Biofilmid ja meditsiin (0)

TARTU ÜLIKOOL
MOLEKULAAR - JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT
BIOTEHNOLOOGIA ÕPPETOOL
Biofilmid ja meditsiin
Referaat
Leidi Laurimaa
bioloogia 3. aasta
Tartu 2009

Sisukord

Sisukord 2
Sissejuhatus 3
Miks bakterid moodustavad biofilme? 4
Biofilmi moodustumine 5
Biofilmi moodustumiseks vajalikud geenid 6
Biofilmi laialihajumine 6
Biofilmid kui infektsioonide põhjustajad 7
Tehispindade infektsioonid 8
Infektsioosne endokardiit 8
Tsüstilise fibroosi põhjustatud kopsupõletik 9
Kokkuvõte 11
Kasutatud kirjandus 12

Sissejuhatus

Biofilm – ekstratsellulaarsest polüsahhariidsest maatriksist moodustunud kiht tahketel pindadel, mille sees elavad mikroorganismid . Biofilmi võivad moodustada mitmest liigist pärit ainuraksed mikroorganismid. Esimesed biofilmid on leitud süvamere termide lähedusest, mis on dateeritud 3,25 miljardit aastat vanaks . Biofilmi on võimelised moodustama nii arhed kui ka bakterid. See tõestab, et biofilmi moodustamine on iidne osa prokarüootide elutsüklist ning omab suurt tähtsust bakterite ellujäämises erinevates keskkonnatingimustes. Biofilm kaitsebki rakke vaenuliku keskkonnategurite eest ning aitab neil levida ja uusi nišše kasutusele võtta. Bakterid on võimelised selliseid kihte moodustama nii tehismaterjalile kui ka bioloogilistele pindadele , põhjustades sellega mitmeid tervisehädasid inimestele.
Näide biofilmist – hambakatt.

Miks bakterid moodustavad biofilme?

Biofilmid pole lihtsalt passiivsed bakterite kogumid, vaid on struktuurselt ja dünaamiliselt keerukad bioloogilised süsteemid. Bakterid saavad kooseksisteerides rohkem kasu kui eraldi. Biofilmid pakuvad rakkudele kaitset mitmesuguste kahjulike keskkonnatingimuste eest nagu näiteks UV-kiirgus, toksilised metallid, happed , dehüdratsioon, soolsus , fagotsütoos ning mitmed antibiootikumid .
Välja on toodud kolm mehhanismi, miks biofilmid on resistentsed biotsiidsetele agentidele:

Maatriksi limal on tõkestavad omadused. Antimikroobsed agendid neutraliseeritakse või seotakse EPS1`i poolt ning lahjendatakse mitteletaalse kontsentratsioonini enne, kui need jõuavad üksikute rakkudeni biofilmi sees. Selline barjäär kaitseb ka UV-kiirguse ja dehüdratsiooni eest.

Biofilmi füsioloogiline seisund. Kuigi paljud antibiootikumid tungivad läbi EPS`i, on biofilmi sisesed rakud siiski kaitstud. Resistentsus seisneb selles, et biofilmis moodustuvad näljased, statsionaarses faasis uinunud rakkude piirkonnad.

Resistentsete fenotüüpidega alampopulatsioonide esinemine.

Biofilmi moodustumine

Uuringud Pseudomonas aeruginosa’ga näitavad, et biofilmi moodustamise saab jagada viide etappi . Esimeses ja teises etapis seonduvad rakud nõrgalt või lühiajaliselt pinnaga, millele järgneb lõplik adhesioon . Kolmandas ja neljandas etapis rakud agregeeruvad mikrokolooniateks ning jätkavad kasvu. Viiendat etappi iseloomustab lühiajaline liikuvus, kui osa rakke vabaneb. Ka teistel liikidel on täheldatud sarnast arenguetapilist jaotust, nt Escerichia coli ning Vibrio cholerae.
Kiire vooluga veekogus moodustavad bakterid niitjaid (filamentseid) biofilme (Joonis A). Vaikse vooluga vees moodustuvad seene- või kuhjakujulised biofilmid (Joonised B, C).
A
B
C

