võib olla juba osaliselt lagunenud ega võimalda isiku tuvastamist, siis tehakse tuvastamist mitokondri SNP-de pealt) DNA tüpiseerimise ehk profileerimise peamised etapid: - Proovi võtmine - DNA eraldumine must rakulisest materjalist - DNA koguse ja kvaliteedi hindamine - Uuritavate piirkondade paljundamine PCR meetodil, SNP määramiseks lõigatakse teatud DNA piirkonnad ensüümide abil välja. - Elektroforees – eri pikkusega DNA lõikude eraldamine geelil - Tulemuste analüüs, isikute või leitud DNA võrdlemine PCR – polümeraasne ahelreaktsioon - Laialdaselt kasutatav meetod mingi kindla DNA lõigu paljundamiseks - Mitmeetapiline DNA süntees, kus eelnevates etappides sünteesitud ahelad on aluseks uute ahelate tootmisele järgnevates etappides (ahelreaktsioon) - Paljundamine toimub eksponentsiaalselt: 2, 4, 8, 16…, pärast kolmekümnendat tsüklit
SDS-i 10% lahus akrüülamiid/bisakrüülamiidi lahus Viimastena lisasime TEMED tõmbe all (ebameeldiva kalmaitselise lõhna pärast) ja seejärel APSi, mis katalüüsivad polümerisatsioonireaktsiooni. 2. Valasime alumist – lahutavat geeli – kahe klaasplaadi vahele. Geeli lahust plaadidevahelise ruumi täitsime nii, et ülemise ääreni jääks ~2 cm ruumi. Jälgisime, et ei tekkiks õhumulle. Kandsime geelile 1 ml EtOH. Lasesime geelil tarduda (8-15 min). Selleks, et jälgida geeli tardumist(polümeriseerumist), kasutasime falkooni: kui falkoonis ülejäänud geel on tardunud, võib teha järgmist etappi (etanooli visata ära ja kontsentreeritava geeli peale valada) 3. Valmistada kontsentreeriva geeli (stacking gel) lahus (NB! Kui lahutav geel on polümeriseerunud): Akrüülamiid 30%/ bisakrüülamiid 0,8% 0,67 ml 4x kontsentreeriva geeli puhver (0,5M Tris-Cl, pH 1,25 ml 6,8)
2 supilusikat lõhnatut looduslikku sampooni Valmistamine: Ajage leedriõied, alteejuur, roosi kroonlehed ja vesi väikeses kaanega kaetud kastrulis keema. Tõstke tulelt ja laske 30 minutit tõmmata. Kurnake ja valage puhtasse pudelisse. Lisage taimeveele lõhnatu ampoon ja loksutage hoolikalt. Kasutage ampoon ära kas ühe nädala jooksul või säilitage külmkapis kuni üks kuu. Ravim taimed juukse ja peanaha raviks Aaloe Aaloe lehtedest saadaval geelil on märkimisväärsed tervendavad, rahustavad, bakterivastased, antiseptilised, pehmendavad ja niisutavad omadused. Uuringud on näidanud, et aaloe kiirendab rakkude taastootmist. Aaloemahla on kasutatud ampooni, juuksevedeliku ja palsamina ning tulemused juustele ja peanahale on olnud suurepärased. Sageli ravitakse peanahahaigusi aaloemahla otsese pealekandmisega Aed-liivatee Tüümian on aromaatne, ergutav, mikroobivastane ja antiseptiline taim, mis tasakaalustab rasust nahka
Kuna viiruse genoom on väiksem, siis renatureerub ta kiiremini kui bakteri 4Mb suurune kromosoom. Kromosoom ei jõua kaheahelaliseks minna. 10. Miks RNA töötlus? RNaasi töötlus aitab veelgi puhtamaks saada puhastatavat DNA lahust. RNaas lagundab RNA rakkudes. 11. Millist tüüpi restriktaase kasutame? tüüp 2 - lõike- ja seondumissait kattuvad. Lõikavad vaid dsDNA-d (ainult ds lineariseerub, ss jääb tsirkulaarseks - tsirkulaarne jookseb geelil kiiremini - saab neid eristada). Tunneb ära 6-nukleotiidilise järjestuse GAATTC. Vajab tööks Mg ++. Lõigatud otsad jäävad üheahelaliseks (aka. kleepuvad otsad). 12. Miks ei või geeli vette teha vaid peab puhvrisse panema? Agaroosgeel peab olema tehtud puhvrisse, sest kui seda jooksutada ka puhvris ja kui geel on tehtud vette, siis Tris puhver tõmbab geelist vee välja. Tagab stabiilse pH. Oluline, sest DNA/RNA laeng sõltub keskkonna pH-st.
