Eukarüootsete organismide genoomiprojektid (pärmid, eelloomad, hulkraksed) Pärmid: *Esimesena sekveneeritud eukarüoot Saccharomyces cerevisiae -pagaripärm (1996 a., 14 Mb, 16 kromosoomi, lisaks plasmiidid ja dsRNA viirused). Umbes 6340 geeni, 7% kodeerib mittetransleeritud RNA-d. Valke kodeerivaid ORF-e 5773 (25% nendest iseloomustamata). Geenide pikkus ca. 1.5 kb. Geenide kaugus ca 2 kb. Genoom väga kompaktne. Kromosoomides funktsionaalsed elemendid ARS, TEL, CEN. 2002 a. Schizosaccharomyces pombekäärituspärm, genoom. 13.8 Mb. 4940 valke kodeerivat geeni e. 57% genoomist. Sarrnasem kõrgemate eukarüootidega kui S.cerevisiae. *Erinevused intronite arvus (S.cerevisiae275 e. 5%, S.pombe43%), transposonite arvus (S.cerevisiaearvukalt, S.pombevaid mõned) Protozoa: *Esimene sekveneeritud eukarüootne parasiit Plasmodium falsiparum2002 a. (samal aastal P.yoelii yoelii, näriliste parasiit). Genoomi suurus 23 Mb, 14 kromosoomi, umbes 5300 ...
Meioos 1. Profaasi pahüteemas. 36. Geenide kaardistamine Neurospora crassa askuste analüüsil. 37. Mis on ,,paigalhoidvad" (balancer) kromosoomid? Paigalhoidvate kromosoomide kasutamine geenide asukoha määramiseks kromosoomides. 38. Geenide kaardistamise meetodid, mis põhinevad somaatiliste rakkude hübridiseerimisel. 39. Geenide kaardistamine translokatsioone sisaldavate kromosoomide abil. 40. Geenide kaardistamine deletsioone ja duplikatsioone sisaldavate kromosoomide abil. 41. Millist tüüpi nukleiinhape võib olla päriliku informatsiooni kandjaks? 42. Eksperimentaalsed tõendid selle kohta, et DNA kannab geneetilist informatsiooni. 43. Võrrelge DNA ja RNA koostist ning ehitust. DNA koosneb desoksüriboosist, nuklotiidist ja fosfaatjäägist, nukleotiidiseks on adeniin, guaniin, tsütosiin, tümidiin. RNA koosneb riboosist ja tümidiini asemel on uratsiil. 44
Translokatsiooni kromosoomiga rakk hübridiseeritiakse hiire rakuga. Hübriidis lähevad järk- järgult kaduma enamus kromosoomid, kuni jääb alles üks, translokatsiooni sisaldav geen. Kui avalduvad varasemalt teada olevad geenid, mis translokatsiooni käigus siirdati uuritava kromosoomi külge, siis saab kindlalt väita, millises kromosoomi osas need geenid paiknesid juba enne translokatsiooni. 40. Geenide kaardistamine deletsioone ja duplikatsioone sisaldavate kromosoomide abil. Mõnikord läheb fragment kromosoomist lihtsalt kaotsi, deleteerub. Kui sel juhul ilmnevad indiviidil muutused fenotüübis, näiteks põeb ta mingit haigust, võimaldab deletsioon lokaliseerida geene, mille defektsus seda haigust põhjustab. Duplikatsioone sisaldavad kromosoomid põhjustavad rakus kodeeritava valgu suuremat sisaldust ja see omakorda kõrgenenud ensüümiaktiivsust. Analüüsiks kasutatakse
(WGS) tehnikat kasutades. Arabidopsis thaliana genoom (müürlook): Sekveneeritud 2000 a. 5 kromosoomi, genoom 125 Mb. Umbes 25000 geeni. 35% geenidest unikaalsed, Lisaks nukleaarsele genoomile ka mitokondriaalne ja kloroplastide genoom, Geenid kompaktsed s.t. väikeste intronitega ja paiknevad genoomis lähestikku (keskmine vahemaa 4.6 kb). Mitmed geeniperekonnad paiknevad tandeemselt, Eksonid on palju rohkem G+C rikkad kui intronid (taimede omapära), Genoomis toimunud arvukalt duplikatsioone (polüploidiate teke). Mus musculus genoom: Lõpetatud aastal 2002. MGSC (Mouse Genome Sequencing Consortium) poolt 7x kaetud ja katab 96% genoomist (2,6 Gb), hiireliinil C57BL/6j. Avalik andmebaas, Celera hiire genoom 2001 a. Genoom 6x kaetud. Liin 129x1/SvJ,DBA/2J. Kommertsiaalne andmebaas, 2004 a. 90% Rattus norvegicus genoomist (2,75 Gb) RGSPC poolt. 8. Inimese genoomi projekt (ajalugu, eesmärgid, ELSI, strateegiad). 1956 a. esimene inimgenoomi füüsikaline kaart, 1977 a
