mRNA splaissing mRNA polüadenüleerimine RNA protsessing algab juba RNA transkriptsiooni käigus. Müts läheb RNA 5’ otsa ja pannakse tagurpidi. Mütsiks on lämmastikaluse positsioonis 7 metüleeritud guanosiin. Side on 5’-5’ fosfaatside. Lisatakse juba kui RNA polümeraas on sünteesinud 25-30 nt. Müts kaitseb RNAd ribonukelaaside vastu. Eukarüootsel geenil on eksonid (kodeerivad) ja intronid (vahejärjestused) Geenidel esineb sageli alternatiivsed splaissingut. Eksonite splaissimiseks on ekson-intron piirides ja intronite sees spetsiifilised signaalijärjestused. Ekson splaissitakse välja lariaat-struktuuri abil. Kui RNA on protsessitud, siis ta transporditakse läbi tuuma pooride tsütoplasmsse.
fosfaatrühma-vaheline 2'5'-fosfodiesterside*ligeeritakse 2 eksonit 3'5'-fosfodiestersidemega b. Vabaneb lasiaadistruktuuriline intron, mis lagundatakse kohe Rnaaside poolt. 24. Missugused U snRNAd osalevad pre-mRNA splaisingu regulatsioonis? a. U1, U2,U5U6U4 ja U1U4. 25. Mis on GT-AG reegel? a. Intron algab alati GT'ga ja lõppeb AG'ga. 26. Kirjelda mehanismi, mille abil tuumsest pre-mRNAst kõrvaldatakse intronid. a. Splaissingut teostab splaissosoom snRNP + pre-mRNA. b. *splaissosoom interakteerub pre-mRNA-ga ning moodustub splaissosoom c. *splaissosoom katalüüsib transesterfikatsiooni rekatsiooni: c.1) branchpointi A 2'-OH ja introni 5'-otsa fosfaatrühma- vaheline 2'5'-fosfodiesterside c.2) ligeeritakse 2 eksonit 3'5'-fosfodiestersidemega c.3) vabaneb intron lasiaat-struktuuris. 27
transporditakse naaberrakkudeni, kus nende pinnal tänu ühinemisele signaalretseptoriga aktiveeritakse signaali ülekandeahel, mille toimel omakorda indutseeritakse raku tuumades transkriptsioonifaktorite süntees. 10. Sugu määravad geenid Soo määramise regulatsioon Drosophila´l suguletaalse (Sex-lethal e. Sxl-) geeni poolt. SXL-valk on splaissingu regulaator, mis kontrollib nii tema enda geenilt sünteesitud RNA splaissingut kui ka transformergeenilt (tra) sünteesitud RNA splaissingut. TRA-valk kontrollib koos transformergeeni 2 (transformer2 e. tra2) valguga TRA2 ka autosoomse kahesoolisuse geeni (doublesex e. dsx) splaissingut, sest TRA-valgu olemasolul splaissitakse dsx-transkript nii, et sellelt transleeritud DSX-valk pärsib isaste sootunnuste arengut. TRA-valgu puudumisel moodustub alternatiivse splaissingu tulemusel selline DSX-valk, mis inaktiveerib emasputuka arenguks vajalike
Hulkraksete intronid on reeglina palju pikemad (1500 nukleotiidi) kui eksonid (500 nukleotiidi). Intronite väljalõikamise protsessi nimetatakse geeni splaissinguks. Kogu info introni väljalõikamise (splaissmise) kohta paikneb intronis endas. Valku kodeerivate geenide pre-mRNA splaissing peab toimuma väga täpselt, et mRNA saaks kodeerida funktsionaalset valku.Intronite täpne väljalõikamine peab toimuma nukleotiidi täpsusega, vastasel juhul läheb lugemisraam paigast ära. Enne splaissingut lisatakse pre-mRNA 5’-otsa 7-metüülguanosiinmüts ja 3’otsa transkriptsioonijärgselt pärast splaissingut 20–200nukleotiidi pikkune polü-(A)-järjestus ehk polü-(A)-saba. 7-metüülguanosiinmüts aitab kaitsta kasvavat RNA- ahelat nukleaasidedegradatsiooni eest ning eukarüootide mRNA polü(A)-saba suurendab oluliselt transkripti stabiilsust ja tal on tähtis roll mRNA transportimisel tuumast tsütoplasmasse. Küpses mRNA-s on ka mittekodeerivad piirkonnad (ingl
