Üliõpilane: Liisa Kivi Juhendaja: Tiina Randla KROMATOGRAAFIA - segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva (mobiilse) ja liikumatu (statsionaarse) faasi vahel. Kromatograafilisi meetodeid kasutatakse laialdaselt amiohapete, valkude, süsivesikute jt ainete segude lahutamisel. GEELKROMATOGRAAFIA meetoditest on kõige tuntum geelfiltratsioon ehk molekulaarsõelte meetod. See on ainete lahutamise, puhastamise ja analüüsi meetod, mis baseerub segus olevate erineva molekulmassiga ainete erineval liikuvusel läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli. Antud meetodi puhul kasutasin pundunud geeligraanulitega täidetud kolonni. Geeli pooride mõõtmed on makromolekulide dimensioonidega samas suurusjärgus. Geeli poori suurust ületavate mõõtmetega molekulide tungimine terakestesse on välistatud.
Õpperühm: Töö teostaja: KATB-41 Sigrid Reinsalu 095908 Õppejõud: Töö teostatud: Protokoll esitatud: Protokoll arvestatud: Tiina Randla 28.02.2011 Töö teoreetilised alused Kromatograafia on segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva ja liikumatu faasi vahel. Geelkromatograafia meetoditest on kõige tuntum geelfiltratsioon ehk molekulaarsõelte meetod. See on ainete lahutamise, puhastamise ja analüüsi meetod, mis baseerub segus olevate ainete molekulmasside erinevusele.Geelkromotograafias viiakse protsess läbi kinnises süsteemis-kolonnis, mis on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurjusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulide dimensiooniga. Geelkromotograafias kasutatavad geelid koosnevad kas dekstraanist,agaroosist või polüakrüülamiididst
Üliõpilane Õpperühm KATB41 Töö teostatud 19/03/2012 Arvestatud TEOORIA KROMATOGRAAFIA - segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva (mobiilse) ja liikumatu (statsionaarse) faasi vahel. Kromatograafilisi meetodeid kasutatakse laialdaselt amiohapete, valkude, süsivesikute jt ainete segude lahutamisel. GEELKROMATOGRAAFIA meetoditest on kõige tuntum geelfiltratsioon ehk molekulaarsõelte meetod. See on ainete lahutamise, puhastamise ja analüüsi meetod, mis baseerub segus olevate erineva molekulmassiga ainete erineval liikuvusel läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli. Antud meetodi puhul kasutasin pundunud geeligraanulitega täidetud kolonni. Geeli pooride mõõtmed on makromolekulide dimensioonidega samas suurusjärgus. Geeli poori suurust ületavate mõõtmetega molekulide tungimine terakestesse on välistatud.
2. SEGUDE LAHUTAMINE JA AINETE IDENTIFITSEERIMINE 2.1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL Kromatograafia on segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva (mobiilse) ja liikumatu (statsionaarse) faasi vahel. Geelkromatograafia meetoditest on kõige tuntum geelfiltratsioon ehk molekulaarsõelte meetod. See on ainete lahutamise, puhastamise ja analüüsi meetod, mis baseerub segus olevate ainete molekulmasside erinevusele. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Protsessi viiakse läbi kolonnis, mis on täidetud poorse geelimaatriksiga, kusjuures poorid on samas suurusjärgus lahutatavate makromolekulide mõõtmetega. Geeligraanulite pooridest
Tsentrifuugimisega on võimalik eraldada osakesed, mis erinevad massi või tiheduse poolest. Suurendades tsentrifuugi kiirust on võimalik katseklaasi põhja viia järjest väiksemaid osakesi. Diferentsiaalfuugimine kaks või enam fuugimist erinevatel tingimustel. Gradientfuugimine teostatakse saharoosis või soolagradiendis. (Sedimentatsioonikoefitsent S = 10-13 sek. 2. Ioonvahetuskromatograafia, hüdrofoobsuskromatograafia, geelfiltratsioon-kromatograafia, afiinsuskromatograafia. Vedelikkromatograafias toimub eraldamine valgumolekulide erinevaid füüsikalis-keemilisi omadusi kasutades. Ioonvahetuskromatograafia eraldamine vastavalt valkude laengule. Hüdrofoobsuskromatograafia vastavalt valkude hüdrofoobsusele. Geelfiltratsioon-kromatograafia vastavalt valgumolekuli suurusele. Afiinsuskromatograafia vastavalt interaktsioonidele. 3
