Meetod seisneb kindlate mRNA-molekulide blokeerimises või kiires lammutamises niinimetatud mikro- RNA-de kaudu, mille tulemusena geen ei avaldu ehk valgusünteesi ei saa toimuda. 2006. aastal said Andrew Fire ja Craig Mello Nobeli preemia füsioloogias ja meditsiinis esmaselt 1998.aastal avaldatud töö eest Nature ajakirjas . Fire ja Mello avastasid RNA interferentsi. RNA interferentsis on kahte tüüpi RNA molekule – mikroRNA ja siRNA . Need eelnimetatud väiksed RNA-d võivad seonduda teistele RNA-dele , tõstes või alandades nende aktiivsust, näiteks seondudes mRNA-le, takistavad nad sellelt toimuva translatsiooni ehk valgusünteesi. RNAi rada leidub paljudes eukarüootides, kaasa arvatud kõrgemates hulkraksetes loomades , ning mida alustab ensüüm Dicer. Dicer lõikab pika kaheahelalise RNA ehk dsRNA molekulid väiksemateks umbes 20 nukleotiidi pikkusteks fragmentideks, mida nimetataksegi siRNA-ks.
· neid tegevusi ei tehta munarakuga , need e pärandu järglastele edasi · on kohati häid tulemusi kui enamjaolt mitte · sarnaneb transgeeniga-sama liigi geene siirdatakse · geeniravi sõltub puude olemusest ravi mis on seotud vererakkudega(olemas kogu aeg üvirakud teisel juhul vajalik ka koespetsiifiline promootor- keeruline immuunpuudulikkuse ravi oli 1990.a suhteliselt edukas Parkinsoni tõve ravi ajutiliselt geenivaigistamiseks kasutatakse mikroRNA molekule. kui mikroRNA -d ühinevad mRNA-ga siis viimane lagundatakse nii saaks ravida huntingtoni haigust Geenivaigistamine on täiesti uus suund muud rakendused geenitehnoloogiale 1. molekulaargeneetiline diagnostika · enamasti põhineb mutantsete geenide äratundmisel · DNA-kiibid võrdlus DNA lõigud, millega patsiendi geene kõrvutada- saab tuvastada haigusi ja siis vastavalt määrata ravi
· Ei pärandu järglastele Geeravi · Normaalselt talitleva geeni siirdamine raske geneetilise puudega inimese mingi koe rakkudesse 1. Haige luuüdi eraldatakase tüvirakud 2. Koekultuuris sisestatakse neisse normaalgeen geenivektori (kullapüstol, viirus jne) abil 3. Rakud kloonitakse ja plajundatakse 4. Rakud siiratakse tagasi haige koesse · Mutantse geeni avaldumise vaigistamine ehk geenivaigistuse meetod 1. MikroRNA abil blokeeritakse valgusüntees (stop- koodon) 2. Geen ei saa avalduda ·
Geenitehnoloogia valitud Geenitehnoloogia valitud DNA DNA lõikude eraldamine, lõikude eraldamine, töötlemine in töötlemine in vitro ja vitro ja siirdamine sama või muu siirdamine sama või muu liigi liigi isendi geneetilisse struktuuri- isendi geneetilisse struktuuri kromosoomi, plasmiidi või kromosoomi, plasmiidi või viirusesse(geenide ülekanne). viirusesse(geenide ülekanne). Rekombinantne DNA DNA Rekombinantne DNA DNA molekul, milles on ühendatud molekul, milles on ühendatud eri eri liikidelt pärit DNA osad. liikidelt pärit DNA osad. Rakkudesse viiakse võõraid Rakkudesse viiakse võõraid geene viirusvektori abil, plasmiidse geenivektoriga, geene viirusvektori abil, Agrob...
