oleks võimalik DNA lõikamist restriktaasiga selleks, et sinna ehitada huvipakkuva DNA järjestust. 3. Võrdle omavahel järgnevate E.Coli ensüümide omadusi. DNA polümeraas I Klenow fragment Sequenase Taq polümeraas 5' 3' DNA-sõltuv polümeraasne aktiivsus DNA polümeraasi ,,mutantne" vorm. 5' (on vaja praimeri) 3' polümeraasne aktiivsus. 3' 5' eksonukleaasne aktiivsus (DNA parandamine) DNA sünteesil 5' 3' Tömbi otste Kasutatakse Kasutatakse eksonukleaasne saamiseks. peamiselt peamiselt PCR- aktiivsus 5' 3' sekveneerimisel. 3' reaktsioonides. 3' eksonukleaasne 5' eksonukleaasne 5' eksonukleaasne
III ja ja ei 1020 ·Polümeraas I ja III replikatsioon 5' 3' ·Polümeraas II roll ei ole päris selge ·3' 5' eksonukleaas = võime nukleotiide eemaldada 3' otsast ·Oluline korrektuuri lugemises ( proofreading) ·Ilma selleta vigade määr (mutatsioonid) 1 x 106 ·Koos korrektuuriga 1 x 109 (1000kordne efekt) ·5' 3' eksonukleaasne aktiivsus replikatsiooni repareerimises Replikatsiooni algus (prokarüoodil): Algab kaksikahela denaturatsioonist, nii saab alguse lämmastikalauste ekspositsioon Replikatsioon kahes suunas ~245 bp E. coli Initsiatsioon: Üheahelalisi DNA lõike nimetatakse matriitsideks Güraas on ensüüm (topoisomeraas), mis vabastab superspiralisatsiooni
geeniekspressiooni reguleerimiseks. Heterokromatiin kondenseerunud ka mitooside vahel. Heterokromatiin konstitutiivne ja fakultatiivne Fakultatiivne heterokromatiin - võimaldab rakkudes teatud eluetappidel teatud geene maha suruda Konstitutiivne heterokromatiin - asub alati samas kohas ja mõlemal paariskromosoomil (tsentromeeride piirkonnas, on inaktiivne läbi rakutsükli) mRNA poolestusaeg - aeg, mille jooksul laguneb ½ rakus olevast mRNA-st eksonukleaasne lõikamine endonukleaasne lõikamine lõhutakse molekulisisesed sidemed deadenüleerimine - poly-A järjestus lüheneb chaperonid abistavad valgu pakkimisel
1. Bakterirakus leiduvad polümeraasid: ! Replikatsiooni viivad läbi DNA polümeraasid (erinevad eri ahelatel). Replikatsioonijärgne parandamine: polümeraasid. Valepaardumiste eemaldamiseks: DNA polümeraas III – lisab nukleotiide sünteesitava ahela 3’ otsa; suudab eemaldada viimase DNA-le lisatud nukleotiidi (eksonukleaasne aktiivsus) st valesti lisatud nukleotiid eemaldatakse ning asendatakse õigega: DNA üks parandusmehhanisme bakteris. Pärast vea eemaldamist replikatsioon jätkub. DNA polümeraas I – aeglasem, aga tal on nii 3’ 5’ kui ka 5’ 3’ eksonukleaasne aktiivsus; Replikatsiooni käigus tunneb ära RNA praimeri ja asendab selle desoksüribonukleotiididega; Parandab vead, mida ei suutnud parandada DNA polümeraas III
eraldatakse ükshaaval aminohappeid ... (?) Kümotrüpsiin ja trüpsiin – proteolüütilised valgud, mis lõikavad peptiidsidet spetsiifilise aminhappe C-terminaalsest otsast. Kümotrüpsiin lõikab aromaatsete kõrvalahelatega aminohapete juurest; trüpsiin positsiivset laengut kandvate aminohapete juurest. Spetsiifiline aktiivsus – ensüüm katalüüsib talle spetsiifilist reaktsiooni ja spetsiifiliste molekulidega?. Nt. eksonukleaasne aktiivsus, peptidaasne aktiivsus? Geelfiltratsioon Ioonvahetuskromatograafia Afiinsuskromatograafia SDS geelelektroforees – geelelektroforees naatrium dodetsüül sulfaadiga (Sodium Dodecyl Sulfate); SDS annab valkudele tugeva negatiivse laengu, mistõttu on elektroforeesil võimalik eristada valke vaid nende massi järgi. Tavalisel geelelektroforeesil eristuvad valgu massi ja laengu järgi – mida väiksem mass ja suurem laeng, seda kiiremini liiguvad geelis.
