kaasasündinud immuunsüsteem, kuna antigeeni ära väikestes veresoontes-kapillaarides (nt. nahaaluskoes, hemoglobiini). ·Oksühemoglobiini sidumiskõvera hinke tundmine lümfotsüütide poolt ning parimate omadustega mistõõtu häirub termoregulatsioon!; paremale tähendab, et Hb afinnsus hapniku suhtes langeb, antikehi tootva rakuliini välja valimine võtab aega. aeglase verevoolu tingimustes ja verevarustuse hapniku vabastamine kudedesse on soodustatud). Hiljem mälu-rakud pesetsevad perifeersetes vähenemise tingimustes tekib perifeersete kudede , imuunorganites ning on mikroorganismi sissetungi väratile hüpoksia ja kompensatoorne veresoonte ahenemine , lähemal
vohamise tõttu, kuid neid rakke tuleb ka stimuleerida, et nad areneks lihasrakkudeks ja võivad hoopis areneda millekski muuks. Satelliitrakkude paljunemise piiratus on neile küll suur miinus, kuid need arenevalt primaarselt liharakkudest. In vitro liha kasvatamiseks on vaja palju rakkude jagunemise, kuid suurem osa rakke võib piiratud arv kordi jaguneda ene nende loomulikku surma. Sellest ülesaamiseks on kolm meetodit: 1) kultuuri pidev uuendamine 2) piiramatu rakuliini kasutamine 3) piiratud rakuliinist piiramatu väljatöötamine. Suuremal osal rakutüüpidest on vaja kasutada esimest meetodit, kuigi tüvirakud on teises kategoorias. Kolmanda kategooria kasutamine on raske, kuna selleks tuleb geene muuta. Siiski on mitme rakütüübiga juba õnnestunud seda teha. Toetusvõrk Toetusvõrgu mehhanismid on erineva kuju, koostise ja ehitusega, et opimeerida lihasraku- ja koe morfoloogia. Lihasrakkudel on vaja ankrut ja nad on võimelised ise kokku tõmbuma
Töö nr 1: Inimese genoomse DNA restriktsioon Cfr42I restriktaasi abil. Saadud fragmentide ligeerimine "Bluescript" pBS SK+ plasmiidi ehk vektorisse. Lähteained: Inimese genoomne DNA (<300 kb fragmentidena), mis on eraldatud adenokartsinoomi (HeLa) või teratokartsinoomi (NT2) kasvajarakkude lüüsil mitteioonse detergendi (NP40) abil. DNA on lahustatud TE* lahuses (TE*, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na 2) kontsentratsiooniga 5-10 nanogrammi/mikroliiter (ng/l). HeLa ja NT2 rakuliini kohta vaata - http://www.lgcstandards-atcc.org/ Bluescript pBS SK+ plasmiid 10 ng/l lineariseeritud Cfr42I abil (~3h restriktsioon, puhastatud fenooltöötluse, etanooliga sadestamise abil; lahustatud TE-s). Plasmiidi kohta vt Stratagene; http://www.stratagene.com/ . Plasmiidi kaarti vt lisamaterjalidest. Restriktaas Cfr42I (SacII) 10 ühikut/mikroliiter (u/l), hoitakse jääl. Restriktaasi kohta vt Fermentas; http://www.fermentas.com/, ja lisamaterjalid.