kui eksonid (500 nukleotiidi). - Intronite väljalõikamise protsessi nimetatakse geeni splaissinguks. Kogu info introni väljalõikamise (splaissmise) kohta paikneb intronis endas. Valku kodeerivate geenide pre-mRNA splaissingpeab toimuma väga täpselt, et mRNA saaks kodeerida funktsionaalset valku. Intronite täpne väljalõikamine peab toimuma nukleotiidi täpsusega, vastasel juhul läheb lugemisraam paigast ära. - Enne splaissingut lisatakse pre-mRNA 5’-otsa 7-metüülguanosiinmüts ja 3’otsa transkriptsioonijärgselt pärast splaissingut 20–200 nukleotiidi pikkune polü-(A)-järjestus ehk polü-(A)-saba. 7-metüülguanosiinmüts aitab kaitsta kasvavat RNA- ahelat nukleaaside degradatsiooni eest ning eukarüootide mRNA polü(A)-saba suurendab oluliselt transkripti stabiilsust ja tal on tähtis roll mRNA transportimisel tuumast tsütoplasmasse
kui eksonid (500 nukleotiidi). - Intronite väljalõikamise protsessi nimetatakse geeni splaissinguks. Kogu info introni väljalõikamise (splaissmise) kohta paikneb intronis endas. Valku kodeerivate geenide pre-mRNA splaissingpeab toimuma väga täpselt, et mRNA saaks kodeerida funktsionaalset valku. Intronite täpne väljalõikamine peab toimuma nukleotiidi täpsusega, vastasel juhul läheb lugemisraam paigast ära. - Enne splaissingut lisatakse pre-mRNA 5'-otsa 7-metüülguanosiinmüts ja 3'otsa transkriptsioonijärgselt pärast splaissingut 20200 nukleotiidi pikkune polü-(A)-järjestus ehk polü-(A)-saba. 7-metüülguanosiinmüts aitab kaitsta kasvavat RNA- ahelat nukleaaside degradatsiooni eest ning eukarüootide mRNA polü(A)-saba suurendab oluliselt transkripti stabiilsust ja tal on tähtis roll mRNA transportimisel tuumast tsütoplasmasse
Tehakse sealt cDNA, kasutatakse praimereid, kus on promootoralad (nt sp6) sellised cDNAsid saab in vitro transleerida/transkribeerida. Multipleks PCR skriining: Näeb, kui suur ala erinevatel patsientidel geenist kadunud on. 16. Dünaamiliste mutatsioonide tuvastamine Need on mittemendeliaalselt päranduvad mutatsioonid; peamiselt tripletid ja põhjustavad enamasti neuromuskulaarseid haigusi: Fragile X (levinuim X-liiteline idiootsus), mutatsioonid intronites (mõjutavad transpordi, splaissingut jne). Testimine: Geneetiline testimine: PCR või mõni analoog. Geelidel on kõik näha, kui geele võrrelda. Tavaliselt kasutatakse verd, suukaapeid, koorioni biopsiat, blastotsüsti materjali, juukseid, sperme, arhiveeritud materjali (surnute oma), Guthrie kaarte (tittedelt võetakse verd paksule paberile, kuhu DNA hästi jääb, pärast materjale elueeritakse ja uuritakse). · SNPd: Sagedased asendused, kodeerivadi on keskmiselt 6tk geeni kohta. Sünonüümsed