SSBP (single-strand binding protein)- seondub üheahelalisele DNA-le, hoides ära selle kaheahelaliseks muutumist. DNA replikatsiooni näol on tegemist väga täpse mehhanismiga. Nimelt, uurimuste kohaselt teeb tehakse miljon aluspaari liitmise kohta ainult üks viga, kuigi reaalselt võiks see arv olla palju suurem. Nimelt on DNA polümeraasil peale sünteesimisaktiivsuse ka ingliskeelse terminiga väljendatud aktiivsus ehk proofreading. Vigade parandamiseks on DNA polümeraasil 3´-5´ eksonukleaasne aktiivsus. Bakterirakus on kolm DNA polümeraasi- DNA polümeraas I, II ja III. Polümeraasid I ja II. DNA polümeraas III on põhiline DNA replikatsooni ensüüm. Imetajarakkudes on vähemalt 5 erinevat polümeraasi- , , , ja , ja töötavad koos ning on seotud tuuma DNA replikatsiooniga. polümeraasi ülesandeks on mitokondriaalse DNA replikatsioon. ja osalevad aga tuuma DNA reparatsioonil. http://oak.cats.ohiou.edu/~ballardh/pbio475/Heredity/DNA-replication.JPG Funktsioon
suguline kui mittesugu´line paljunemine): Pärmid (Saccharomyces cerevisiae); Rohevetikas (Chlamydomonas reinhardtii); Leivahallitus (Neurospora crassa). Geeni konversioon: Väga lähedaste geenide korral võib toimuda mitte vastastikune vahetus. Seda nimetataksegi geeni konversiooniks. Esineb kui tetraadsete gameetide genotüübid on 3:1 või 1:3 aga mitte 4:4, 2:4:2, or 2:2:2:2. Selle põhjuseks on vale paardumine rekombineerumise käigus. Mis hiljem repareeritakse (eksonukleaasne eksisioon ja siilimine DNA polümeraasiga). Mitootiline rekombineerumine: Väga harva aga vahel siiski on CO ka mitoosis ehk som. Rakus. Esmalt kirjeldas Curt Stern (1936) heterosügootsel Drosophila'l kellel oli suguliitelised mutatsioonid kollase kehavärvuse määramiseks (y+/y) ja keerdunud karvadele (sn/sn+). Kuna oli toimunud mitootiline ristsiire saime ühel isendil kaks fenotüüpi (mosaiik). Seletada saab häirega kromosoomide lahknemises, kuid kuna mosaiiksed piirkonnad on alati
Restriktaasid - rõngasmolekulist lineaarse vormi tagasi moodustumine alusspetsiifilise endonukleaasi toimel. Eksonukleaasid- eemaldavad nukleotiide DNA ahela otsast (lagundavad nukleiinhappe ahelat kas 5' või 3' otsast (5'eksonukleaasid ja 3'eksonukleaasid) Endonukleaasid- atakeerivad ja võtavad ära nukleotiide DNA ahela seest. 94. DNA polümeraas I omadused. Kornbergi polümeraas. 1) sünteesisuund 5'-3' (info loetakse matriitsahelast suunaga 3'-5') 2) 5'-3' eksonukleaasne aktiivsus. On reparatsiooniline polümeraas, kuna selle abil parandatakse ja korrigeeritakse geneetilise info paljundamisel, rekombinatsioonil ja mujal tekkivaid vigu. 95. DNA polümeraas III. Escherichia coli replikaas. Poolkonservatiivne süntees. Holoensüüm (katalüütiline südamik), 3 alaüksust, 900 000 daltonit, sisaldab vähemalt 20 erinevat polüpeptiidi. Tal on 2 beeta subühikute monomeeri, beeta subühikute dimeer moodustab ringi ümber DNA. 96
initsiaator valkude seondumise tulemusena. Ori regioonid on alati A-T rikkad. 51. Erinevate DNA polümeraaside funktsioonid bakterites. Mis mehhanismidega on tagatud DNA replikatsiooni täpsus? Põhiliseks DNA replikatsiooni läbiviivaks valguks on DNA polümeraas Pol III. V- kujuline, sisaldab 2 apoensüümi. Apoensüümi moodustavad subühikud a, e ja q. Epsilon subühik on vastutav DNA replikatsiooni täpsuse eest tal on 3'-5' eksonukleaasne aktiivsus, mis võimaldab valesti DNA ahelasse lülitatud nukleotiide kõrvaldada. On ka beeta-dimeerid, mis suurendavad polümeraasi kiirust u 37 korda klamber, mis ei lase DNA polümeraasil DNA-lt dissotseeruda. Ka on Pol I ja Pol II DNA reparatsioon, Pol I ka Okazaki fragmentide protsessimiseks. Ka on Pol IV ja V seotud vigaderohke DNA sünteesiga olukorras, kus DNA