DNA Eemalda pesulahus ja lahusta saadud DNA (peab olema silmaga nähtav kogus!) 50 l TE-s. Selliselt eraldatud/puhastatud DNA on valmis restriktsioon-analüüsiks, PCR reaktsiooniks ja sekveneerimiseks (järgmises praktikumis). Ei teinud, sest lahus oli piisavalt puhas. (10) Kanna geelile 1/30-1/50 oma DNA lahust: 2-3 l DNA-d 2,5 l DNA-d + 10 l 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhver (lilla) Pipeteeri kogu lahus geelil olevasse ,,hambasse" ja elektroforeesi ~1 tund 100V juures. 9 1kb 1kb Kristine Arvidas Hannes Oksana Marker Marker MihkelMihkel HeleenHeleen KseniaKsenia MarkoMarko JelenaJelena Doris Doris Mikk Mikk Anna Anna Alex Alex Aare Aare Irina Irina Inna Inna Jana Jana Karl Karl Kristine Arvidas
- eemalda supernatant - pesemiseks lisa sademele ~200 l 70% etanooliga ja tsentrifuugi uuesti 2-3 min 7 Eemalda pesulahus ja lahusta saadud DNA (peab olema silmaga nähtav kogus!) 50 l TE-s. Selliselt eraldatud/puhastatud DNA on valmis restriktsioon-analüüsiks, PCR reaktsiooniks ja sekveneerimiseks (järgmises praktikumis). (10) Kanna geelile 1/30-1/50 oma DNA lahust: 10 l DNA-d + 2,5 l 5 x TBE foreesi pealekandmis-puhver (lilla) Pipeteeri kogu lahus geelil olevasse ,,hambasse" ja elektroforeesi ~1 tund 100V juures. Elektroforeesi tulemused: Lisaülesanded: 3.1) Võrdle antud protokolli DNA kokaraamatus tooduga (vt. lisa). Millised etapid on samad, millised erinevad? Sinu arvamused, ettepanekud, küsimused? Kokaraamatus lisatakse lahust III 150µl ,me lisasime lahust III 400µl. Kokaraamatus lisatakse lahust I 100 µl, me lisasime lahust I 200µl. 3.2) Kui palju tuleb võtta RNaasA-d, mille algkontsentratsioon on 10 mg/ml, et selle
olema noolega märgitud kohas). Põhjuseks võib olla ebatäpsus. Edasiseks tööks sain L-Envo pEGFP-C2. 2. PCR-i produkti puhastamine a) Kaalusime 1,5g agaroosi, viisime mahu TAE puhvriga 100ml-ni ja kuumutasime segu mikrolaineahjus, kuni agaroos täielikult lahustus. Seejärel jahutasime lahust ringjate liigutustega loksutades. Jahtunud segule lisasime 0,5l EtBr, loksutasime ning valasime lahuse geelialusele. Lasime geelil tarduda. b) Kuna produktide pikkus varieerus 300-2000 bp vahel, siis valmistasime 1,5% agaroos geeli. Mida pikemad produktid, seda lahjem peab olema geel, ning vastupidi. c) Kontrollgeeli valasime selleks, et hinnata, kas puhastamine on olnud efektiivne. Kui segusse on jäänud peale soovitava produkti muid jääke, on kontrollgeeli pildil näha peale õige pikkusega lõigu ka teisi bände. Kui aga geelil õige pikkusega bänd puudub, võib arvata, et
Afiinsuskromatograafia SDS geelelektroforees – geelelektroforees naatrium dodetsüül sulfaadiga (Sodium Dodecyl Sulfate); SDS annab valkudele tugeva negatiivse laengu, mistõttu on elektroforeesil võimalik eristada valke vaid nende massi järgi. Tavalisel geelelektroforeesil eristuvad valgu massi ja laengu järgi – mida väiksem mass ja suurem laeng, seda kiiremini liiguvad geelis. Isoelektriline fokuseerimine – elektroforeesi geeli on moodustatud pH gradient; sellel geelil liiguvad valgud seni, kuni on jõudnud sellise pH-ga geeli ossa, mis vastab nende isoelektrilisele puntkile (pI) e. kui valgu summaarne laeng muutub nulliks ja kui laeng on null ei ole võimalik enam elektriväljas edasi liikuda. α – heeliks – valgu helikaalne sekundaarstruktuur, mida stabiliseerivad keskteljega paralleelset asetsevad vesiniksidemed aminohapete amino ja karboksüülrühmade vahel.