piiranguteks on:*uuritavad mutatsioonid ei tohi olla dominantsed või kodominantsed;*ei ole rakendatav siis kui toimub geenisiseste mutatsioonide komplementatsioon. Komplementatsioonitesti kasutamist on trakendatud polaarsete mutatsioonide puhul. 80)Kompleksed seosed geenide ja polüpeptiidide vahel: alternatiivne splaissing, immuunvastuse kujunemise geneetiline taust. Alternatiivne splaissing on see kui erinevate eksonite kombinatsioonid kodeerivad erinevate omadustega valke. Alternatiivset splaissingut on kirjeldatud imetajate -globiini puhul ja kanade ovalbumiini puhul. Sellisel juhul võib algse pre-mRNA splaissingu tulemusena tekkida erinava pikkusega mRNA molekule, millest osadel on valguliselt mõni ekson puudu. Kuid kollineaarsus mRNA molekuli ja tema poolt kodeeritava polüpeptiidi vahel säilib siiski. Alternatiivne splaissing võib vahel olla koespetsiifiline. Nt. loomede erinevate organites ja kehaosades on erinevad lihastüübid, mis sisaldavad erinevaid tropomüosiini vorme.
(teatud järjestuste moodustumine valgu abil) või sõltumatud (terminaatorid sisaldavad G-C rikast regiooni, millele järgneb 6 või enam A-T paari (A-d asuvad matriitsahelas). 60. Võrrelge eukarüootsete ja prokarüootsete geenide struktuuri. Eukarüootse RNA transkriptsioonijärgne modifikatsioon. Eukarüoodis: enamasti paiknevad kodeerivate alade – eksonite – vahel mittekodeerivad alad – intronid (geenijärjestused, mis jäävad mRNA koostisesse pärast splaissingut). Intronite sisaldus ja pikkus varieerub geeniti. Intronite pikkus võib varieeruda 50st nukleotiidist tuhandeteni. Prokarüootidel puuduvad intronid ja histoonid. 61. Intronite kõrvaldamine splaissingu teel. Intronite väljalõikamine võib toimuda kolme erineva mehhanismi alusel: 1) tRNA prekursorite puhul teeb katkeid RNA ahelasse spetsiifiline splaissingu endonukleaas ning eksoneid sisaldavad RNA segmendid ühendatakse splaissingu ligaasi abil
• Pol: polümeraas, proteaas, integraas. • Env: ümbrise glükoproteiinid. Kummaski genoomi otsas on long-terminal repeat (LTR) järjestused, milles sisalduvad promooterid, võimendaja (enhancerid) ja teised raku transkriptsioonifaktoritega seostumiseks vajalikud järjestused. Onkogeensetel viirustel on lisaks veel kasvu reguleeriv onkogeen. Komplekssed retroviirused (HTLV ja lentiviirused) kodeerivad ka mitmeid regulaatorvalke, mis vajavad keerulisemat splaissingut kui lihtsatel retroviirustel. Viiruse glükoproteiinid toodetakse env geenilt kodeeritud polüproteiini proteolüütilisel lõhustamisel, glükoproteiinide suurus erineb grupiti. Glükoproteiinid moodustavad pulgakommilaadsed trimeersed struktuurid virioni pinnale. Glükoproteiinidest suurem seostub algselt rakupinnaretseptoriga ja määrab koetropismi, tema vastu ka neutraliseeriv antikeha. Väiksem subühik moodustab pulgakommi varre ja soodustab rakkude sulandumist