Antikehade kasutamine molekulaarbioloogias. Märgistatud antikehad seonduvad uuritava molekuliga (valguga) Saab teha kindlaks nende valkude sisalduse proovis. Saab panna ensüümi valgu antikeha külge ELISA värvime antikehi floresseeruvate molekulidega visualiseerimiseks hübridiseerid filtrit antikehadega western blotting Millised on monoklonaalsed antikehad? Monoklonaalne antikeha - antikeha, mis on produtseeritud ühe raku või rakuliini poolt, mis on ühest rakust arenenud. On identsed ja omavad unikaalset aminohappe järjestust, kasvavad identselt. Reageerivad vaid ühe epitoobiga antigeeni molekulis. Homogeenset antikehade populatsiooni on võimalik saada B lümfotsüütide liitmisel kasvajarakkudega. Saadud rakuliine kutsutakse hübridoomideks . Monoklonaalsed antikehad tekivad kui ühendada B-lümfotsüüdid kasvajarakkudega, need on hübridoomid
Töö nr 1: Inimese genoomse DNA restriktsioon Cfr42I restriktaasi abil. Saadud fragmentide ligeerimine "Bluescript" pBS SK+ plasmiidi ehk vektorisse. Lähteained: Inimese genoomne DNA (<300 kb fragmentidena), mis on eraldatud adenokartsinoomi (HeLa) kasvajarakkude lüüsil mitteioonse detergendi (NP40) abil. DNA on lahustatud TE* lahuses (TE*, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na 2) kontsentratsiooniga 5 nanogrammi/mikroliiter (ng/l). HeLa rakuliini kohta vaata - http://www.lgcstandards-atcc.org/ Bluescript pBS SK+ plasmiid 10 ng/l lineariseeritud Cfr42I abil (~3h restriktsioon, puhastatud fenooltöötluse, etanooliga sadestamise abil; lahustatud TE-s). Plasmiidi kohta vt Stratagene; http://www.stratagene.com/ . Plasmiidi kaarti vt lisamaterjalidest. Restriktaas Cfr42I (SacII) 10 ühikut/mikroliiter (u/l), hoitakse jääl. Restriktaasi kohta vt Fermentas; http://www.fermentas.com/, ja lisamaterjalid.
Seega umbes 100 mitootilise jagunemise järel telomeer on kadunud. Edasisel DNA replitseerumisel lähevad kaotsi geenid alates kromosoomi otstest.Kui vastsündinu rakud viia rakukultuuri kunstlikku toitekeskkonda, siis sellised rakud jagunevad umbes 100 korda ja siis surevad. Kui võtta rakud täiskasvanud ~ 60 a vanuselt inimeselt, siis rakud jagunevad ehk paarkümmend korda ja siis surevad. Seega telomeer määrab rakujagunemiste arvu ja rakuliini eluea. Kadunud telomeeriga DNA tuntakse ära kui kahjustatud DNA ja raku jagunemine pärsitakse või rakk siseneb apoptoosi. Arvatakse, et see on ka kontrollmehhanismiks rakkude ülemäärase jagunemise vältimisel. Samas on teada, et osa rakke on praktiliselt surematud võivad poolduda lõpmatu arv kordi. Sellised on näiteks · gameete produtseerivad haploidsed rakud · tüvirakud (näit vereloome tüvirakud luuüdis) · üherakulised eukarüoodid · osa vähirakkudest
küsimustele. 1. Praktikum - rakkude sulatamine ja paljundamine Sissejuhatus Praktikumi eesmärg on tutvustada loomarakkude kasvatamise aluseid, vajalikku aparatuuri, materjale ja põhilisi töövõtteid, loomarakkude külmutamise, säilitamise ja sulatamise põhialuseid. In vitro saab kasvatada erinevaid rakke – nii primaarsed (võetud koest, normaalsed rakud ja olenevalt organiismi vanusest ja rakutüübist jagunevad piiratud arv kordi), kui ka rakuliini – rakud, mis ei ole normaalsed ja nende jagunemine on piiramatu (embrüonaalsed rakud, kasvaja rakud). Praktikumis kaustati hiire embrüonaalseid fibroblaste, mis oli säilitanud vedelas lämmastikus, lühemat aega säilivad ka -80 °C juures. Selleks, et rakke kaitsa, lisatakse DSMO-d ja seerumit. Rakke on vaja külmutada selleks, et pidurdada kõike molekuraalse protsessi ja krüokaitse on vaja selleks, et takkistada veekristallide tekkimist, muidu rakud