Biofilmi moodustumiseks vajalikud geenid

Biofilmi moodustumise eest vastutavad geenid tehti kindlaks, kasutades juhuslikku transposooni mutageneesi ja knock-out mutante. Katsetes võrreldi mutantset tüve metsiktüüpi bakteriga. Biofilmi moodustumiseks vajalike geenide alla kuuluvad pinna adhesioonivalkude, pilide ja flagelliinide ning ekstratsellulaarse polümeerse maatriksi komponentide ekspressiooni reguleerivad geenid. Jõuti järeldusele, et kui mingist spetsiifilisest geenist tehi knock-out mutant, sel juhul biofilmi moodustumist ei hoitud täielikult ära, vaid biofilmi moodustamine ainult vähenes.

Biofilmi laialihajumine

Tavaliselt keskendutakse laboris rakkude pindadele kinnitumise ja biofilmi kasvu uurimisele. Vähem tähelepanu pühendatakse rakkude eraldumisele biofilmist ja nende laialihajumisele. Rakkude eraldumist põhjustavad välised häiringud nagu näiteks voolukiiruse suurenemine või biofilmi sisemised protsessid nagu näiteks endogeenne ensümaatiline degradatsioon ja EPS’de eraldumine.
Eristatakse kolme biofilmi hajumise strateegiat:

swarming/seeding – üksikud rakud eralduvad mikrokolooniast. Sellist strateegiat on kirjeldatud Pseudomonas aeruginosa’l. Peale esialgset biofilmi kasvu mikrokolooniad diferentseeruvad välimiseks „seinaks“ ja sisemine regioon muutub vedelaks. Sisemine vedel regioon võimaldab liikuvatel rakkudel mikrokolooniast välja „ ujuda “, jättes selle seest õõnsaks.

clumping – rakkude agregaadid eralduvad klombina. Agregaadid koosnevad EPS’ga ümbritsetud biofilmi rakkudest. Sellist strateegiat kasutab inimese patogeen Staphylococcus aureus .

surface – biofilmi struktuurid liiguvad mööda pinda. Laboratoorselt on uuritud P. aeruginosa’t ja mitmest liigist koosnevad biofilme. On täheldatud, et need biofilmid suudavad liikuda kiirusega kuni 1 mm/h.
Lisaks nendele strateegiatele on leitud, et S. aureus’e mikrokolooniad võivad rulluda piki klaastoru luumenit (in vitro keskveeni kateetri mudel). Täheldati, et S. aureus moodustab klaasi pinnale viskoos-elastseid sidemeid . Need sidemed venivad kuni katkemiseni kaugemal äärel, mis võimaldab mikrokoloonial edasi rulluda ning uusi sidemeid moodustada.

Biofilmid kui infektsioonide põhjustajad

Mikroorganismid, mis kasvavad agregaatidena maatriksi sees, on resistentsemad antibiootikumidele ja peremehe kaitsereaktsioonidele. Biofilmide põhjustatud infektsioone iseloomustab – patogeensed bakterid on substraadile kinnitunud; bakterid asetsevad kobaras koos, ümbritsetuna bakteriaalsest maatriksist või peremehe koostisosadest ; infektsioon on lokaalne ; infektsioon on resistentne antibiootikumi teraapiale, vaatamata sellele, et planktonilised rakud on antibiootikumidele resistentsed.
Joonis. Kolm varianti , mille kaudu nakkuslikud biofilmid võivad kehasse tungida : kateeter, puusaliigese protees ja periodontiit.