terminatsioonijärjestuste juures, jõuab Rho valk RNA polümeraasile järele ja eemaldab sünteesitud RNA ahela transkriptsioonikompleksist. 60. Võrrelge eukarüootsete ja prokarüootsete geenide struktuuri. Eukarüootse RNA transkriptsioonijärgne modifikatsioon. Enamasti paiknevad eukarüootsetes geenides kodeerivate alade vahel mittekodeerivad alad, mida nimetatakse introniteks. Neid geenijärjestusi, mis jäävad mRNA koostisesse pärast splaissingut, nimetatakse eksoniteks. Intronite sisaldus ja pikkus varieerub geeniti. Intronite pikkus võib varieeruda 50-st nukleotiidist tuhandeteni. Prokarüootidel puuduvad intronid ja histoonid. Eukarüootses rakus toimub primaarse transkripti, pre-RNA, protsessimine transleeritavaks mRNA molekuliks. Intronid eemaldatakse splaissingu teel. Enne splaissimist lisatakse pre-mRNA-le 5´-otsa 7-metüülguanosiin ja 3´- otsa polü-A järjestus polüA saba, mis on 20-200 nukleotiidi pikk. 61
koopia. Võivad põhjustada deletsioone insertseerudes. Tekitavad aktiivselt rekombinatsioone, mis on aluseks segmentaalsete duplikatsioonide ekspansioonile. Samuti transduktsioone. • Geeniekspressioon – võivad tekitada insertsiooniga alternatiivseid transkriptsiooni algussaite, võivad katkestada promootori, sisestada antisense promootori jne. Transkripti tasemel võivad sisestada alternatiivse polüA saidi, miRNA sidumissaidi, tekitada alternatiivset splaissingut introni säilitamise või eksoni skippingu’ga. • Alu-de eksoniseerumine – introonsed Alu-elemendid võivad tekitada mutatsiooni, mis tekitavad funktsionaalseid splaissimise saite. Võivad konverteeruda eksonitesse. • • Genoomi evolutsiooniline dünaamika, võrdlev genoomika: • Genoomi funktsionaalse diversiteedi allikad Uute valgu domeenide ja struktuuride tekkimine Olemasolevate valgu domeenide ja valgu perekondade laienemine ja
Kromatiini pakkimises eristatakse mitmeid astmeid: 1) DNA keerdumine ümber histoonide 2) Pärlikee struktuur e 10nm fiiber 3) 30 nm fiibri struktuur 4) Lokaalsed gloobulid 5) Kromosoomid – mitoosi käigus pakkimine Kromosoomi territooriumid – imetajate rakkude tuumade struktuuri aluseks on kromosoomide territooriumid ja kindla struktuuriga kromatiinivaheline ruum, milles asuvad makromolekulide kompleksid juhivad DNA replikatsiooni ja parandamist ning mRNA transkriptsiooni ja splaissingut; homoloogilised kromosoomid ei lokaliseeru samas kohas Mõranenud gloobulid – fraktaalsed gloobulid – sõlmevabad struktuurid, milles DNA on küll tihedalt pakitud, kuid samas säilib võimalus igat genoomi lookust vabalt kokku ja lahti voltida. 10. Lambihari kromosoomid. Amfiibide ootsüütide tuumades on näha nn lambihari kromosoome, mille kromatiini fiibrid on lahti hargnenud ja moodustavad kaugele väljaulatuvaid linge. Samasuguseid
Eukarüootne pre-mRNA sisaldab mittekodeerivaid osasid, mis eemaldatakse protsessingu käigus. intron = mitte kodeeriv DNA järjestus eksonite vahel, ekson = kodeerivad osad geenis. mRNA eksonite splaissing ja intronite eemaldamine: Intronite otsad spetsiifilised 5'-GT(U) algus ja AG-3' lõpp. Splaissing splaissosoomide abil, mis on snRNA ja valgu kompleks, mis lõikab läbi 3' otsa ja seob eksonid. Intronid degradeeritakse raku poolt. Selline transkriptsioon võimaldab alternatiivset splaissingut. Post-transkiptoorne mRNA modifitseerimine: Lisab ja võtab ära osa nukleotiide pre-RNA, samuti modifitseerib keemiliselt nukleotiide, et nad ei oleks komplementaarsed DNA järjestustega. See viib ka a/h asendumisele, mis on veidi erinev. Üldiselt raku- või koespetsiifiline. Valkusid mittekodeerivad geenid: rRNA, ribosomaalne RNA (katalüüsib valgu sünteesi, aitab tRNA koos a/h siduda mRNA); tRNA, transport RNA (Transpordib a/h mRNA