39. Geenide kaardistamine translokatsioone sisaldavate kromosoomide abil. Hübriidsete rakkude analüüs võimaldab tuvastada, millises kromosoomis uuritav geen paikneb, kuid sel juhul jääb selgusetuks, millise kromosoomi piirkonnas. Meetod põhineb sellel, kas geen avaldub või mitte. Kui rakk jääb ellu, siis järelikult on ta seal teatud piirkonnas kas koguaeg olnud või translokeerunud teisest kromosoomist. 40. Geenide kaardistamine deletsioone ja duplikatsioone sisaldavate kromosoomide abil. Deletsioone sisaldavad proovitakse erinevatest kohtades välja lõigata ja vaadata, milline deletsioon muutust põhjustab. Duplikatsioone sisaldavad duplikatsiooni puhul on geeni poolt kodeeritud valgu hulk rakus kõrgem, see võib väljenduda kõrgenenud ensüümiaktiivsuses. Duplikatsioonide analüüsiks kasutatakse sageli translokatsioonidega kromosoome.
teatud geenide või DNA lõikude koopiaarvu muutuste või deletsioonide leidmiseks. • Referents-DNA ja test-DNA märgistatakse erinevate fluorestseeruvate märgistega, segatakse kokku ning hübridiseeritakse kiibile. Fluorestsentsi suhteid kasutatakse piirkondade detekteerimiseks test ja referents proovide vahel, mis erinevad koopiaarvult. Saab visualiseerida deletsioone ja duplikatsioone väga väikestes DNA segmentides Saab uurida tervet genoomi ilma varasema teadmiseta kromosomaalsete aberratsioonide kohta Ei vaja spetsiifilisi sonde Saab detekteerida amplifitseeritud geenide olemasolu vähis ja kaardistada nende asukoht Ebatäpsused teatud kromosoomide regioonides (kus on palju kordusi, akrotsentriliste kromosoomide tsentromeerides ja enamus kromosoomide
vaatlemisel. Näiteks X kromosoomi keskmise segmendi tandeemne duplikatsiooni kandvatel kärbestel on väiksemad silmad. Vastavat mutatsiooni Bar sisaldava polüteenkromosoomi duplitseerunud segmendid paarduvad omavahel, tekitades sõlmekujulise moodustise. Võimalik on tuvastada ka deletsioone, sest siis tuleb nähtavale lingukujuline homoloogiliste kromosoomide mittepaardunud ala. Kaasajal on võimalik deletsioone ja duplikatsioone kergesti tuvastada molekulaarsete meetoditega. Kuid sellest tuleb juttu hiljem. 5.10. Inversioonid Inversiooniga on tegemist sel juhul, kui segment kromosoomist on ülejäänud osa suhtes 180° suhtes ümber pööratud. Laboritingimustes saab selliseid ümberkorraldusi kunstlikult esile kutsuda röntgenkiirtega kiiritades, mis põhjustab kromosoomide fragmenteerumist. Mõnikord võivad segmendid uuesti ühineda, kuid nende orientatsioon võib olla muutunud
Avaldas, er nukleosiidi fosforülaasi (NP) kodeeriv geen paikneb 14. kromosoomi selles osas, mis translokeerunud X kromosoomi. Edasise analüüsi käigus töötati selliste translokatsiooni sisaldavate kromosoomidega, kus X kromosoomist olid üle kandunud lühemad segmendid võimalik uuritavad geenid X kromosoomis reastada. X kromosoomis paikneb geen DMD, mille defektsus Duchenne lihaseline düstroofia. 40. Geenide kaardistamine deletsioone ja duplikatsioone sisaldavate kromosoomide abil. Deletsioonide analüüs: mõnikord läheb fragment kromosoomist lihtsalt kaotsi, deleteerub. Kui ilmnevad indiviidil muutused fenotüübis võimaldab deletsioon lokaliseerida geene, mille defektsus seda haigust põhjustab. Duplikatsioonide analüüs: duplikatsiooni puhul geeni poolt kodeeritud valgu hulk rakus kõrgem (N: kõrgenenud ensüümiaktiivsus). Kasut sageli translokatsioonidega kromosoome. 41
Geenide kaardistamine translokatsioone sisaldavate kromosoomide abil. NT: kui on toimunud translokatsioon 14.krom ja X vahel. Mõned HAT söötmel ellu jäänud hübriidsed rakud sisaldasid 14.krom, kuhu oli translokatsiooni teel liitunud osa X pikast õlast. Edasi vaadati selliseid translokatiivseid krom, kus X krom-st oli teise kromosoomi üle kandunud lühemaid fragmente. See tegi võimalikuks uuritavad geenid X krom-s reastada. 40. Geenide kaardistamine deletsioone ja duplikatsioone sisaldavate kromosoomide abil. Deletsiooni abil: kui on toimunud muutus fenotüübis, on delets abil võimalik kindlaks teha, millise geeni defektsus mingit haigust põhjustab (kui deletsiooni asukoht langeb kokku selle kindla geeni asukohaga). Nt kärbestel silmavärv. Duplikatsiooni abil: dupl puhul on olemas algne krom uuritava geeniga ja selline krom, kuhu on sellest geenist segment lisaks. Geeni poolt kodeeritud valgu hulk rakus on sellisel juhul suurem. 41