Tehispindade infektsioonid

Intravenoossed kateetrid, kunstlikud südameklapid, liigeste proteesid , kõhukelme dialüüsi kateetrid, südamestimulaatorid, tserebrospinaal vedeliku šundid, endotrahheaalsed torud – kõik need päästavad miljoneid elusid, kuid kõigile on omane pindmiste infektsioonide teke. Tihtipeale seostatakse meditsiiniliste vahenditega just stafülokokke (iseäranis S. epidermidis ja S. aureus), millele järgnevad P. aeruginosa ja teiste oportunistlike bakterite vohamine. Biofilmi moodustumist meditsiinilistele implantaatidele nimetatakse ka krooniliseks polümeerseks infektsiooniks (chronic polymer-associated infection). Biofilmi moodustumist võib seega võtta kui virulentsusfaktorit.
Kõige paremini iseloomustab stafülokokkide infektsiooni suur hulk EPS’i (nimetatakse ka limaks), mis ümbritseb ning ühtlasi ka kaitseb rakke peremehe kaitsereaktsioonide ja antibiootikumide eest. Stafülokokkide biofilmi moodustamine jagatakse kahte etappi: adhesioon ja rakukobarate kasvamine kihtidena. S. epidermidis’e puhul moodustuvad rakukihid tänu rakk - rakk adhesiooni mehhanismidele, mis on seotud polüsahhariid intertsellulaarse adhesiiniga (PIA). Maatriksi polüsahhariidsete valkude sünteesi reguleerib ica geeni lookus S. epidermidis’es. Mutatsioonid selles lookused takistavad biofilmi moodustumist, lõhkudes rakkude agregaadid. Adhesiooni faas sõltub nii meditsiinilise polümeeri füüsikalis-keemilistest omadustest kui ka bakteriraku pinna omadustest. Näiteks materjali hüdrofoobsus ja elektrostaatiline laeng mõjutavad polümeeri ja bakteriraku pinna vastastikust toimet.
On leitud mitmeid tähtsaid valke, mis on olulised stafülokokkidel biofilmi moodustamiseks. S. epidermidis’e kleepumist polüstüreenile vahendab peamine autolüsiin, AtlE . AtlE mutant ei suuda moodustada biofilme polüstüreenile, kuid saab seonduda klaaspindadele. See valk vahendab ka seondumist vitronektiinile, peremehe ekstratsellulaarse maatriksi komponendile.
Bakteriraku pinnal on palju spetsiifilisi retseptoreid, adhesiine, mis soenduvad peremehe molekulidega. Paljud nendest kuuluvad MSCRAMMs (microbial surface components that recognize adhesive matrix molecules) valkude perekonda. Fibronektiiniga seonduvat adhesiini seostatakse kõige enam bakterite kinnitumisel pindadele. Fibronektiinile järgnevad fibrinogeen /fibriin, kollageen , laminiin ja vitronektiin. S. aureus’el on leitud kaks fibronektiini adhesiini – FnBPA ja FnBPB.
Bakterid moodustavad biofilme paranevates või põletikulistes haavades, kasutades peremehe valke ära. See viitab bakteriaalsete adhesiinide mehhanismile, mille puhul peremees koloniseeritakse elujõulistes kuid kahjustatud kudedes.

Infektsioosne endokardiit

Üle poole endokardiidi juhtumitest on põhjustatud streptokokkide poolt, veerand juhtumitest stafülokokkide poolt. Paljud neist bakteritüvedest kasvavad ka loomulikult inimese nahal ja suuõõnes. Endokardiiti põhjustavad bakterirakkude, vereliistakute ja fibriini agregaadid, mis kinnituvad kahjustatud südameklapi epiteelile. Lisaks endoteeli kahjustustele ja turbulentsele verevoolule stimuleerivad põletikulised protsessid vere hüübivust, fibriini ladestumist ning fibriinist ja liistakutest moodustuva lahustumatu klombi teket. Vohavad haiguskolded on eriti pudedad ja suurendavad veresoonte topistuse riski, mis võib põhjustada infarkte.
Katsed Streptococcus sanguis’ega näitavad, et see bakter on võimeline kinnituma juba 30 minuti jooksul peale süstimist jänestesse, kellele oli paigaldatud kateeter. Nelja nädala pärast oli näha, et streptokokid olid elujõulised, kuid nende ümber oli moodustunud lubjastunud kiht, mida omakorda ümbritsesid fibroblastid . Aja jooksul haiguskolle kasvas suuremaks : lisandusid fibriini ja vereliistakuid sisaldavad kihid , mille vahale jäi bakterikolooniaid sisaldav kiht. Kui jänesele määrati antikoagulante, isegi siis moodustusid bakterikolooniad. Järelikult ei ole klompide moodustumine vajalik, et tekiks endokardiit. Nendel jänestel, kes said antikoagulante, oli raskem haiguse kulg ning nad surid kiiremini. Nendel jänestel, kes ei saanud antikoagulante, muutus haigus subakuutseks, krooniliseks infektsiooniks ning olid allumatud antibiootikumi ravile .
Võrreldi erinevaid streptokoki liike oma kinnitumise poolest südameklappidele. Leiti, et need tüved, mis toodavad glükaane ja dekstraane sisaldavat EPS’i, suudavad paremini kahjustatud südameklappidele kinnituda. Streptococcus parasanguis’elt, kes normaalselt koloniseerib inimese hambaid, kuid võib põhjustada ka endokardiiti, leiti geen (fap1), mis soodustab biofilmi moodustumist plastikule. Selle geeni mutant ei suutnud nii hästi seonduda, kuid ta ei suutnud ka agregaate ja mikrokolooniaid moodustada.