Tsentrifuugimisega on võimalik eraldada osakesed, mis erinevad massi või tiheduse poolest. Suurendades tsentrifuugi kiirust on võimalik katseklaasi põhja viia järjest väiksemaid osakesi. Diferentsiaalfuugimine – kaks või enam fuugimist erinevatel tingimustel. Gradientfuugimine – teostatakse sahharoosis või soolagradiendis. (Sedimentatsioonikoefitsent S = 10-13 sek. 2. Ioonvahetuskromatograagia, hüdrofoobsuskromatograafia,geelfiltratsioon-kromatograafia, afiinsuskromatograafia Kromatograafia on laboritehnika molekulide eraldamiseks. Eraldab molekule nt valke, mis on jaotunud mobiilse ja stratsionaalse faasi vahel. Eluaat on mobiilne faas, mis liigub mingis kindlas suunas. Eulaat, mis sisalad analüüsitavat ainet on eluent. Mobiilne faas võib olla gaas või vedelik. Eraldamine toimub valgu erinevaid omadusi kasutades: a) ioonvahetuskromatograagia- vastavalt valkude laengule
eluendiga. Kui proovis sisalduvate ühendite lahustuvused mobiilses ja statsionaarses faasis on erinevad, siis liiguvad nad kolonnis erinevate kiirustega ja väljuvad kolonnist erinevatel aegadel. Kogudes väljuvat vedelikku e. eluaati kogu selle protsessi vältel üksikute fraktsioonidena ongi võimalik segu komponendid üksteisest lahutada. 2.1.1 Geelkromatograafia Antud töös on ainete segu lahutamiseks kasutusel geelkromatograafia e. geelfiltratsioon- kromatograafia. Selle kromatograafia meetodi põhimõte: lahuses sisalduvate ainete lahutamine molekulmassi suuruse järgi (tuntud ka kui molekulaarsõelte meetod ja eksklusioonkromatograafia). Lahuses sisalduvad ained liiguvad tänu erinevale molekulmassile läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Geelkromatograafiat kasutatakse: - makromolekulide lahutamiseks - lisandite eemaldamiseks - puhvri vahetamiseks - soolade eraldamiseks
milleks on mõni peeneteraline materjal alumiiniumoksiid, silikageel, tärklis, tselluloos, tseoliit, aktiivsüsi vmt.) ja ioonvahetus (lahutatavas segus sisalduvate ioonide pöörduval vahetumisel statsionaarse faasina kasutatava polümeerse vaigu (ioonvahetaja) ioonide vastu. Selle kromatograafia meetodi aluseks on statsionaarse faasi ja lahutatava segu ioonide elektrostaatiline vastastoime). Geelkromatograafia meetoditest on kõige tuntum geelfiltratsioon ehk molekulaarsõelte meetod. See on ainete lahutamise, puhastamise ja analüüsi meetod, mis baseerub segus olevate ainete molekulmasside erinevusele. Afiinsuskromatograafia on kromatograafia liik, millega segu lahutamine toimub tänu kitsalt spetsiifilistele interaktsioonidele, nagu antigeen-antikeha, ensüüm-substraat või retseptor-ligand vastastoime. Afiinsuskromatograafiat kasutatakse mingi komponendi
eraldatakse ükshaaval aminohappeid ... (?) Kümotrüpsiin ja trüpsiin – proteolüütilised valgud, mis lõikavad peptiidsidet spetsiifilise aminhappe C-terminaalsest otsast. Kümotrüpsiin lõikab aromaatsete kõrvalahelatega aminohapete juurest; trüpsiin positsiivset laengut kandvate aminohapete juurest. Spetsiifiline aktiivsus – ensüüm katalüüsib talle spetsiifilist reaktsiooni ja spetsiifiliste molekulidega?. Nt. eksonukleaasne aktiivsus, peptidaasne aktiivsus? Geelfiltratsioon Ioonvahetuskromatograafia Afiinsuskromatograafia SDS geelelektroforees – geelelektroforees naatrium dodetsüül sulfaadiga (Sodium Dodecyl Sulfate); SDS annab valkudele tugeva negatiivse laengu, mistõttu on elektroforeesil võimalik eristada valke vaid nende massi järgi. Tavalisel geelelektroforeesil eristuvad valgu massi ja laengu järgi – mida väiksem mass ja suurem laeng, seda kiiremini liiguvad geelis.