Insertsioonid/deletsioonid AGACTAG(A/G)CATTAGA -Pikkuse polümorfism Korduvad järjestused AGTTC(GATA)(GATA)(GATA)TCCAG 18 Kordamisküsimused (Andres Veske) 1.Numbriliste ja struktuursete kromosoomi anomaaliate klassifikatsioon Numbrilised kromosoomiide anomaalliiad Polüploidiad Kõigil kromosoomidel esinevad ekstra koopiad Aneuploidiad Teatava kromosoomi kadu või lisandumine Miksoploidiad Kaks või rohkem rakuliini erinevate kromosoomide arvuga Mosaiiksus Eri rakuliinid pärinevad samast sügoodist Kimäärsus Eri rakuliinid pärinevad erinevatest sügootidest Polüploidne mosaiiksus diploid/triploid Aneuploidne mosaiiksus normaalne/trisoomia21 Struktuursed kromosoomide anomaaliad(seotud kromosoomide murdumisega): 1 murre ühes kromosoomis Terminaalsed deletsioonid Kaob aktsentriline fragment 2 murret ühes kromosoomis Inversioonid Regioon murdekohtade vahel pöördub 180° Sisemine deletsioon
- Patogeeni spetsiifilisus 13. Adaptiivne immuunsus a. Spetsiifiliste rakkude “meeskond” - T-rakud e. T-lümfotsüüdid (luuüdi - tüümus) - B-rakud e. B-lümfotsüüdid (luuüdi) b. Spetsiifiliste rakkude kaks “armeed” - Immunoglobuliinid - T-rakkude retseptorid c. Koesobivusantigeenid (rakkudevaheline kommunikatsioon) - Mälurakud 14. Immuunsüsteemi rakud Luuüdi tüvirakkudest moodustub kolm erinevat rakuliini: 1) B-rakud ja antikehasid moodustavad plasmarakud; 2) fagotsüüdid (k.a. makrofaagid); 3) eri tüüpi T-rakud 15. T- ja B-lümfotsüüdid T-lümfotsüüdid (T-rakud) (ingl. T lymphocytes, T cells)- Rakud, mis arenevad luuüdis ja pärast mõningast tsirkulatsiooni vereringes liiguvad tüümusesse (harknäärmesse), kus toimub nende lõplik diferentseerumine. T-lümfotsüüdid on esmavastutavad T-rakkude vahendatud e. rakulise immuunvastuse eest.
Suureneb Ab ja ag vaheline afiinsus (seondumise tugevus). Ensüüm AID (activation induced cytidine deaminase) tekitab mutatsioone. Eelis: tekitab lisa mitmekesisuse CDR3 hüpervariaablis regioonis Puudus: võivad tekkida paardumata nukleotiidid, lugemisraam võib minna katki. 11. Monoklonaalsete antikehade valmistamise põhimõte ja kasutamine teraapias. Milline peaks olema edukas ravim? Monoklonaalne antikeha on antikeha, mis on produtseeritud ühe raku või rakuliini poolt, mis on ühest rakust arenenud. On identsed ja omavad unikaalset aminohappe järjestust, kasvavad identselt. Reageerivad vaid ühe epitoobiga antigeeni molekulis. Hiirt immuniseeritakse antigeeniga, eraldatakse põrnarakud, fuseeritakse müeloomi rakkudega, kasvatatakse HAT söötmel (Aminopteriin blokeerib nukleotiidide sünteesi põhiraja ning HGPRT defekti tõttu ei saa müeloomirakud kasutada alternatiivseid substraate ja surevad, vanuse tõttu hukkuvad ka põrnarakud
