Loksutasin ühtlase konsentratsiooni saamiseks. Lisasin 50ml-sse katseklaasi 25 ml substraati, milleks on 7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8. Katseklaasile panin peale korgi ning asetasin vesitermostaati 30 juurde soojenema. Panin valmis kolm 250ml koonilist kolbi, igaühesse lisasin pipetiga 10 ml komplekslahust. Substraadi soojenemisel 30-ni lisasin sellele 1 ml uuritavat invertaasi töölahust. Lahuse loksutasin läbi ja pipeteerisin kiiresti 1ml lahust ühte kolbidest(0-proov). Substraadi panin tagasi vesitermostaati. 10 minutit hiljem peale ensüümireaktsiooni algust lisasin 1 ml lahust teise kolbi (I-proov). 20 minutit hiljem peale ensüümireaktsiooni algust lisasin 1ml lahust kolmandasse kolbi (II- proov). Kolvid, mis sisaldavad komplekslahust ja erinevatel aegadel reaktsioonisegust võetud proove, panin püstjahutite alla elektripliidile 10 minutiks keema. Pärast keetmise lõpetamist, lisasin igasse kolvi 150 ml destilleeritud vett (läbi püstjahuti)
termostaati 30oC juures soojenema kümneks minutiks. Valmistati ette kolvid taandavate suhkrute sisalduse määramiseks. Selleks pipeteeriti kolme koonilisse kolbi mahuga 250 ml ~10 ml komplekslahust. 30oC termostateeritud sahharoosi lahusele lisati 0,5 ml eelnevalt valmistatud uuritava invertaasi invertiini lahust. Loksutati ja fikseeriti ensüümireaktsiooni alguse aeg kella järgi. Kuiva pipetiga võeti kohe pärast ensüümi lisamist 1 ml hüdrolüüsisegu ja viidi ühte kolbidest, kus on komplekslahus. See oli 0-proov, mis iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel. 10 min pärast ensüümi lisamist pipeteeriti 1 ml reaktsioonisegu teise kolbi ning omakorda 10 min pärast 1 ml kolmandasse. Kolvid komplekslahusega, kuhu on lisatud hüdrolüüsisegust võetud proovid, asetati 10 min elektripliidile püstjahuti alla keema. Keemistemperatuuril toimus vase redutseerumine taandavate suhkrute toimel
Võtsin seda 0,3 ml, invertaasi lahust kokku oli 9 ml. Valmistasin ette kolvid taandavate suhkrute sisalduse määramiseks. Selleks pipeteerisin kolme koonilisse kolbi mahuga 250 ml 10 ml komplekslahust. Substraadi lahusele lisasin 0,5 ml eelnevalt valmistatud uuritava invertaasi lahust. Loksutasin ja fikseerisin ensüümireaktsiooni alguse. Kuiva pipetiga võtsin kohe pärast ensüümi lisamist 1 ml hüdrolüüsisegu ja viisin ühte kolbidest, kus oli komplekslahus. 10 min pärast ensüümi lisamist pipeteerisin 1 ml reaktsioonisegu teise kolbi ning 20 min pärast 1 ml kolmandasse. Kolvid komplekslahusega, kuhu on lisatud hüdrolüüsisegust võetud proovid, asetasin 10 min elektripliidile püstjahuti alla keema. Keemistemperatuuril toimus vase redutseerumine taandavate suhkrute toimel. Keetmise lõpetamiseks lisasin 150 ml destilleeritud vett läbi püstjahuti. Võtsin kolvid pliidilt ja jahutasin kraanivee all toatemperatuurini.
Võetsin kolm koonilist kolbi mahuga 250 ml, kuhu pipeteerisin igasse 10 ml komplekslahust. Kolbidesse viiakse reaktsioonisegust (=hüdrolüüsisegust) kindlatel aegadel võetud proovid, et neis määrata taandavate suhkrute sisaldust. Kui substraat on termostaadis saavutanud temperatuuri 30ºC, lisasin sellele 0,4 ml invertaasi töölahust ja loksutasin. Kohe peale reaktsioonisegu läbiloksutamist võetakse sellest pipetiga 1 ml lahust ja viiakse ühte kolbidest, kus on komplekslahus. Reaktsioonisegu tuub panin termostaati tagasi ja käivitasin stopperit. 10 ja 20 minuti pärast kordusin seda. Kolvid komplekslahusega, kuhu on lisatud hüdrolüüsisegust võetud proovid, asetasin 10 min elektripliidile püstjahuti alla keema. Keemistemperatuuril toimus vase redutseerumine taandavate suhkrute toimel. Keetmise lõpetamiseks lisasin 150 ml destilleeritud vett läbi püstjahuti. Võtsin kolvid pliidilt ja jahutasin kraanivee all toatemperatuurini.
