Eukarüoodi transkriptsiooni initsiatsioon: on keerulisem kui prokarüoodil, RNA polümeraas ei tunne otseselt ära promootor-järjestust, selleks on vajalikud transkriptsioonifaktorid, mis kinnituvad esmalt promootorjärjestusele ja seejärel saab seonduda alles polümeraas. Koos moodustavad nad transkriptsiooni initsiatsiooni kompleksi. · TBP sõltuv initsiatsioon selline initsitatsioon sisaldab promootorjärjestuses TATA-boxi, TBP on sellele seonduv TFIID alaühik. See on esimene valk, mis nö istub TATA-box alale. Järgneb TFIIB seondumine promootorile. TFIIB interakteerub kahel pool TATA-boxi TBP ja DNAga, samas kui tema N-terminaalne ots stabiliseerib tekkinhd interaktsiooni. Järgneb TFIIF ja RNA-pol II seondumine. (Hiljem peavad lisanduma ka TFIIF ja TFIIH). · TBP sõltumatu initsiatsioon sellises initsitatsioonis ei ole TATA-box ala promootrjärjestuses ning ei ole TBP
mis interakteerub teiste valkudega, et stimuleerida transkriptsiooni lähedaloleva promootori juurest. Kui N-terminaalne DNA-siduv domään siduda erinevate C-terminaalsete osade külge, siis tema funktsioon säilib. Kompleksid kas moodustuvad või ei moodustu. 5. Missugused TAFid on TBPga vahetus interaktsioonis? TBPga seonduvad TFIIB, TFIIA TBP is a subunit of the eukaryotic transcription factor TFIID. 6. Missugune TFII valk hüdrolüüsib ATPd ja mis protsessiga on tegu? ATPd hüdrolüüsib helikaasse aktiivsusega TFIIH, mis kasutab ATP hüdrolüüsi energiat selleks, et DNA dupleks startsaidis lahti kerida. 7. Võrdle transkriptsiooni initsitatsiooni protsesse prokarüootidel ja eukarüoo-tidel. Prokarüoodid toimuvad tsütoplasmas. *RNA polümeraasi holoensüümi (2 , ß, ß', ) seondumine DNA promootorpiirkonda
Viimase tulemusena paiguldub RNAPolII START-saidile. Enamuse promootorite puhul peab kompleksile siduma veel kaks GTFi, et DNA ahelad saaks eralduda ja toimuks matriitsahel vabanemine. Esimesena seondub tetrameerne TFIIE, mis tekitab sidumisvõimaluse TFIIHle. Sellest piisab in vitro, et RNAPolII initsieeriks transkriptsiooni. In vivo on lisaks vaja ka TFIIA aktiivsust, mis seondub TBP ja TATA-box kompleksile. Arvatakse, et kõrgemtas eukarüootides seonduvad TFIIA ja TFIID (TFIID kompleksi koosseisus olevad TAFid (TBP assotseeruvad faktorid) on arvatavalt vajalikud mitte-TATA-box-järjestusega promootoritelt) esmalt TATA-box'le ning alles siis toimub ülejäänud GTF'de seondumine kompleksile. 8. Kas transkriptsioonifaktorid (aktivaatorid) interakteeruvad otse(vahetult) TBPga? Ei tea, mida siin mõeldakse, aga in vitro transkriptsioonifaktorid liituvad kindlas järjekorras. S.t et on vaja ühe faktori eelnevat sidumist, et järgmine saaks seonduda
kaupa. Kõigepealt asetab RNA primaas RNA praimeri ning DNA pol III jätkab järjestuse kodeerimist nii mitu korda seejärel DNA Pol I asendab praimerid ja DNA ligaas ühendab fragmendid. Transkriptsioon- RNA tegemine DNAlt. Selles osalevad DNA, Tfid, RNA polümeraas ja ATP. Transkriptsiooniks on vaja DNA lõiku, mis koosneb osadest ( transkriptsiooni ühik ehk ala mida transkribeeritakse, sellest ülavoolu asub TATAbox ja enhanser). Edukaks transkriptsiooniks on vaja mõndasid TF´eid. Suurim TFIID sisaldades omakorda TBP (tata binding protein) mille kaudu kogu kompleks istub DNA transkriptsiooni initsiatsiooni saidile kasutadeski selleks TATAboxi. Seejärel lisanduvad teised TF, eeskätt TFIIB luues võimaluse POLII seondumiseks, mis omakorda aktiveeritakse TFIIF poolt- moodustub preinitsiatsiooni kompleks. Sellele seondub TFIIE luues võimaluse TFIIH seondumiseks.. TFIIH põimib kaksikahela lahti ja annab polümeraasile võimaluse mööda matriitsahelat liikuma hakata