lõpeb ja analüüt fokuseerub kintsasse tsooni oma isoelektrilises punktis. Kasutatakse valkude kirjeldamises. Proteiinide kahemõõtmeline elektroforees ja SDS-PAGE olemus. SDS; elektroforeesi läbiviimine sõltub pH-st, valgu aminohappelisest koostisest, st laengust. Valgud lõhutakse merkaptoetanooliga, lõhutakse SDS-ga (dodetsüülsulfaat) nii, et laeng muutub võrdeliseks molekulkaaluga (1 SDS 2 AH kohta), misläbi valk muutub vardakujuliseks, liikudes aeglasemalt geelil oma pikkuse tõttu. Kahemõõtmelisus 1. IEF - lahutamine laengu järgi 2. SDS-PAGE - proovi lahutamine suuruse järgi SDS-PAGE eesmärk on lahutada valke suuruse alusel. SDS - naatrium dodetsüülsulfaat, denatureerib valku peptiidahelaks, primaarstruktuuriks. PAGE - polüakrüülamiid geelelektroforees; kui denatureeritud valgud elektrivälja panna, hakkavad nad liikuma "+" laengu suunas ühe kiirusega. Lahutamiseks tuleb lisada keskkonda geel, polüakrüülamiid,
Tswett. Rakendatakse keemilises analüüsisja eriti puhastekeemiliste ühendite saamisel. 48.Elektroforees Makromolekulide separeerimine elektriväljas. Kolloidosakeste ja makroioonide liikumine elektrvälja mõjul katoodile(kataforees) või anoodile (anaforees). Seda põhjustab osakeste elekrilaeng, mis kolloidosakeste puhul tuleneb osakeste tuumadel absorbeerunud ioonidest. Elektroforees võib toimuda ka lahustiga immutatd kandmaterjalil- filterpaberil(paberelektroforees) või geelil(geelelektroforees). Elektroforeesi rakendatakse metallide pinnale kolloidosakestest kattekihi tekitamiseks, kõrgmolekulaarsete ühendite (nt valkude) segude analüütiliseks lahutamiseks, meditsiinis jms. 49. Nukleiinhapete hübridiseerimine. Kui segada üheahelalisi DNA või RNA järjestusi, millel on omavahel komplemen-taarseid järjestusi, siis need piirkonnad paarduvad vastavalt komplementaarsuse printsiibile, moodustades DNA-DNA või DNA-RNA kaksikheeliksi
suhteliselt kaugel osakesest ja seega kergesti lõhutav. Seismisel need sidemed tugevnevad, segamisel või raputamisel nõrgenevad. Seismisel struktuur tugevneb, kuid tõmbub ka kokku. Selle tagajärjel surutakse struktuurist välja osa disp. keskkonnast ning tarde ruumala väheneb. See ongi sünerees. Seetõttu tõmbub ka juust kokku. Kserogeel ja pundumine Kui ülalpool meetodil kuivatada geel täielikult, saame kuivanud kserogeel. Sellel geelil säilib vettimav võime. Seda nimetatakse pundumiseks. N: puu pundub. Kristallisatsioonilised geelid Kristallisatsioonilised geelid tekivad väljasadenemise käigus enamasti. Need on väga laialt levinud. Geeli all võib mõelda väga mitmesuguseid struktuure. N: nahk, puit, kivimid. Kõik nad on kihilised, sest nad on moodustunud sadenemise (kristalliseerumis) tagajärjel Kolloidkeemia Kristian Leite 2012
· 364(ins4) [sinna toimund 4 nukleotiidi insertsioon] 15. "Suurte" geenmutatsioonide tuvastamise meetodid Suured on üle 1000 aluspaarilised deletsioonid ja duplikatsioonid, tuvastatakse kas tsütogeensete meetoditega või: Southern Blot: Näide: kadunud on üks EcoRI restriktsioonisait. Paneme koos normaalse geeniga kokku, lisame EcoRI, mis lõikab kõik juppideks. Lisame fosforiga märgistatud sondi, mis hübridiseerub EcoRI restriktsioonisaidiga. Geelil tuleb välja, sond hübridiseerus erinevate bändidega. [kahtlen sügavalt teksti õiguses] dHPLC denatureeriv kõrgsurve vedelikkromatograafia. Normaalne kõrgsurve kromatograafia denaturatsioonikolonniga. Kolonn lahutab produkte. Hetero- ja homodupleksid tulevad erineval ajal läbi kolonni, sest denatureeriv mõju neile on erinev. Väga kiire, väga täpne, väga kallis. Üldiselt kasutatakse teadaolevate mutatsioonide leidmiseks.