tühimikud täidab DNA polümeraas ja eri fragmendid ühendab fosfodiestersidemega DNA ligaas). Lisaks osalevad ensüümid, mis ületavad DNA replikatsiooni käigus tekkivad ruumilised takistused. Üksikahelalist DNA-d stabiliseerivad valgud. Topoisomeraasid teevad DNA ahelatesse ajutisi auke ja katkeid. DNA sünteesi katalüüsib DNA polümeraas. DNA polümeraasi kopeerimisvigade arvu vähendab ensüümi 3´-5 ´eksonukleaasne aktiivsus, mis eemaldab mittepaardunud nukleotiidi. Reparatsioon ehk vigade parandus on ahelapõhine. 25.Geen ja genoom. DNA järjestuse lõik, funktsionaalne ühik, mis kodeerib valku või struktuurset, katalüütilist või regulatoorset RNAd (regulatoorsed järjestused ja kodeeriv ala; kodeeriv ala eukarüootidel koosneb eksonitest ja nitronitest). Genoom on antud liigi täielik geenikogum. 26.Transkriptsioon. Ehk RNA süntees. Toimub 5´-3´suunal
- Eukromatiin – lahtipaktud kromatiin(geenid ekspresseerunud) Heterokromatiin – kokkupakitud (geenid vaigistunud) Histoonid - Aluselised valgud - Reguleerib kromatiini struktuuri ja geenide aktiivsust. 24. DNA replikatsioon Replikatsioon algab spetsiifilistelt genoomi lõikudelt, mida kutsutakse originideks. - DNA polümeraas katalüüsib replikatsiooni. DNA polümeraasi kopeerimisvigade hulka vähendab ensüümi 3’-5’ eksonukleaasne aktiivsus, mis eemaldab mittepaardunud nukleotiidi. sünteesib suunas 5’-3’ vajab vaba 3’OH otsa omab ühtlasi 3’-5’ eksonukleaasset aktiivsust - 3’OH tuleb RNA praimerist, mille sünteesib DNA primaas - Juhtahel sünteesitakse pidevana, mahajääv ahel Okazaki fragmentidena RNaseH lagundab RNA, tühimikud täidab DNA polümeraas ja eri fragmendid ühendab
- Eukromatiin lahtipaktud kromatiin(geenid ekspresseerunud) Heterokromatiin kokkupakitud (geenid vaigistunud) Histoonid - Aluselised valgud - Reguleerib kromatiini struktuuri ja geenide aktiivsust. 24. DNA replikatsioon Replikatsioon algab spetsiifilistelt genoomi lõikudelt, mida kutsutakse originideks. - DNA polümeraas katalüüsib replikatsiooni. DNA polümeraasi kopeerimisvigade hulka vähendab ensüümi 3'-5' eksonukleaasne aktiivsus, mis eemaldab mittepaardunud nukleotiidi. sünteesib suunas 5'-3' vajab vaba 3'OH otsa omab ühtlasi 3'-5' eksonukleaasset aktiivsust - 3'OH tuleb RNA praimerist, mille sünteesib DNA primaas - Juhtahel sünteesitakse pidevana, mahajääv ahel Okazaki fragmentidena RNaseH lagundab RNA, tühimikud täidab DNA polümeraas ja eri fragmendid ühendab fosfodiestersidemega DNA ligaas
IV ja V sünteesivad vigaderohket DNAd olukorras, kus DNA Pol III poolt läbiviidav replikatsioon on blokeerunud algse DNA kahjustuse pärast. IV ja V puudub vigu korrigeeriv aktiivsus. · DNA pol III ensüümikompleks on V-kujuline ja sisaldab kahte apoensüümi. Apoensüümi moodustavad subühikud , ja . Subühik vastutab polümeraasse aktiivsuse eest, vastutab DNA replikatsiooni täpsuse eest tal on 3' -> 5' eksonukleaasne aktiivsus, mis võimaldab kõrvaldada valesti DNA ahelasse lülitatud nukleotiide. 52. DNA replikatsioon juhtivalt ja mahajäävalt ahelalt. · DNA süntees toimub vaid 5' -> 3' suunaliselt. Samas pikendatakse replikatsioonikahvlis mõlemat DNA ahelat. Juhtiv ahel DNA süntees toimub järjepidevalt 5' -> 3' suunaliselt. Vajab praimerit vaid replikatsiooni alguspunktis.