Transpordi-RNA (tRNA) on väike RNA ahel, mis kannab kindlaid aminohappeid ribosoomi valgusünteesi aktiivtsentrisse, kus aminohapped liidetakse kasvavale polüpeptiidahelale. tRNA-l on piirkonnad aminohapete seondumiseks ja antikoodonregioon koodonite äratundmiseks mRNA ahelal snRNA-d - Väiksed tuuma RNA-d, osalevad paljudes tuumas toimuvates protsessides, k.a. pre-mRNA splaissing snoRNA-d - Väiksed tuumakese RNA-d, mis aitavad töödelda ja keemiliselt muuta rRNA-sid miRNA-d - MikroRNA-d, reguleerivad geeniekspressiooni blokeerides spetsiifiliste mRNA-de translatsiooni ja põhjustavad nende lagundamist siRNA-d - Väiksed segavad RNA-d, lülitavad välja geeniekspressiooni juhtides mRNA-de lagundamist ja moodustades kompaktse kromatiini struktuuri piRNA-d - Piwi-ga seostuvad RNA-d, seostuvad piwi valkudega ja kaitsevad sugurakke transposoonsete elementide eest lncRNA-d - Pikad mittekodeerivad RNA-d, paljud neist toimivad kui tellingud; nad
box’ile. • “capping” on struktuur maatriks RNA 5’-otsas. • Poly(A) on suure hulga adenosiinmonofosfaadi jääkide kinnitamise protsess primaatse mRNA 3’-otsa külge. • Splaising on protsess, mille käigus lõigatakse rakutuumas asuvast RNA molekulist välja intronjärjestused ning allesjäänud otsad ühendatakse. • RNAi on süsteem elavates rakkudes, mis osaleb geeniaktiivsuste määramisel. • miRNA on mikroRNA, üheahelaline RNA molekul 21-23 nukleotiidi pikkune. Peamine funktsioon: geeni regulaator. • siRNA on silencingRNA – 2ahelalilised RNA molekulid, 20-25 nukleotiidi pikkused. • RNA editing - RNA järjestuse redigeerimine. Protsess, mille tagajärjel muudetakse pre-mRNA järjestust. ApoB geen mis kodeerib kahte alternatiivset seerumvalku apoB100 ja apoB48. Uus nukleotiid, uus aminohape, tekib teistsugune valk. Osata joonistada:
b. Proteoom organismis sisalduvate valkude kogum (muutub pidevalt erinevalt genoomist). c. Transkriptoom rakkude poolt toodetud mRNA hulk. d. Reguloom rakus olevate regulatsioonikomponentide hulk (geenid, mRNA..). 43. Loetle kõik tuumakeses sünteesitavad RNA tüübid. Missugused ensüümid neid RNAsid transkribeerivad? a. rRNA PolI 44. Mis vahe on miRNAl ja siRNAl? a. miRNA mikroRNA, üheahelaline RNA molekul 21-23 nukleotiidi pikkune. Peamine funkt.: Geeni regulaator. b. siRNA silencingRNA 2ahelalilised RNA molekulid, 20-25 nukleotiidi pikkused. c. Peamine funkts.: geenide vaigistamine, seondub inaktiivsele nukleaasi kompleksile, mis aktiveerub ja moodustub RNA indutseeritud vaigistus, kompleksi RISC.