– Sageli on TATA-järjestusest 5’-suunas CAAT ja GC järjestused RNA polümeraas TATA seonduva valgu ja üldiste transkriptsiooni faktoritega TATA- järjestus on oluline transkriptsiooni alguse (initsiatsiooni) jaoks • Transkriptsiooniks on vajalikud nn. Üldised transkriptsioonifaktorid. Neid on mitu ja enamasti neid märgitakse TFIIA, TFIIB jne • Oluline valk transkriptsiooni algatamiseks on TATA-seonduv valk TBP, mis on osa TFIID kompleksist, ning seejärel TFIIA ja TFIIB • TATA-box on paljude geenid promootoralas, sageli ca 25-35 nt algussaidist • Peale RNA polümeraasi seondumist kompleksiga vabanevad üldised transkriptsioonifaktorid ja RNA polümeraas fosforüleeritakse ning algab RNA süntees Oluline osa geenide regulatsioonis on enhaanseritel Enhaanseralade kasutamine (ja geenide aktivatsioon) sõltub rakus olevatest spetsiifilistest transkriptsioonifaktoritest
nukleotiidiga. Kuna pribnow box'i ala on A : T paaride rikas, on seal kergem ahelaid denatureerida. Transkriptsiooni alguspunkt on tähistatud ühega pürimidiinalustest, kas T või C-ga. Initsiatsioon eukarüootidel: siin osalevad teatavad promootorpiirkonna elemendid, kuhu seonduvad transkriptsioonifaktorid ja mis osalevad ka regulatsioonil. Promootori elemendid: TATA, CAAT ja GC box'id. Peale transkriptsioonifaktorite seondumist promootorile, millest tähtsaim on TATA-box'i seonduv valk TFIID ehk TATA-seonduv valk, seondub trans- faktoritele omakorda RNA polümeraas ja initsieerib RNA sünteesi. Milline RNA polümeraas tööle hakkab, sõltub sellest, mida transkribeeritakse. ,,Enhancer" võimendavad järjestused, mis stimuleerivad transkriptsiooni ja mida vajatakse geeni maksimaalseks transkriptsiooniks. Initsiatsiooni lõpuks moodustavad trans-faktorid, TATA-box, ,,enhancer" seondunud valk ja RNA polümeraas koos transkriptsiooni initsiatsiooni kompleksi. 3
Samuti on bakteril mRNA sisaldab mite valgu järjestusi, eukarüoodil sisaldab üldiselt ainutl ühe valgukohta infot. Eukarüoodi 5' G---CH3. lisatud on metüül rühm cap. 10. Transkriptsiooni alustamine RNA polümeraas II toimel eukarüoodi rakus. * Nimeta üldised transkriptsioonifaktorid Eukarüootides on olemas oluline klass transkriptsioonifaktoreid, mida nimetatakse üldisteks transkriptsioonifaktoriteks (GTF) Kõige tavalisemad GTF-id on TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF 1. Nad aitavad paigutada eukarüootide RNA polümeraasi täpselt promootorile. 2. Nad aitavad DNA ahelaid teineteisest lahti tõmmata, selleks et transkriptsioon saaks alata. 3. Nad aitavad vabastada RNA polümeraasi promootori küljest, selleks et viia transkriptsioon n.ö. pikendamise (ingl.k. elongation) etappi. * Mis on TBP funktsioon initisiatsiooni kompleksi tekkes? TBP on DNA ahela neljanukleotiidine järjestus Promootorist 25 nukleotiidi eespool
täpselt promootorile. 2. Nad aitavad DNA ahelaid teineteisest lahti tõmmata, selleks et transkriptsioon saaks alata. 3. Nad aitavad vabastada RNA polümeraasi promootori küljest, selleks et viia transkriptsioon n.ö. pikendamise (ingl.k. elongation) etappi. TBP seondub TATA boxile – võimaldab TFIID-l seostuda TATA-le saab seostuda TFIIB seepärast seostub kogu transkriptsioonifaktorite hunnik ja RNA polümeraas promootorpiirkonnale; üks neist kasutab ATP hüdrolüüsi energiat, et DNA kaksikheeliksisse siseneda 😉 42. Transkriptsiooni alustamine RNA polümeraas II toimel eukarüoodi rakus:
Samuti ei vaja PBCV-1 replikatsioon fotosünteesi toimumist. Siiski sõltub viiruse replikatsiooni efektiivsus peremeesraku seisundist. Varajane infektsioon. Rakku sisenenud DNA ja sellega seondunud valgud transporditakse kiiresti rakutuuma, varajane transkriptsioon algab 5-10 minutit peale infektsiooni. Selle viib läbi raku RNA polümeraas (oma RNA polümeraasi pole). Küll aga on olemas transkriptsiooni reguleerivad valgud, sh. basaalsete transkriptsioonifaktorite homoloogid (TFIIB, TFIID, TFIIS). Osad (mitte basaalsed) transkriptsioonifaktorid on pakitud ka virionidesse. PBCV-1 kodeerib ka RNAd modifitseerivaid ensüüme (cap-sünteesi ensüümid RNA TP ja GT). Promooteri moodustab järjestus, mis asub transkriptsiooni algus-saidi suhtes -150 kuni +50 b vahel. Enne DNA sünteesi ekspresseerub 227 geeni (neist 127 geeni ekspressioon lõpeb enne DNA replikatsiooni algust) PBCV-1 transkriptsiooni kohta on teada et:
9. Joonista tüüpilise RNA Pol II promootori struktuur ja kirjelda faktoreid, mis sinna transkriptsiooni initsiatsiooni käigus seovad. Seostuvad transkriptsioonifaktorid, mis on vajalikud transkriptsiooni toimumiseks, näiteks RNA Pol II sidumiseks start-saiti, enhancer'ite ja muude regulatsioonielementide seondumiseks, aga ka aktivaatorid ja repressorid. Generaalsed TFd paigutavad RNA Pol II start-saidile ja osalevad initsiatsioonis. TATAboxi siduv TFIID seob oma TATAbox siduva alaühiku, TBP, kaudu. Kui Pol II jätkab transkriptsiooni startsaidist edasi, siis üks TFHII alaühikutest fosforüülib CTD. 10. Transkriptsiooni repressorid ja aktivaatorid. Transkriptsioooni faktorite modulaarne struktuur. Paindlik selles mõttes, et üks või enam transkriptsiooni aktivatsiooni domeeni on seotud järjestus-spetsiifilise DNAd siduva domeeniga linkeralade abil, seetõttu
Spermatogeneesi erijoonid. Sertoli rakkude mõjul. Embüonaalsed eellasrakud on pärast paljunemisfaasi mitoosiarestis kuni puberteetideni. Meioosi käivitab retinoolhape. Tüvirakud, rakkude pidev uurimine. Inimes testistes on 1000 spermi sekundis. Eriline terminaalne diferentseerumine spermatosoidiks. Spermatosoidid: kompaktne tuum, kompaktne DNA, tagavad protamiinid histoonideasemel; minimaalne tsütoplasma, viibur liikumiseks, peas - tuum ja akrosoom; RNA polümeraas II TFIID kopleks sisaldab spermi-spetsiifilisi komponente; küpsis spermis on transkriptsioon peatunud. Viljastumine. Protsee kus sperm ja munarakk liituvad,et luua uus indiviid kelle genoom pärineb mõlemast vanemast. Kaks põhieesmärki: vanemate geneetilise materjali siidramine järglastesse; munaraku aktiveerimine järgnevaks arenguks.Viljastamise etapid: sperma liikumine munarakkuni (spermi kapatatsioon); spermi tungimine läbi mnaraku kestade
Peamine regulatsioon. 3) Pol III – transkribeerib 5S rRNA geene, tRNA geene ja sno geene (väikesed tuumageenide osad) RNA polümeraas II Olulised järjestused: - - 2 … + 4 → heksameerne startsait CCAxxxTCC ⁞ komplementaarne TTAxxxATT - - 31 … - 26 → TATA BOX → TBP valk (TATA binding protein). TATATATA… - - 37 … - 32 →BRE → TFIIB valk, enne TATA BOX-i - +28 … + 32 → DPE (ja Inr) → TFIID valk, on transkriptsiooniühiku ees, et polümeraas saaks transkriptsiooni alustada - Need elemendid ei pea kõik korraga olemas olema, need olid vastavate piirkondade transkriptsioonifaktorid. TF – transkriptsiooni faktor; II → käib 55 kokku RNA polümeraas II-ga. B- RNA polümeraas II B. - prokarüootidel on ≈ 400 promootorit, eukarüootidel ≈ 20 000