Järgneb praimeri süntees primaasi DnaG poolt DNA polümeraas III moodustab replikatsioonikahvli 51. Erinevate DNA polümeraaside funktsioonid bakterites. Mis mehhanismidega on tagatud DNA replikatsiooni täpsus? Bakteritel on lisaks DNA polümeraasidele I ja III veel vähemalt 3 DNA polümeraasi: Pol I ja Pol II: DNA reparatsioonilised polümeraasid. Lisaks 5' 3' polümeraassele aktiivsusele on Pol I ka 5' 3' ja 3´ 5' eksonukleaasne aktiivsus DNA Pol I osaleb DNA sünteesil mahajäävalt ahelalt, kus see toimub Okazaki fragmentidena, asendades seal RNA praimerid DNA-ga DNA güraas (topoisomeraas II) on tetrameerne valk, mis koosneb kahest subühikust. DNA güraasi on vaja E. coli DNA replikatsioonil vähendamaks replikatsioonikahvli ees tekkivat positiivset superspiralisatsiooni Pol III: põhiline DNA replikatsiooni läbiviija.
perkloorhappe lisamisega) ning mõõdeti radioaktiivsust DNA sademes ja supernatandis. Radioaktiivne märge oli nii supernatandis kui ka DNA sademes. Kuna nukleotiidid antud tingimustes sadeneda ei saanud, näitasid katsetulemused radioaktiivselt märgistatud nukleotiidide lülitumist DNA ahelasse, seega DNA sünteesi toimumist. Lisaks 5' 3' polümeraassele aktiivsusele on Pol I-el ka 5' 3' ja 3´ 5' eksonukleaasne aktiivsus. DNA polümeraas I deletsioonvarianti, millel puudub 5' 3' eksonukleaasne aktiivsus, nimetatakse Klenowi fragmendiks. E. coli DNA polümeraas III DNA polümeraas III on põhiline bakteri DNA replikatsioonil osalev ensüüm Ta koosneb mitmetest subühikutest. Multiensüümkompleks on V-kujuline, sisaldab 2 apoensüümi. Ülejäänud subühikutes on erinevusi. Apoensüümi moodustavad subühikud , ja . Kuna DNA replikatsioon saab toimuda ainult ühes suunas, 5' 3' suunaliselt, replikatsioonikahvlis toimub süntees aga mõlemalt ahelalt korraga, on teine ahel
perkloorhappe lisamisega) ning mõõdeti radioaktiivsust DNA sademes ja supernatandis. Radioaktiivne märge oli nii supernatandis kui ka DNA sademes. Kuna nukleotiidid antud tingimustes sadeneda ei saanud, näitasid katsetulemused radioaktiivselt märgistatud nukleotiidide lülitumist DNA ahelasse, seega DNA sünteesi toimumist. Lisaks 5' 3' polümeraassele aktiivsusele on Pol I-el ka 5' 3' ja 3´ 5' eksonukleaasne aktiivsus. DNA polümeraas I deletsioonvarianti, millel puudub 5' 3' eksonukleaasne aktiivsus, nimetatakse Klenowi fragmendiks. E. coli DNA polümeraas III DNA polümeraas III on põhiline bakteri DNA replikatsioonil osalev ensüüm Ta koosneb mitmetest subühikutest. Multiensüümkompleks on V-kujuline, sisaldab 2 apoensüümi. Ülejäänud subühikutes on erinevusi. Apoensüümi moodustavad subühikud , ja . Kuna DNA replikatsioon saab toimuda ainult ühes suunas, 5' 3' suunaliselt, replikatsioonikahvlis toimub süntees aga mõlemalt ahelalt korraga, on teine ahel
sünteesitavat mahajäävat ahelat. DNA sünteesil tekib vigu sagedusega on 10-4 kuni 10-6 lülitatava nukleotiidi kohta. Selleks, et geneetilise materjali reprodutseerimise käigus ei toimuks vigade kuhjumist, on DNA polümeraasil korrigeeriv aktiivsus, mille tulemusena ensüümi töö täpsus tõuseb mitu suurusjärku (vigade teke sagedusega 10 -8). DNA polümeraas III subühik e (epsilon) vastutab DNA replikatsiooni täpsuse eest, tal on 3' ® 5' eksonukleaasne aktiivsus, mis võimaldab valesti DNA ahelasse lülitatud nukleotiidid kõrvaldada (annab DNA polümeraasile "proofreading" aktiivsuse e korrigeeriva aktiivsuse). Eukarüootse kromosoomi replikatsioon. Enamus informatsiooni DNA replikatsiooni kohta on saadud E. coli ja tema viiruste replikatsiooni uuringutest. Eukarüootse DNA replikatsiooni kohta on vähem teavet, kuid ka selle põhjal võib öelda, et nii eukarüoodi kui ka prokarüoodi DNA replikatsiooni põhimehhanismid on samad