paneb translatsiooni seisma kui signaali ära tunneb, viib ribosoomi kasvava peptiidiga ER-i juurde, kompleks eemaldub ning ribosoom laseb kasvava peptiidi otse ER-i. RNAi RNAi üldiseloomustus : komponendid, mehhanism, tagajärjed RNA interferents on süsteem elavates rakkudes, mis osaleb geeniaktiivsuste määramisel. RNA interferentsiks on olulised kaks tüüpi väikeseid RNA molekule: mikroRNA (miRNA) ja väike interfereeriv RNA (siRNA). Väikesed RNA-d võivad seonduda teistele RNA-dele, tõstes või alandades nende aktiivsust (nt seondudes mRNA-le, takistavad nad sellest toimuva translatsiooni. RNA interferentsil on oluline roll rakkude kaitses parasiitsete geenide vastu, organismi arengu suunamises ja geeniekspressioonis üldiselt. Dicer ja Argonaute : nende valkude funktsioon, olulisemad domeenid ja toimemehhanism
Näide: diabeet ( kõhunääre ei sünteesi insuliini) GEENRAVI · Normaalselt talitleva geeni siirdamine raske geneetilise puudega inimese mingi koe rakkudesse: a) Haige luuüdist eraldatakse tüvirakud b) Koekultuuris sisestatakse neisse normaalgeen geenivektori abil c) Rakud kloonitakse ja paljundatakse d) Rakud siiratakse tagasi haige koesse · Mutantse geeni avaldumise vaigistamine ehk geenivaigistuse meetod: a) MikroRNA abil blokeeritakse valgusüntees b) Geen ei saa avalduda Pärilike haiguste molekulaargeneetiline diagnostika · Mutantsete geenide äratundmine DNA proovide abil · DNA-kiibid võrdlus DNA-lõigud, millega patsiendi geene kõrvutada · Rinnavähk, tsüstiline fibroos(limanäärmed), sirprakuline aneemia(vererakud on sirbikujulised), kurtus, Huntingtoni tõbi(pärilik haigus- ajus on muutused, ei suuda kontrollida oma lihastegevust, vaimne
kromosoomides v.a. 22 ja Y. Paiknevad klastritena. Üle poole asub 6. kromosoomi 4Mb sees. Teiste RNA-de geenid: Umbes 100 snRNA geeni. Väga T rikkad. Osalevad splaisosoomide moodustamisel. Geenid klastritena. Mõned esinevad multikoopiatena (U6 snRNA jaoks 44 geeni), Umbes 100 snoRNA geeni. Osalevad teiste RNA molekulide modifitseerimisel. Kaks peamist rühma: C/D box snoRNA (suunavad 2`O-riboosi metülatsiooni) ja H/ACA snoRNA (suunavad pseudouridüülimist). Peamiselt ühe koopiana. MikroRNA-d (miRNA) osalevad eelkõige geeniekspressiooni regulatsioonis (98% transkribeeritavast genoomist on mittekodeeriv!). Väikesed (~22 bp), tulenevad pikemast (70 bp) eellasmolekulist. Momendiks teada vähemalt 200 miRNA geeni. Ekspressioon sageli kas koe- või soospetsiifiline. Klasterdatud. Osa miRNA-sid katalüütilise aktiivsusega, telomeraasi RNA-d. Mitmed antisense RNA-d (umbes 500 geeni), mis osalevad geeniekspressiooni kontrollis (TSIX). piRNAd koos PIWI valkudega kontrollivad
nukleotiidse järjestuse piirkondi polüpeptiidahelate aminohappeliseks järjestuseks rRNA-d - Ribosoomi RNA-d, moodustavad ribosoomide põhistruktuuri ja katalüüsivad valgusünteesi tRNA-d - Transport RNA-d, transpordivad aminohappeid ribosoomi, kus need lülitatakse polüpepdiidahelasse snRNA-d - Väiksed tuuma RNA-d, osalevad paljudes tuumas toimuvates protsessides, k.a. pre-mRNA splaissing snoRNA-d - Väiksed tuumakese RNA-d, mis aitavad töödelda ja keemiliselt muuta rRNA-sid miRNA-d - MikroRNA-d, reguleerivad geeniekspressiooni blokeerides spetsiifiliste mRNA- de translatsiooni ja põhjustavad nende lagundamist siRNA-d - Väiksed segavad RNA-d, lülitavad välja geeniekspressiooni juhtides mRNA-de lagundamist ja moodustades kompaktse kromatiini struktuuri piRNA-d - Piwi-ga seostuvad RNA-d, seostuvad piwi valkudega ja kaitsevad sugurakke transposoonsete elementide eest lncRNA-d - Pikad mittekodeerivad RNA-d, paljud neist toimivad kui tellingud; nad