HNO3 - 4ml ja H2SO4 - 6ml; 2 katseklaas HNO3 - 3ml ja H2SO4 - 7ml. Happeid segasin ettevaatlikult klaaspulgaga. Kolvide kuumenedes jahutasin neid kraani all toatemperatuurini. Peale jahutamist pannasin kummassegi kolbi 0,4 g kuivatatud vatti ja surutasin ettevaatlikult klaaspulgaga nitreerimissegu sisse. Kolvid suletasin ja jäetasin toatemperatuuril umbes 45 minutiks seisma. Seejärel valatasin liigne hape kolbidest välja happejääkide pudelisse ning pestsin nitrotselluloosi samas kolvis veega, kuni pesuvesi ei näita universaalsel indikaatorpaberil happelist reaktsiooni. Pestud vatt pressitasin algul sõrmede hiljem filtpaberi vahel kuivaks ning kuivatasin lõplikult termostaadis 60 C juures. Pärast kuivatamist uuritasin mõlema saadud nitrotselluloosvati lahustuvust ja põlemist ning määratasin leekpunkt.
30C juurde soojenema. · Kolme koonilisse kolbi pipeteerida 10 ml komplekslahust. · Kui substraat on termostaadis saavutanud vajaliku temperatuuri (30C), lisada sellele 1 ml uuritavat invertaasi töölahust, loksutada ning asetada tagasi termostaati. Fikseerida ensüümireaktsiooni aeg! · Kohe pärast läbiloksutamist võtta reaktsioonisegust kuiva pipetiga 1 ml lahust ja viia ühte kolbidest, kus on komplekslahus. See on 0-proov ning proovi võtmine peab toimuma võimalikult kiiresti. · 10 minutit pärast ensüümireaktsiooni algust võtta sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viia 2. kolbi. · 20 minutit pärast ensüümireaktsiooni algust võtta sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viia 3. kolbi. Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine · Kolvid asetada elektripliidile püstjahutite alla 10 minutiks keema. Aega arvestada
fooliumiga ja asetan umbes 10 minutiks vesitermostaati 30 ºC juurde soojenema. 2) Võtan kolm koonilist kolbi mahuga 250 ml,kuhu pipeteerin 10 ml komplekslahust. 3) Kui substraat on termostaadis saavutanud temperatuuri 30 ºC lisan sellele 0,5ml uuritavat invertaasi töölahust,lahus loksutan kiiresti. Asetan katseklaas termostaati tagasi. 4) Kohe peale reaktsiooni segu läbiloksutamist võtan sellest kuiva pipetiga 1 ml lahust ja lisan ühte kolbidest,kus on kompleks lahus. See on 0-proov. 5) 10 minutit peale ensüümreaktsiooni algust võtan sama pipetiga 1ml reaktsioonisegu ja lisan teise komplekslahust sisaldavasse kolbi. 6) 20 minutit peale ensüümreaktsiooni algust võtan veel 1 ml reaktsioonisegu ja lisan kolmandasse kolbi. Peale viimast proovi võttmist eemaldan katseklaasi termostaadist. Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine
juurde soojenema. · Võtsin 3 koonilist kolbi mahuga 250 ml, kuhu pipeteerisin 10 ml komplekslahust. Komplekslahus oli erksinine. · 5 10 minuti pärast, kui substraat oli termostaadis saavutanus temperatuuri , lisasin sellele 0,5 ml uuritavat invertaasi töölahust. · Lahuse loksutasin läbi. · Kohe peale reaktsioonisegu läbiloksutamist võtsin sellest kuiva pipetiga 1 ml lahust ja viisin ühte kolbidest, kus oli komplekslahus. See oli niinimetatud 0-proov, kuna selles määratav taandavate suhkrute sisaldus iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel. · Katseklaasi asetasin kiiresti tagasi termostaati ja samal ajal fikseerisin ensüümireaktsiooni alguse aja kella järgi. · 10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viisin teise komplekslahust sisaldavasse kolbi.