- 3’ mittetransleeritav osa (3’ UTR) - terminaatorala 42. Nimeta geeni ekspressiooni regulatsiooni tasemeid Eukarüootide geeni ekspressiooni reguleeritakse 3 tasandil: transkriptsioonil, selle järgsel protsessingul ja translatsioonil. Geenide ekspressiooni reguleeritakse ka mitmel muul tasandil – Genoomse DNA avatus – RNA protsessing – mRNA transleeritavus valguks – mRNA stabiilsus – microRNA – Valgu stabiilsus. 43. Kirjelda alternatiivset splaissingut Geneetika sõnastiku vaste - Samalt geenilt kodeeritud pre-mRNA eriviisiline (alternatiivne) splaissing, mille tulemusel saadakse ühe geeni alusel valgu paljusid isovorme (nt. koespetsiifilisi). Toimub eukarüootsetel geenidel. Transkriptsioonijärgne RNA tükeldatakse ja selle tulemusel pannakse kokku mitmed erinevad erisuguse kombinatsiooniga eksonid. Tekivad erinevate omadustega mRNAd. 44. Transkriptsioonifaktorite funktsioon, sidemed DNA-ga, 4 peamist DNA seonduvat struktuuri
RNA polümeraasi III puhul toimub transktiptsiooni termineerumine sarnaselt bakterites toimuva Rho-valgust sõltuva terminatsiooniga. 70 Eukarüootsete geenide struktuur Eelpool oli põgusalt juttu sellest, et enamasti paiknevad eukarüootsetes geenides kodeerivate alade vahel mittekodeerivad alad, mida nimetatakse introniteks (tuletatud terminist intervening sequences). Neid geenijärjestusi, mis jäävad mRNA koostisesse pärast splaissingut, nimetatakse eksoniteks (expressed sequences). Intronite olemasolu tõestati esmakordselt imetajate -globiini geeni puhul, vaadeldes DNA ja mRNA vahelisi hübriide elektronmikroskoobis. Hiire -globiini mRNA, mis oli eraldatud tsütoplasmast, hübridiseerus vastavat geeni sisaldava DNA-ga ainult osades piirkondades, moodustades RNA-DNA dupleksi, kusjuures teine DNA ahel selles piirkonnas oli nähtav eraldi väljaulatuva linguna. Vastavaid struktuure nimetatakse R-lingudeks (R-loop)
seondunud terminaatorvalk. RNA polümeraasi III puhul toimub transktiptsiooni termineerumine sarnaselt bakterites toimuva Rho-valgust sõltuva terminatsiooniga. Eukarüootsete geenide struktuur Eelpool oli põgusalt juttu sellest, et enamasti paiknevad eukarüootsetes geenides kodeerivate alade vahel mittekodeerivad alad, mida nimetatakse introniteks (tuletatud terminist intervening sequences). Neid geenijärjestusi, mis jäävad mRNA koostisesse pärast splaissingut, nimetatakse eksoniteks (expressed sequences). Intronite olemasolu tõestati esmakordselt imetajate -globiini geeni puhul, vaadeldes DNA ja mRNA vahelisi hübriide elektronmikroskoobis. Hiire -globiini mRNA, mis oli eraldatud tsütoplasmast, hübridiseerus vastavat geeni sisaldava DNA-ga ainult osades piirkondades, moodustades RNA-DNA dupleksi, kusjuures teine DNA ahel selles piirkonnas oli nähtav eraldi väljaulatuva linguna. Vastavaid struktuure nimetatakse R-lingudeks (R-loop)
annaabi.ee 