Tsüstilise fibroosi põhjustatud kopsupõletik

Tsüstiline fibroos on autosomaalne retsessiivne haigus, mis põhjustab elektrolüütide sekretsiooni ja absorbtsiooni väärtalitlusi. Selle haiguse puhul esineb organismis kõikide sekreetide viskoossuse tõus, millele järgneb näärmete juhade ummistumine ning see omakorda põhjustab kudedes haiguslike muutuste (õõned, sidekoestumine) teket. Iseloomulik on kroonilise obstruktiivse, hingamisteid ahendava kopsuhaiguse esinemine ning seedeensüümide puudulik tootmine kõhunäärme poolt.
Alumiste hingamisteede koloniseerimine tsüstilise fibroosi haigetel algab imikueas ja varases lapsepõlves, toimudes peamiselt S. aureus’e ja Haemophilus influenzae poolt. Teismelise eas ja varases täiskasvanueas asendub teiste bakterite koloniseerimine kroonilise infektsiooniga P. aeruginosa poolt. Mikroskoopilised analüüsid tsüstilise fibroosi haigete rögast näitavad, et P. aeruginosa moodustab biofilmisarnaseid struktuure, mis koosnevad kobaras olevatest bakteritest, ümbritsetud tihke maatriksiga. Homoseriinlaktooni quorum sensing’u signaalid haigete rögas on kooskõlas quorum sensing’u profiiliga P. aeruginosa biofilmis kasvavate isenditega. Algselt haigete kopsust isoleeritud P. aeruginosa on mitte-mukoosne. Mukoossed isolaadid esinevad kroonilise infektsiooni korral. Uuringud näitavad, et peremehe põletikuline vastus soodustab infektsiooni muutumist mukoosseks.
P. aeruginosa täpne tsüstilise fibroosi haige kopsu koloniseerimise mehhanism on teadmata. Ühe hüpoteesi kohaselt põhjustab koloniseerimist hingamisteede põletik, mille tagajärjel tekivad paljad epiteelirakud , kuhu bakterid kinnituvad. Teine hüpoteetiline mehhanism on seotud hapnikuvaese mukoosse kihiga . P. aeruginosa vastab sellisele anaeroobsele keskkonnale alginaatide sünteesiga.

Kokkuvõte

Nõustutakse selles, et biofilmid on looduslikes keskkondades üldlevinud, kuid arutletakse alles nende tähtsuse üle nakkushaiguste põhjustajatena. Samuti on raske biofilmi põhjustatud haiguste vastu võidelda, sest tihtilugu on biofilmid antibiootikumidele resistentsed (seda tänu oma heterogeensusele ning määramata kasvuparameetritele). Biofilmid esitavad väljakutse mikrobioloogidele – välja mõelda asjakohasemad testimise protokollid, et tegeleda tähelepanuväärsete probleemidega tööstuses ja meditsiinis.

Kasutatud kirjandus

Hall-Stoodley, L.,Costerton, J.W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases . Nature Reviews. Microbiol. 2, 95-108 (2004).
[2009]. http://www.biofilm.montana.edu/CBEssentials-SW/bf-basics-99/bbasics-01.ht m
[2008]. http://inimene.ee/?disease=t&sisu=disease&did=785
1 EPS – ekstratsellulaarne polümeerne substants; polümeerid, mis on biofilmi moodustavate rakkude poolt keskkonda väljutatud
12