Selleks pipeteeriti kolme 3. koonilisse kolbi mahuga 250 ml ~10 ml komplekslahust. 4. 5-10 min. pärast võetakse sahharoosi lahus termostaadist ning lisatakse 1 ml uuritavat invertaasilahust., loksutatakse ja asetatakse katseklaas termostaati tagasi ning käivitatakse stopper või fikseeritakse ensüümireaktsiooni alguse aeg kella järgi. 5. Kohe peale ensüümi lisamist võetakse kuiva pipetiga 1 ml hüdrolüüsisegu ja viiakse ühte kolbidest, kus on komplekslahus. Selles määratav taandaavate suhkrute sisaldus iseloomustab 0- proovi. 10 min pärast ensüümi lisamist pipeteeritakse 1 ml reaktsioonisegu teise kolbi ja 20 min. pärast kolmandasse kolbi. 6. Kolvid reaktsiooniseguga asetatakse 10 minutiks elektripliidile püstjahuti alla keema. Keemistemperatuuril toimub vase redutseerimine taandavate suhkrute toimel. Keetmine lõpetatakse 150 ml destilleeritud vee lisamisega kolvidesse läbi püstjahuti
suhkrute sisaldus. · Kui substraat oli termostaadis saavutanud vajaliku temperatuuri, lisasin sellele 0.5 ml uuritavat invertaasi töölahust, loksutasin lahuse läbi ja asetasin katseklaasi kiiresti termostaati tagasi. Samal ajal fikseerisin ensüümireaktsiooni alguse. · Kohe peale reaktsioonisegu loksutamist võtsin sellest kuiva pipetiga 1 ml lahust ja viisin ühte kolbidest, kus oli komplekslahus. See oli nn 0-proov, kuna selles määratav taandavate suhkrute sisaldus iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel. · 10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viisin teise komplekslahust sisaldavasse kolbi. · 20 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin veel 1 ml reaktsioonisegu ja viisin kolmandasse kolbi. Reaktsiooniproduktide määramine ja aktiivsuse arvutamine
proovid, neis määratakse taandavate suhkrute sisaldus). Kui substraat oli termostaadis saavutanud temperatuuri 30 ºC ( u 5-10 min pärast ), lisasin sellele 2 ml uuritavat invertaasi töölahust, lahuse pidi läbi loksutama ja kiiresti asetama termostaati tagasi. Samal ajal fikseerisin ensüümireaktsiooni alguse aja kella järgi. Kohe peale reaktsioonisegu läbiloksutamist võtsin sellest kuiva pipetiga 1 ml lahuse ja viisin ühte kolbidest, kus oli komplekslahus. See oli 0 proov, kuna selles määratav taandavate suhkrute sisaldus iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel ja proovi võtmine pidi seetõttu toimuma võimalikult kiiresti. 10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viisin teise komplekslahust sisaldavasse kolbi. 20 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin veel 1 ml reaktsioonisegu ja viisin kolmandasse kolbi.e
taandavate suhkrute sisaldust. Kui substraat oli termostaadis saavutanud temperatuuri 30oC, lisasin sellele 1 ml uuritavat invertaasi töölahust, lahuse loksutasin läbi ja katseklaasi asetasin kiiresti termostaati tagasi. Samal ajal käivitasin stopperi, et mõõta ensüümreaktsiooniks kulunud aega. Kohe pärast reaktsioonisegu läbiloksutamist võtsin sellest kuiva pipetiga 1 ml lahust ja viisin ühte kolbidest, kus oli komplekslahus. See oli nn 0-proov, kuna selles määratav taandavate suhkrute sisaldus iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel ja proovi võtmine peab toimuma seetõttu võimalikult kiiresti. 10 minutit pärast ensüümreaktsiooni algust võtsin sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viisin teise komplekslahust sisaldavasse kolbi. 20 minutit pärast ensüümreaktsiooni algust võtsin veel 1 ml reaktsioonisegu ja viisin kolmandasse kolbi
lisatakse sellele 1ml (või muu kogus vastavalt juhendaja soovitusele) uuritavat invertaasi töölahust, lahus loksutatakse läbi ja katseklaas asetatakse kiiresti termostaati tagasi. Samal ajal fikseeritakse ensüümireaktsiooni alguse aeg kella järgi või käivitatakse stopper. · Kohe peale reaktsioonisegu läbiloksutamist võetakse sellest kuiva pipetiga 1 ml lahust ja viiakse ühte kolbidest, kus on komplekslahus. See on nn 0-proov, kuna selles määratav taandavate suhkrute sisaldus iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel ja proovi võtmine peab seetõttu toimuma võimalikult kiiresti. · 10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võetakse sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viiakse teise komplekslahust sisaldavasse kolbi. · 20 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võetakse veel 1ml reaktsioonisegu ja viiakse kolmandasse kolbi.
annaabi.ee 