Fikseeritud permutasioonid muudavad algsete infobittide asukohti. Peale permutasiooni jagatakse 64 bitine kood kaheks 32 bitiseks osaks. Üks osa läbib Feisteli funktsiooniga plokki ja liidetakse XORiga teisele otsa, ning kogu asi läheb vastupidi käima (vt. joonist). Nõnda käib see 16 korda, kuni tehakse lõpus veel üks kindel permutatsioon ja saamegi krüpteeritud info. Feisteli funktsioon. 1. 32 bitine pool-plokk kasvatatakse 48 bitiseks, kasutades osade bittide duplikatsioone (joonisel plokk E). 2. 56 bitisest võtmest kombineeritakse 48 bitine alamvõti. 3. Alamvõti ja 48 bitine info liidetakse kokku XOR tehtega, väljundiks on 48 biti pikkune tulemus. 4. See tulemus jagatakse 8-ks 6 biti pikkuseks osaks. 5. Iga kuuebitine osa läbib joonisel S-ploki (substitution box) , kus toimub tema teisendamine 4 bitiseks. Seda saab teostada näiteks maatriksite vms. sarnase tabeli alusel. 6
abil. Mõned HAT söötmel ellu jäänud hübriidsed rakud sisaldasid 14ndat kromosoomi, kuhu oli translokatsiooni teel liitunud enamus X kromosoomi pikast õlast. Edasi töötati juba selliste translokatsiooni sisaldavate kromosoomidega, kus X kromosoomist oli teise kromosoomi koostisesse kandunud lühemad fragmendid. Samasse õlga paigutusid ka fosfoglütseraadi kinaasi PGK ja glükoos-6.fosfaadi dehüdrogenaasi G6PD geenid. 40. Geenide kaardistamine deletsioone ja duplikatsioone sisaldavate kromosoomide abil. Deletsioonide analüüs – mõnikord läheb fragment kromosoomist lihtsalt kaotsi. Kui sel juhul ilmnevad indiviidil muutused fenotüübis, näiteks põeb ta mingit haigust, võimaldab deletsioon lokaliseerida geene, mille defektsus seda haigust põhjustab. Duplikatsioonide analüüs – duplikatsiooni puhul on geeni poolt kodeeritud valgu hulk rakus kõrgem, see võib väljenduda kõrgenenud ensüümiaktiivsuses. Duplikatsiooni all
teada, et see paikneb 14-ndas kromosoomis. Seega sai nüüd välistada võimaluse, et NP-d kodeeriv geen paikneb 14-nda kromosoomi selles osas, mis oli translokeerunud X kromosoomi. Edasise analüüsi käigus töötati juba selliste translokatsiooni sisaldavate kromosoomidega, kus X kromosoomist olid üle kandunud lühemad segmendid. Nii oli võimalik uuritavad geenid X kromosoomis reastada. 40. Geenide kaardistamine deletsioone ja duplikatsioone sisaldavate kromosoomide abil. · Mõnikord fragment kromosoomist lihtsalt deleteerub. Kui sel juhul ilmnevad inidiviidil muutused fenotüübis, näiteks mõni haigus, võimaldab deletsioon lokaliseerida geene, mille defektsus seda haigust põhjustab. · Duplikatsiooni puhul on geeni poolt kodeeritud valgu hulk rakus kõrgem ning see võib väljenduda kõrgenenud ensüümaktiivsuses. Duplikatsioonide analüüsiks kasutatakse
Osade hübriidraku edasisel paljunemisel jääb alles ainult 1 kromosoom 14, mille küljes on ka X kromosoomi pikem õlg. Kui antud rakus avaldub geen, mille kohta varem teati vaid seda, et ta on X kromosoomis, siis teatakse nüüd ka seda, et ta asub X kromosoomi translokeerunud pikemas õlas. Näiteks tehti nii kindlaks geeni HPRT asukoht. 40. Geenide kaardistamine deletsioone ja duplikatsioone sisaldavate kromosoomide abil. Deletsioonide analüüs vahel läheb segment kromosoomist lihtsalt kaduma ja kui sellisel puhul ilmneb muutusi indiviidi fenotüübis, näiteks põeb ta mingit haigust, võimaltab deletsioon lokaliseerida geene, mille defektsus seda põhjustab. Näiteks harvaesineva X kromosoomist toimunud deletsiooniga kaasnevad nähud kinnitasid, et DMD geen (selle defektsus põhjustab Duchenne lihaselist düstroofiat) paikneb X kromosoomi lühemas õlas.