domääniga, mille tulemusena moodustub kompleks, mis aktiveerib nende geenide promootoreid, mis sisaldavad tuuma-retseptori sidumissaiti. 23. Mis on sidumissait? ja mille poolest ta a)sarnaneb, b)erineb TATAbox-st? Sidumissait on ala DNA-l, millele transkriptsioonifaktor seondub. Mõlemad on transkriptsioonifaktorite sidumisalad. TATA-box esineb eukarüootides, sidumissait on ka prokarüootides; TATAbox-ile seondub TBP (mõni TAF ka; TFIID kompleks), konkreetne järjestus; sidumissaitidel on erinevad järjestused, mistõttu võib neile seonduda ka erinevaid transkriptsioonifaktoreid. 24. Nimeta peamised DNAd siduvad domäänid, mis on iseloomulikud transkriptsioonifaktoritele (vähemalt 3) · Tsink-sõrm-valgud. Paljudel eukarüootsetel valkudel on struktuursed alad, mis voltuvad ümber Zn2+ iooni, nii et suhteliselt lühikesest polüpeptiidahelast tekib kompaktne domään. Seda struktuuri nim.
Enne nende transporti tsütoplasmasse neis 3 tüüpi: 1. 5'-otsa 7-metüülguanosiin müts. 2. 3'-otsa lisatkse polü(A) saba 3. Kui olemas, siis intronid lõigatakse pre-mRNA-st välja RNA on algselt kaetud RNA-seoseliste valkudega (kaitse nukleaaside eest). Eukarüootse geeni transkripti poolestusaeg 5 tundi, prokarüootidel 5 minutit. 114. RNA ahela initsiatsioon eukarüootidel. Cis-toimelised järjestused. Vajalikud põhilised transkriptsioonifaktorid, TFIIX. Esimesena TFIID, sisaldab TATA-seonduvat valku ja rida TBP-assotsieerunud valke. Järgnevalt TFIIA ja kohe TFIIB. Järgnevalt TFIIF, seondub polümeraasiga ning moodustab seejärel transkriptsiooni initsiatsioonikompleksi. Tal 2 alaüksust, milledest ühel DNA-d lahtikeerav aktiivsus. TFIIE, TFIIH, TFIIJ jne. DNA pol I ja pol III analoogsete faktoridega, teatud eripäradega Cis-toimelised järjestused - regulatoorsed järjestused, mis avaldavad môju samas DNA molekulis olevale geenile. 115
lncRNA-d - Pikad mittekodeerivad RNA-d, paljud neist toimivad kui tellingud; nad reguleerivad mitmeid erinevaid protsesse rakus, k.a. X-kromosoomi inaktivatsioon . DNA struktuuris oleva TATA-kasti ja promootori piirkonna roll DNA transkriptsiooni läbiviimises. Eukarüoodi DNA transkriptsiooniks vajaliku valkude kompleksi põhilised komponendid. TATA box- DNA ahela neljanukleotiidne järjestus, millele kinnitub TBP valk,mis on transkriptsioonifaktori TFIID koosesisus. Transkriptsioonifaktorid: TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIH (käitub nagu helikaas), TFIIF Promootor- Spetsiifiline järjestus millele kinnitub RNA polümeraas II Enchancer-akivaatorvalk, mis on vajalik transkriptsiooni alustamises, kinntiub mediaatorile CTD- Rna polümeraasi c-terinaalne doeen, RNA polümeraasi saba fosforüülitakse ja ta erladub promootorilt ning jätkab RNA ahela pikedamist. Fosforüülimise tagajärjelt seostuvad