üksikahelaline või kaksikahelaline katke. Toimub rekombinatsiooniline reparatsioon RecF, RecO ja RecR osalusel. RecA soodustab DNA ahelate ülekannet, aitab neil paarduda ning osaleb DNA ahelate hargnemiskoha migratsioonil. Juhul, kui DNA-s on tekkinud kaksikahelaline katke, on lisaks RecA valgule vajalik RecBCD osalemine. RecBCD kompleksil on helikaasne aktiivsus, mis ilmneb dsDNA katke korral. Helikaasse aktiivsusega kaasneb ka eksonukleaasne aktiivsus, mis avaldub seni, kuni kompleks jõuab Chi saidini (asümeetriline 8-nukleotiidne järjestus) ning seal toimib RecBCD endonukleaasina. Chi sait inaktiveerib RecBCD eksonukleaasse aktiivsuse ning edasi käitub RecBCD kompleks ainult kui helikaas. RecA valgu abil moodustub dupleks homoloogilise alaga. Tekib "Holliday" struktuur kus DNA ahelad on risti. Kuna "Holliday" riststruktuur liigub helikaaside RuvA ja RuvB toimel edasi, võivad moodustuda dupleksid uuesti sünteesitud
sünteesitav DNA ahel linguna replikatsioonikahvlis. -kompleks võimaldab ensüümikompleksi liikumist valmissünteesitud Okazaki fragmendi otsast järgmise praimeri 3' OH otsa. Mutatsioonisagedus Okazaki fragmentidena sünteesitavas DNA ahelas on 20 korda suurem kui pidevalt sünteesitavas ahelas ensüümkompleks liigub kahjustustest kõrgema sagedusega üle. DNA polümeraas III subühik (epsilon) vastutab DNA replikatsiooni täpsuse eest, tal on 3' 5' eksonukleaasne aktiivsus, mis võimaldab valesti DNA ahelasse lülitatud nukleotiidid kõrvaldada (tagab DNA polümeraasi ,,korrigeeriva" (proofreading) aktiivsuse). -klambriga (-subühikute dimeer, mis paikneb ümber DNA; ingl. k. -clamp) seondumine suurendab polümeraasi protsessiivsust 20 nt/sek kuni 750 nt/sek. -klambriga on võimelised seonduma kõik 5 DNA polümeraasi ning -klambriga seondumise kaudu reguleeritakse erinevate DNA polümeraaside osalemist DNA sünteesil. Rakutsükkel
4) Pol IV – reparatsioon, aukude täitmine (1 polüpeptiid) 5) Pol V – aukude täitmine (3 polüpeptiidi) Polümeraasid on seotud ka nukleotiidide lagundamisega. Pol IV ja V on erilised. Rnaas H – eemaldab koos Pol I-ga RNA praimeri, see on kaheetapiline protsess. Rnaas H lagundab. Jätab viimased RNA nukleotiidid alles, sest need on nii DNA lähedal. Mõlemad praimeri otsad jäävad alles. Otsad eemaldab DNA polümeraas I, sest tal on tugev eksonukleaasne aktiivsus, st lõikab nukleotiide ahela otsast. Polümeraas III on peamine replikatsiooni polümeraas. Eksisteerib kahes vormis. Koensüüm – 3 peptiidi; polüensüüm – 9 peptiidi. Üksi paljudab bakteri DNA-d. Polümeraasid IV ja V on ebatäpsed (aga see-ees oskavad mõningaid raskeid kohti ületada). Kasutatakse DNA reparatsioonidel. Polümeraas V – stressiensüüm nt bakter on näljas. Eukarüootide DNA polümeraasid: 1) Pol-α – 4 polüpeptiidi, primaas e
annaabi.ee 