etanooli, triklooräädikhappe või ammooniumsulfaadiga sadestamise teel. · Ekstraktsiooni kasutatakse juhtudel, kui substraadi ja produkti jaotus kahe omavahel mitteseguneva solvendi vahel on väga erinev. · Produkti adsorbeerimine tahkele kandjale nagu paber, klaas, ioonvahetuskandjad. · Kromatograafilised lahutusmeetodid: o lahutus võib põhineda substraadi ja produkti erineval, o molekulmassil (geelfiltratsioon), o hüdrofoobsusel (pööratud faasi kromatograafia), o ioniseeritusel (ioonvahetuskromatograafia) , o adsorptsioonil (adsorptsioon-kromatograafia). HPLC ehk kõrgsurve vedelikkromatograafia, paberkromatograafia, kromatograafia õhukesel kihil. Radioaktiivsuse kasutamine ensüümreaktsioonide jälgimiseks: Aktiivsuse määramise radioaktiivselt märgistatud substraadiga: 1. Ensümaatiline reaktsioon: 2
mitmeid epitoope. Monoklonaalsed antikehad on spetsiifilised üksiku epitoobi suhtes, mistõttu peetakse neid märklaud-antigeeni suhtes enam spetsiifilisemaks kui polüklonaalseid antikehi Raku komponentide eraldamine tsentrifuugimise teel. Sade koguneb põhja,supernatant peale Raku komponentide eraldamine pideva ja astmelise tihedusgradiendi abil. Valkude kromatograafilise lahutamise kolme erineva viisi (ioonvahetus-, geelfiltratsioon- ja afiinsuskromatograafia) põhimõte. Ioonvahetuskromatograafia – positiivselt laetud kerakestele seostuvad negatiivselt laetud molekulid. Positiivselt laetud molekulid ei seostu ja tulevad kolonnist läbi. Geelfiltratsioonkromatograafia – väiksed molekulid takerduvad poorsetesse kerakestesse, suured läbivad kolonni vabalt. Afiinsuskromatograafia – keraksetega kovalentselt seotud molekulidele seostuvad neile spetsiifilised molekulid.
või sulforühmi, mille prootonid võivad vahetuda segus olevate katioonidega. Anioniidid sisaldavad aluseliste omadustega rühmi, näiteks erineva asendusega aminorühmi. Kuna aminohapped ja valgud esinevad vesilahustes ioonidena, siis kasutataksegi ioon- vahetust sageli nende segude lahutamiseks. Ka automatiseeritud aminohapete analüsaatorid on ioonvahetuskromatograafid. Geelkromatograafia meetoditest on kõige tuntum geelfiltratsioon ehk molekulaarsõelte meetod. See on ainete lahutamise, puhastamise ja analüüsi meetod, mis baseerub segus olevate ainete molekulmasside erinevusele. Selle meetodi täpsem iseloomustus on toodud laboratoorses töös nr 2.2. Afiinsuskromatograafia on kromatograafia liik, mille puhul segu lahutamine toimub tänu kitsalt spetsiifilistele interaktsioonidele, nagu antigeen-antikeha, ensüüm-substraat või retseptor-ligand vastastoime. Afiinsuskromatograafiat kasutatakse mingi komponendi
Ühes kambris on ensüümkoos ligandiga (tekib tasakaal, osad seostuvad, osa ei seostu), teises kambris on ilma ensüümita ligand (alguses pole pm midagi). Ligand liigub läbi pooride läbi, vaba ligandi konts ühtlustub mõlemal pool membraani. Kui süsteem lasta tasakaalu, mõlemas kambris määrata ligandi (ligand radioaktiivne, siis ühest kambrist saame [L] b+[L]f, teisest saab [L]f (ainult ligandiga kamber). · Tasakaaluline geelfiltratsioon põhineb geelfiltratsiooni kolonnil, mis suudab eristada valku ja ligandi. On kolonn, mis on tasakaalus puhvri ja ligandiga mingis [L] kindlas kontsentratsioonis. Paneme peale valgulahuse, milles ka tasakaaluline lahus sees vms. Tulemuseks on see, et (y-teljel ligandi signaal, x-teljel vol platoo, jõnks üles, platoo, jõnks alla, platoo). Valk veab osa ligandist endaga kolonnist kaasa. Platoo on ligandi taustajoon
annaabi.ee 