puhverlahuses ja mis moodustab hangudes tahke geeli, mille sisemine mikroskoopiline struktuur meenutab tihedat võrgustikku. 140. DNA - markeri kasutus Kui tahetakse teada uuritava DNA fragmendi pikkust, lisatakse geeli ühele „rajale“ ka segu kindla meile teadaoleva pikkusega DNA fragmentidest, nn DNA marker. Kõrvutades oma proovi meile teadaoleva pikkusega vöötidega, saame selle kaudu tuletada ligikaudse fragmendi pikkuse. 141. DNA visualiseerimine geelil Kuigi geelis olev DNA on palja silmaga nähtamatu, on võimalik seda teatud keemiliste ühenditega nähtavaks muuta. Kõige levinumaks ühendiks on etiidiumbromiid, mis seostub kaheahelalise DNA molekuliga ning kompleksis sellega helendab ultraviolettvalguse käes. PIIRSOO OSA Loeng 2. Rakkude proliferatsioon, rakutsükkel ja selle regulatsioon 1.Rakutsükkel ja rakutsükli faasid Rakutsükkel – raku eluring mitoosi lõpust läbi interfaasi järgmise mitoosi lõpuni.
Pikkade DNA fragmentide jaoks on TAE lahutusvõime veidi parem kui TBE-l ja lühemaid fragmente lahutab TAE halvemini kui TBE. 72 GEL-LOADING DYE. Segatakse uuritava prooviga enne geelile kandmist, et 1. suurendada proovi tihedust, mis tagab proovi vajumise geelihamba põhja; 2. värvida proov, mis lihtsustab pealekandmist. DNA detekteerimine Nukleiinhapete nähtavaksmuutmine geelil toimub peale foreesi. Selleks kasutatakse • Etiidiumbromiidi (EtBr). EtBr seondub nukleiinhapetega ja fluorestseerub UV valguses (302 nm), muutes DNA nähtavaks. Kuna ilma EtBr-ta geelis on DNA bändid teravamad ja ilusamad, siis võib geeli värvida EtBr-ga peale foreesi. Selleks hoitakse geeli 30-45 min toatemperatuuril foreesipuhvris või destilleeritud vees, kuhu on lisatud EtBr (0,5 µg/ml). Tausta helenduse vähendamiseks võib EtBr-ga värvitud geeli loputada 20 min
Signaali võimendamine toimub võimendava lahusega, mille toimel lantanoidmärgis dissotsieerub antikeha küljest ning tema ümber tekib mitsell. Sel viisil võimendub fluorestsents ca 105 korda. Võimaldab detekteerida üksikuid antigeen-antikeha reaktsioone. Võimendatud kemoluminestsentsmeetodil on kõrge analüütiline tundlikkus tänu enhanceri kasutamisele. Immuundifusioon-meetod. Immuundifusioon viiakse läbi geelis (agargeel Petri tassis). Antigeenid ja antikehad liiguvad geelil soojusliikumise ja kontsentratsiooni gradiendi tõttu, moodustades kohtudes immuunkomplekse. Immuunkomplekside suurused sõltuvad anitgeenide ja antikehade kontsentratsioonide suhtest reaktsioonikeskkonnas. Suuremad immuunkompleksid murravad valgust oluliselt rohkem. On topeltimmunodifusioon (Ouchterlony meetod), mis võimaldab kvalitatiivselt määrata antigeene või antikehi (st vastab küsimusele jah/ei, üks või teine). Radiaalse
annaabi.ee 