teiste organismide genoomidega varieerub suuresti, seost genoomi suuruse ja organismi keerukuse vahel pole. 5. Liikuv DNA (transposoonid). DNA järjestused, mis suudavad ühe raku piires genoomis ümber paigutuda. Erinevad klassid. Klass I ehk retrotransposoonid (retroviiruse tüüpi, tuntud ka kui LTR-tüüpi ja mitte-LTR-tüüpi (LINEd ja SINEd)) ning klass II ehk DNA transposoonid. Evolutsiooniline tähtsus. Transpositsioon võib esile kutsuda mutatsioone ja geenide duplikatsioone. 6. Kuidas tekkisid pseudogeenid? Eellasgeeni korduvate duplikatsioonide tulemusena, samas on aga evolutsiooni käigus lisandunud neisse geenidesse geneetilise triivi tulemusena rida muutusi, mis transkriptsiooni enneaegselt termineerivad või inhibeerivad mRNA protsessingut, nii et need alad on muutunud mittefunktsionaalseks ehkki neilt transkribeeritakse RNAd. Teine võimalus pseudogeenide tekkeks on RNA pöördtranskriptsioon cDNAks ja viimase integratsioon genoomi intron-vaba DNAna. 7
geen avaldub hübriidses rakus ja tema funktsioon on eristatav hiire omast. Inimese ja hiire rakkude liitumist stimuleeritakse Sendai viirusega. Hübriidsete rakkude jagunemisel lähevad inimese kromosoomid järk-järgult kaotsi. 24 Hübriidseid rakke selekteeritakse HAT (hüpoksantiin-aminopteriin-tümidiin) söötmel, kus aminopteriin blokeerib põhilise nukleotiidide sünteesiraja 39. Geenide kaardistamine deletsioone ja duplikatsioone sisaldavate kromosoomide abil. KAARDISTAMINE DELETSIOONIGA Tehnika, mis võimaldab kindlaks määrata geeni asukohta kromosoomis. Tsütoloogiliselt määratavat deletsiooni tähistatakse tavaliselt tähekombinatsiooniga Df. Näiteks Drosophila X-liiteline geen, mille: mutantne alleel w määrab valgesilmsuse w+ määrab punasilmsuse tekke. Järelikult on w mitteproduktiivne ehk nullmutatsioon.