uuritav DNA, teises pikkusmarker + alleelne redel. Pikkusmarkeris on alati teadaoleva pikkusega produktid ja seda kasutatakse erinevate proovide omavaheliseks võrdluseks. Proovis võivad esineda ka alleelid, mida pole alleelses redelis need on mikrovariantsed alleelid. Veske 1. Numbriliste ja struktuursete kromosoomi anomaaliate klassifikatsioon Numbrilised: * polüploidia kromosoomistiku mitmekordsus * miksoploidia kaks või enam rakuliini erinevate kromosoomide arvuga o kimäärsus eri rakuliinid eri sügootidest o mosaiiksus eri rakuliinid pärinevad samast sügoodist + polüplodine mosaiiksus diploid/triploid + aneuplodne mosaiiksus normaalne/trisoomia 21 * aneuploidia teatava kromosoomi lisandumine või kadu Struktuursed (seotud kromosoomide murdumisega): * 1 murre ühes kromosoomis > terminaalsed deletsioonid
IgE on seerumis, seostub Fc retseptori abil eosinof. ja basofiilidel. IgE leidub samuti vaid imetajatel, kellel on see ainus ülitundlikkust (allergiat) vahendav antikeha. Normaalsetel isenditel on IgE hulk vereseerumis väga väike, allergia või parasiitsete nakkuste tõttu suureneb see patsientide veres kuni tuhat korda. 14. Polüklonaalsed antikehad. Monoklonaalsed antikehad (Hübridoomi tehnoloogia) Monoklonaalne antikeha on antikeha, mis on produtseeritud ühe raku või rakuliini poolt, mis on ühest rakust arenenud. On identsed ja omavad unikaalset aminohappe järjestust, kasvavad identselt. Reageerivad vaid ühe epitoobiga antigeeni molekulis. Homogeenset antikehade populatsiooni on võimalik saada B lümfotsüütide liitmisel kasvajarakkudega. Saadud rakuliine kutsutakse hübridoomideks . PKA tunnevad ära ja seostuvad paljude epitoopidega antigeeni molekulid. Saadakse loomade (kits, küülik jne) korduval süstimisel vastava antigeeni lahusega. Vereseerum
fosforibosüül transferaasi suhtes (HPRT-), need rakud söötmel ei kasva. Kasvada saavad üksnes hübriidid. HAT söötmes olev aminopteriin blokeerib tavalise puriinide ja tümidülaadi sünteesiraja, mistõttu rakud saavad kasvada ainult siis, kui neis on funktsionaalsed TK ja HPRT alleelid ning söötmes tümidiin ja hüpoksantiin. Kui hübriidsed rakud on selekteeritud, isoleeritakse kloonid e. rakuliinid (tegemist on ühe raku järglaskonnaga). Iga rakuliini puhul jälgitakse, milliseid valke sünteesitakse ning milliste valkude puudumine/olemasolu on seotud konkreetse inimese kromosoomi puudumise/olemasoluga. Üks hübriidne liin sisaldas ainult ühte inimese kromosoomi 17-ndat kromosoomi ning oli sellegipoolest võimeline sünteesima tümidiini kinaasi. Seega paigutus TK geen 17-ndasse kromosoomi. Vastupidisel rakkude hübridiseerimisel (HPRT- hiire rakud + TK- inimese rakud) saadi HAT- söötmel kasvav hübriid, mis sisaldas
fosforibosüül transferaasi suhtes (HPRT-), need rakud söötmel ei kasva. Kasvada saavad üksnes hübriidid. HAT söötmes olev aminopteriin blokeerib tavalise puriinide ja tümidülaadi sünteesiraja, mistõttu rakud saavad kasvada ainult siis, kui neis on funktsionaalsed TK ja HPRT alleelid ning söötmes tümidiin ja hüpoksantiin. Kui hübriidsed rakud on selekteeritud, isoleeritakse kloonid e. rakuliinid (tegemist on ühe raku järglaskonnaga). Iga rakuliini puhul jälgitakse, milliseid valke sünteesitakse ning milliste valkude puudumine/olemasolu on seotud konkreetse inimese kromosoomi puudumise/olemasoluga. Üks hübriidne liin sisaldas ainult ühte inimese kromosoomi 17-ndat kromosoomi ning oli sellegipoolest võimeline sünteesima tümidiini kinaasi. Seega paigutus TK geen 17-ndasse kromosoomi. Vastupidisel rakkude hübridiseerimisel (HPRT- hiire rakud + TK- inimese rakud) saadi HAT- söötmel kasvav hübriid, mis sisaldas
annaabi.ee 
