA micro arrays e. kiibid 5) Alleelispetsiifiline PCR Rakuõpetuse etapid: 1) I etapp fikseerimata rakkude uurimine valgusmikroskoobis. Robert Hooke, Anthony van Leeuwenhoek, K.E.von Baer, Grew (taimede mikroehitus), Malpighi (loomade mikroehitust, võttis kasutusele koe mõiste), Purkinje (loomarakkudes tuumi), Brown (taimerakkude tuumi), Purkinje (protoplasma) Klassikalise rakuteooria teke 1930ndatel. 1838 -– M
- Selgitab kuidas geenid töötavad - Seosed geenide aju ja käitumise vahel Käitumisgenoomika Ülalt-alla lähenemine - Geenidelt käitumisele - Selgitab kuidas kogu organism käitub Mikrokiiptehnoloogia – võimaldab uurida genoomi kõiki geene - Transkriptoom: RNA süntees DNAlt - Geeni ekspressiooniprofiil – geenide aktiivsuse alusel Geneetiline genoomika - Uurib geene - QTLde avaldumine Valkude kahedimensionaalne geelelektroforees - DNA ja välkuda lahutamine nende suuruse alusel - Valkude posttranslatsiooniline modifikatsioon Aju - Sünapsid: miljardid neuronitevaheised ühendused, mis võimaldavad impulsil edasi kanduda - Neurogeneetika: enfogenotüübid, õppimine ja mälu, emotsioon Epigenoomika – geneetilise koodi käitumine ja epigeneetilised tunnused IX Loeng 1 Genoomika Tüübid
Tswett. Rakendatakse keemilises analüüsisja eriti puhastekeemiliste ühendite saamisel. 48.Elektroforees Makromolekulide separeerimine elektriväljas. Kolloidosakeste ja makroioonide liikumine elektrvälja mõjul katoodile(kataforees) või anoodile (anaforees). Seda põhjustab osakeste elekrilaeng, mis kolloidosakeste puhul tuleneb osakeste tuumadel absorbeerunud ioonidest. Elektroforees võib toimuda ka lahustiga immutatd kandmaterjalil- filterpaberil(paberelektroforees) või geelil(geelelektroforees). Elektroforeesi rakendatakse metallide pinnale kolloidosakestest kattekihi tekitamiseks, kõrgmolekulaarsete ühendite (nt valkude) segude analüütiliseks lahutamiseks, meditsiinis jms. 49. Nukleiinhapete hübridiseerimine. Kui segada üheahelalisi DNA või RNA järjestusi, millel on omavahel komplemen-taarseid järjestusi, siis need piirkonnad paarduvad vastavalt komplementaarsuse printsiibile, moodustades DNA-DNA või DNA-RNA kaksikheeliksi
meetoditega. Eesmärgi põhjal jagunevad kromatograafilised meetodid preparatiivseteks ja analüütilisteks. Preparatiivse kromatograafia korral on eesmärk saada teatud hulk lahutatud komponenti(te) edasiseks kasutamiseks. Seega on tegu kromatograafilise puhastamisega. Analüütilise kromatograafia korral kasutatakse oluliselt väiksemaid ainete koguseid (enamasti mikrogrammides) ja eesmärk on määrata komponentide suhteline sisaldus segus. 49. Elektroforees. Geelelektroforees on tänapäeval võimas rutiinne meetod erineva suuruse ja laenguga makromolekulide eraldamiseks. DNA molekulid on negatiivselt laetud ja liiguvad geelelektroforeesil elektroodilt + elektroodile. Kuivõrd DNA molekulidel on massist otsesõltuv laeng, siis sõltub nukleiinhapete liikuvus agaroos- ja polüamiidgeelis eelkõige nende suurusest. Need gelid on molekulaarseks sõelaks,
Näiteks ribotüpeerimise korral teostatakse bakteri kromosomaalse DNA restriktsioon, millele järgneb elektroforees ja Southern’ hübridisatsioon. Hübridisatsiooniks kasutatakse sonde, mis seostuvad ribosoome kodeerivate geenidega. Restriktsioonile järgneb elektroforees agaroosgeelis, mis võimaldab tekkinud DNA fragmentide eraldamise nende suurusest lähtudes. PFGE – PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS. Pulss-välja geelelektroforees on molekulaarsete tüpiseerimismeetodite standardiks. Terviklikest bakterirakkudest valmistakse nn. agarpunnid. Seejärel tehakse bakteri DNA-le restriktsioon. Elektroforees toimub pulseeriva elektrivälja tingimustes. PFGE võimaldab lahutada väga suure molekulmassiga DNA fragmente vahemikus 10 kb kuni 800 kb. Joonis 4. PFGE restriktsioonimustrid S.
Astmelise jälgimisega meetodid Pole võimalik otse reaktsiooni segust detekteerida signaale, vaja välja võtta ajapunkte. See, kui tihedalt punkte teha saab, see sõltub käte kiirusest, et kui kiiresti oled võimeline ajapunkte võtma. Iga ajapunkt tuleb analüüsida eraldi. Suhkrute puhul tuleb ntx teha läbi keemiline reaktisoon või tuleb kasutada abiensüüme mingi ajapunkti järel on vaja uuritav ensüüm ära tappa, produkti analüüsida jne. o Geelelektroforees igat ajapunkti peab eraldi analüüsima o Kromatograafia HPLC-ga. Vaja standardeid, kolonnid ja detektor vajavad kalibreerimist jne. o Radioaktiivne lagunemine tundlik. Võimalik otse jälgida (fosfri puhul), tavaliselt kasutatakse mingit kokteili, mis konverteerib radioaktiivse lagunemise valgus sähvatuseks. Spektrofotomeetria lahuse neelduvus mingil kindlal lainepikkusel. . Lahus on küvettis,
annaabi.ee 