B -1-1-1-1- -2-2-2-2- C -1-2-3-4- -5-6-7-8- b) Concerted evolution ehk koosevolutsioon on see, kui erinevad geenid ühest geeniperekonnast (ühe geeni duplitseerumisel tekkinud) homogeniseeruvad geenikonversiooni tõttu. Selle tulemusena tekivad sama geeniperekonna erinevates lookustes samad geneetilised variandid. Geenikonversioon ei tekita uusi duplikatsioone, vaid kirjutab vanu üle. 7. Mis on concerted-evolutsiooni põhitoime? Kuidas see väljendub geeniperekonna DNA järjestuste võrdluses liikide sees ja vahel? Koosevolutsioon, kus ühe geeniperekonna eri geenid homogeniseeruvad geenikonversiooni tõttu. Selle tulemusena tekivad sama geeniperekonna erinevates lookustest samad geneetilised variandid. Erinevused sama geeni piirkondade vahel on erinevatel liikidel suurem, kui liigi sees
Näiteks X kromosoomi keskmise segmendi tandeemne duplikatsiooni kandvatel kärbestel on väiksemad silmad. Vastavat mutatsiooni Bar sisaldava polüteenkromosoomi duplitseerunud segmendid paarduvad omavahel, tekitades sõlmekujulise moodustise. Võimalik on tuvastada ka deletsioone, sest siis tuleb nähtavale lingukujuline homoloogiliste kromosoomide mittepaardunud ala. Kaasajal on võimalik deletsioone ja duplikatsioone kergesti tuvastada molekulaarsete meetoditega. Kuid sellest tuleb juttu hiljem. Ümberkorraldused kromosoomide struktuuris Ümberkorraldused kromosoomides võivad muuta segmendi positsiooni kromosoomis või viia ta teise kromosoomi. Inversioonid Inversiooniga on tegemist sel juhul, kui segment kromosoomist on ülejäänud osa suhtes 180° suhtes ümber pööratud. Laboritingimustes saab selliseid ümberkorraldusi kunstlikult esile kutsuda röntgenkiirtega kiiritades, mis põhjustab
Näiteks X kromosoomi keskmise segmendi tandeemne duplikatsiooni kandvatel kärbestel on väiksemad silmad. Vastavat mutatsiooni Bar sisaldava polüteenkromosoomi duplitseerunud segmendid paarduvad omavahel, tekitades sõlmekujulise moodustise. Võimalik on tuvastada ka deletsioone, sest siis tuleb nähtavale lingukujuline homoloogiliste kromosoomide mittepaardunud ala. Kaasajal on võimalik deletsioone ja duplikatsioone kergesti tuvastada molekulaarsete meetoditega. Kuid sellest tuleb juttu hiljem. Ümberkorraldused kromosoomide struktuuris Ümberkorraldused kromosoomides võivad muuta segmendi positsiooni kromosoomis või viia ta teise kromosoomi. Inversioonid Inversiooniga on tegemist sel juhul, kui segment kromosoomist on ülejäänud osa suhtes 180 ° suhtes ümber pööratud. Laboritingimustes saab selliseid ümberkorraldusi kunstlikult esile kutsuda röntgenkiirtega
Näiteks X kromosoomi keskmise segmendi tandeemne duplikatsiooni kandvatel kärbestel on väiksemad silmad. Vastavat mutatsiooni Bar sisaldava polüteenkromosoomi duplitseerunud segmendid paarduvad omavahel, tekitades sõlmekujulise moodustise. Võimalik on tuvastada ka deletsioone, sest siis tuleb nähtavale lingukujuline homoloogiliste kromosoomide mittepaardunud ala. Kaasajal on võimalik deletsioone ja duplikatsioone kergesti tuvastada molekulaarsete meetoditega. Kuid sellest tuleb juttu hiljem. Ümberkorraldused kromosoomide struktuuris Ümberkorraldused kromosoomides võivad muuta segmendi positsiooni kromosoomis või viia ta teise kromosoomi. Inversioonid Inversiooniga on tegemist sel juhul, kui segment kromosoomist on ülejäänud osa suhtes 180 ° suhtes ümber pööratud. Laboritingimustes saab selliseid ümberkorraldusi kunstlikult esile kutsuda röntgenkiirtega
Samas on ka eksperimentaalseid andmeid, mis ei kinnita seda, et MMR muutub statsionaarse faasi rakkudes limiteerivaks. Geneetilised ümberkorraldused Geneetilise mitmekesisuse tekkimisel statsionaarse faasi rakkude populatsioonis osalevad ka mobiilsed DNA elemendid - IS elemendid ja transposoonid. Vanades säilituskultuurides on täheldatud IS elementide ringihüppamist. Samuti on kirjeldatud kromosoomipiirkondade deletsioone, inversioone, duplikatsioone ja amplifikatsioone. Mutaatorid 82 Mutaatorfenotüüp kaasneb enamasti kas defektsusega DNA reparatsioonisüsteemides või DNA polümeraasi ebatäpsuses (puudub polümeraasi vigu korrigeeriv "proofreading" aktiivsus). DNA polümeraasi korrigeeriv aktiivsus võib kaduda ka näiteks mutantsete tRNA-de tõttu, mis põhjustavad teatud koodoni puhul vale aminohappe lülitumist polüpeptiidi. Eristatakse geneetiliselt fikseeritud
annaabi.ee 