GGGCGG. Eri kombinatsioonid eri geenide promootorites. RNA peab olema lõpetatud molekul, muidu ta ei ole stabiilne. Lõppu pandakse mitte... järjestused. RNA polümeraas II Transkriptsioonifaktor sama mis sigma prokarüoodil;kõik RNA polümeraasid vajavad. TFid on valgud, mis formeeruvad promootori basaalelemendil. Iga TF töötab vaid oma RNA polümeraasiga, iga polümeraas nõuab TF'i. Märgitakse vastavalt polümeraasile TFIID, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH. RNA polümeraas + TF kompleksi nimetatakse preinitsiatsioonikompleksiks. Transkriptsiooni aktiveerib enhancer järjestus DNA-l. mRNA erinevused pro- ja eukarüootidel: Prokarüoodid : mRNA transkript on kohe selline, millel algab translatsioon. Kuna proakrüoodil puudub tuum, siis translatsioon algab kohe kui algab transkriptsioon (protsessid on üheaegsed), toimub muidugi ribosoomil. mRNAs on polüstistroonne: sisaldab mitmelt geenilt transkribeeritud mRNAd
Tavalisemad struktuurid: 1) Heeliks-pööre-heeliks 2) Tsinksõrm- metalliaatom valgu sees (raua-aatom hemoglobiinis) 3) Leutsiinizipper 4) Heeliks-ling-heeliks 45. Kirjelda eukarüootse geeni promootorit ja selle osasid. Enhaanser. Promootor on DNA järjestus, mis on võimeline algatama transkriptsiooni. Inimese genoomi tähtsaimaks promooterjärjestuseks on TATA-kast (TATAAA järjestus). Oluline valk transkriptsiooni algatamiseks on TATA-seonduv valk TBP, mis on osa TFIID kompleksist, ning seejärel TFIIA ja TFIIB. TATA järjestus asub transkriptsiooni alguskohast umbes 30 nukleotiidi eemal. Sageli on TATA-järjestusest 5’-suunas CAAT ja GC järjestused. Peale RNA polümeraasi seondumist kompleksiga vabanevad üldised transkriptsioonifaktorid ja RNA polümeraas fosforüleeritakse ning algab RNA süntees. Lisaks sellele seonduvad promootoriga ka regulaatorvalgud, mille DNA järjestused paiknevad promootorist veel kaugemal
keskmiselt 30 nukleotiidi kaugusel. Järgmine konserveerunud element CAAT konsensusjärjestusega GGCCAATCT asub kaugusel 80 nukleotiidi transkriptsiooni alguspunktist. Lisaks on promootoralas sageli veel GC element konsensusega GGGCGG ja oktameerne järjestus konsensusega ATTTGCAT. Basaalseid transkriptsioonifaktoreid tähistatakse TFIIX (transcription factor for polymerase II), kus X-I asemel on täht, mis eristatab individuaalseid transkriptsioonifaktoreid. Esmalt seondub promootorile TFIID, millesse kuuluvad TATA-elemendiga seonduv valk TBP (TATA-binding protein) ja mitu väikest TBP-ga assotsieerunud valke. Seejärel lisanduvad TFIIA ja TFIIB. TFIIF assotsieerub esmalt RNA polümeraasiga ja järgnevalt liituvad TFIIF ja RNA polümeraas II teiste valkudega, moodustades transkriptsiooni initsiatsiooni kompleksi. DNA ahelate lahtikeerdumine transkriptsiooni initsiatsioonikohas toimub TFIIF abil. RNA ahela elongatsioon
keskmiselt 30 nukleotiidi kaugusel. Järgmine konserveerunud element CAAT konsensusjärjestusega GGCCAATCT asub kaugusel 80 nukleotiidi transkriptsiooni alguspunktist. Lisaks on promootoralas sageli veel GC element konsensusega GGGCGG ja oktameerne järjestus konsensusega ATTTGCAT. Basaalseid transkriptsioonifaktoreid tähistatakse TFIIX (transcription factor for polymerase II), kus X-I asemel on täht, mis eristatab individuaalseid transkriptsioonifaktoreid. Esmalt seondub promootorile TFIID, millesse kuuluvad TATA-elemendiga seonduv valk TBP (TATA-binding protein) ja mitu väikest TBP-ga assotsieerunud valke. Seejärel lisanduvad TFIIA ja TFIIB. TFIIF assotsieerub esmalt RNA polümeraasiga ja järgnevalt liituvad TFIIF ja RNA polümeraas II teiste valkudega, moodustades transkriptsiooni initsiatsiooni kompleksi. DNA ahelate lahtikeerdumine transkriptsiooni initsiatsioonikohas toimub TFIIF abil. RNA ahela elongatsioon
annaabi.ee 