nukleotiidse järjestuse piirkondi polüpeptiidahelate aminohappeliseks järjestuseks rRNA-d - Ribosoomi RNA-d, moodustavad ribosoomide põhistruktuuri ja katalüüsivad valgusünteesi tRNA-d - Transport RNA-d, transpordivad aminohappeid ribosoomi, kus need lülitatakse polüpepdiidahelasse snRNA-d - Väiksed tuuma RNA-d, osalevad paljudes tuumas toimuvates protsessides, k.a. pre-mRNA splaissing snoRNA-d - Väiksed tuumakese RNA-d, mis aitavad töödelda ja keemiliselt muuta rRNA-sid miRNA-d - MikroRNA-d, reguleerivad geeniekspressiooni blokeerides spetsiifiliste mRNA-de translatsiooni ja põhjustavad nende lagundamist siRNA-d - Väiksed segavad RNA-d, lülitavad välja geeniekspressiooni juhtides mRNA-de lagundamist ja moodustades kompaktse kromatiini struktuuri piRNA-d - Piwi-ga seostuvad RNA-d, seostuvad piwi valkudega ja kaitsevad sugurakke transposoonsete elementide eest lncRNA-d - Pikad mittekodeerivad RNA-d, paljud neist toimivad kui tellingud; nad
match to the sequence, whereas miRNA can inhibit translation of many different mRNA sequences because its pairing is imperfect. In plants, miRNA tends to have a more perfectly complimentary sequence which induces mRNA cleavage as opposed to just repression of translation. RNA interferents (RNAi) on süsteem elavates rakkudes, mis osaleb geeniaktiivsuste määramisel. RNA interferentsiks on olulised kaks tüüpi väikseid RNA molekule mikroRNA (miRNA) ja väike interfereeriv RNA (siRNA). 3. Joonista 1) Eukarüootse geeni struktuur ning täida ära struktuursed elemendid 2) Nukleosoom ning täida ära struktuursed elemendid . II VARIANT 1. Kirjelda retseptor türosiinkinaaside toimimist ja signaalirada, mis viib effektorvalgu aktiveerimiseni. (5p)
Eksportiinid transpordivad tuumast välja valke, mis sisaldavad tuumaekspordisignaali. 7. Post-transkriptsioonilise regulatsiooni mehanismid, mis toimivad tsütoplasmas mikroRNAd ja tsütoplasmaatiline polüadenüülimine. RNA-sõltuv vaigistamine lühikesed RNAd seostuvad märklaud-mRNAde 3' UTRidele, mille tulemusena represseerivad märklaudgeenide ekspressiooni. siRNA small interfering RNA paardub märklaud-mRNA 3' otsaga täiesti komplementaarselt, miRNA mikroRNA puhul on ka üksikuid mittepaardunud nukleotiide. RNA interferents indutseerib mRNAde lagundamist. Dicer on valk, mis lõikab kaksikahelalise RNA prekursor RNA stem-struktuuridest välja. RISC kompleks RNA-indutseeritud vaigistav kompleks multivalkkompleks, mis sisaldab vaid üht RNA ahelat. Seal protsessitakse kaksikahelalisi siRNAsid ja miRNAsid edasi. RISC lõikab märklaud-mRNA, mis on täpselt komplementaarne vastavale üksikahelalisele siRNAle, ahela katki
telomeersete järjestuste sünteesimisel. Seega on telomeraas vastutav telomeeride uuenemise eest. RNA sünteesi põhietapid Pre-initsiatsioon Initsiatsioon Promootori vabastamine Elongatsioon Terminatsioon RNA-de tüübid. • mRNA-d - messenger RNA-d e. käskjalg RNA-d • rRNA-d - ribosomaalsed RNA-d • tRNA - transport RNA-d • snRNA-d - väiksed tuuma RNA-d • snoRNA-d - väikesed tuumakese RNA-d • Erinevad mittekodeerivad RNA-d: mikroRNA-d e. miRNA-d (üheahelalised) siRNA-d - väiksed segavad RNA-d (kaheahelalised) piRNA-d - Piwi segavad RNA-d (tansposoonide vaigistajad sugurakkudes) Tsütoplasma võrgustik (TV) Tsütoplasmavõrgustik e. endoplasmaatiline retiikulum (ER) on ühekordse membraaniga ümbritsetud terviklik kompartment, mis on iseloomulik kõigile eukarüootidele. ER-i membraan moodustab üle poole kogu raku membraanistikust ja on barjääriks luumeni ja tsütosooli vahel, ta
annaabi.ee 
