Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov viiakse kompleklahusesse. Kompleksis sisalduv Cu(II) taandub keemistemperatuuril Cu(I)-ks ja moodustub vask(II)oksiid. Cu2O eraldub punase sademena. Alles jääb ekvivalentses koguses vaba triloon-B. Vabanenud triloom-B kogus määratakse tiitrimise teel. Tiitrimiseks kasutatakse 0,02 M vasksulfaadi lahust. Protsessi käigus komplekseerub triloon-B uuesti Cu (II) ioonidega. Lahusesse lisatud indikaator mureksiid muutub rohekaks, kui vastav kompleks on tekkinud. Tiitrimisel toimuv reaktsioon: Tiitrimiseks kulunud vasksulfaadi lahuse mahu järgi leitakse kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldataks e mikrokatalites ensüümlahuse 1 ml kohta. Töö käik Ensüümpreparaadist töölahuse valmistamine Automaatpipeti abil viiakse gradueeritud katseklaasi 0,25 ml vedelat ensüümpreparaati.
Invertaasi toimeks on vajalik happeline keskkond, seega komplekslahus toimub invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab reaktsiooni. Hüdrolüüsisegust võetakse proovid (sisaldavad taandavaid suhkruid), neid keedetakse ja vask(II) taandub vask(I)-ks, moodustub Cu2O, see eraldub segust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Vabanenud triloon B kogus määratakse 0,02 M vasksulfaadi lahusega tiitrides, indikaatoriks mureksiid. 1 kat on ensüümi hulk, mis produtserib 1 s jooksul 30C juures 1 mol taandavat suhkrut (kutsub esile 1 mol sahharoosi hüdrolüüsi). Töö käik: Sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimine: pipeteerisin 100 ml katseklaasi 25 ml 7 %-list sahharoosi lahust (substraat, mille pH on atsetaatpuhvriga reguleeritud väärtusele 4,8) ja asetasin selle vesitermostaati 30C juurde soojenema (10 minutit). Valmistasin uuritava invertaasi lahuse: kasutasin tahket invertaasi (Invertaas, 3.2.1.26),
vask()-triloon B kompleksi. Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandub taandavate suhkrute toimel -ks, mis eraldub punase sademena. Lahusesse jääb ekvimolaarses koguses vaba triloon-B. Järgneb triloon-B kontsentratsiooni määramine tiitrimisel kasutades 0,02 M lahust. Toimub vase taaskomplekseerumine triloon-B-ga ja seda saab visualiseerida, kui lisada lahusesse indikaator mureksiid (lahuse värvus muutub violetsest roheliseks). Tiitrimiseks kulunud mahu järgi leitakse varem koostatud kaliibrimisgrrafikust taandavate suhkrute kontsentratsiooni. Töö käik 1. Valmistan ensüümipreparaadi lahust. Tahke preparaadi mass g=10 mg, lahustiks atsetaatpuhver (5ml), töölahuse kontsentratsioon 2 mg/ml. 2. 50 ml katseklaasi pipeteerin 25 ml 7%-list sahharoosi lahust atsetaatpuhvris (pH=4,8), varustan katseklaas korgiga ja asetan
Tiitrimist mõjutavad tegurid *pH mõju tiitrimiskõvera kujule Ca ioonide tiitrimisel EDTAga; mida suurem pH seda suurem tiitrimiskõvera hüpe; *Komplekside püsivuse mõju tiitrimiskõvera kujule , näide erinevate metallide katioonide tiitrimisest EDTA ga pH 6 juures. Mida püsivam kompleks, seda suurem tiitrimiskõvera hüpe Indikaatorid * 200 orgaanilist ühendit orgaanilised vaigud, mis moodustavad kelaate metalliioonidega. Need on intensiivse värvusega. *MIn + HY3= HIn2 + MY2 ET00 Mureksiid In + Me2+= MeIn+ Ksülenooloranz kompleksid metalliioonidega on punased Indikaatorid *Kalmagiit * Eriokroommust T, ET00 Indikaatorid *Arsenazo I *NASHappelises keskkonnas punakasvioletne, punane pH 3,5;Kollased kompleksid Cu, Zn, Pb ioonidega Tiitrimismeetodid EDTAga *Otsene võimalik tiitrida 40 elementi, sõltub kas on sobivat indikaatorit; potentsiomeetriline tiitrimine, kui leidub ioonselektiivne elektrood;
triloon B kompleksi). Invertaasi toimeks on vajalik happeline keskkond, seega komplekslahus toimub invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab reaktsiooni. Hüdrolüüsisegust võetakse proovid (sisaldavad taandavaid suhkruid), neid keedetakse ja vask(II) taandub vask(I)-ks, moodustub Cu2O, see eraldub segust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Vabanenud triloon B kogus määratakse 0,02 M vasksulfaadi lahusega tiitrides, indikaatoriks mureksiid. 1 kat on ensüümi hulk, mis produtserib 1 s jooksul 30C juures 1 mol taandavat suhkrut (kutsub esile 1 mol sahharoosi hüdrolüüsi). Töö käik: Sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimiseks võtsin 50 ml katseklaasi, kuhu pipeteeritisin 25 ml 7 % sahharoosi lahust (substraati), mille pH oli atsetaatpuhvri abil reguleeritud sobivale väärtusele. Lahuse asetasin termostaati 30°C juures soojenema kümneks minutiks. Valmistasin uuritava invertaasi lahuse: kasutasin vedelat invertaasi
suhkrud glükoos ja fruktoos. Nende summarse konsentratsiooni saab määrata reaktsioonisegust. Kuna keetmisel taandub suhkrute toimel kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks, siis jääb lahusesse vaba triloon B, mistõttu lahus on sinine. Tiitrimisel reageerib lahuses olev vaba triloon B CuSO 4-ga. Kui kogu lahuses olev vaba triloon B on CuSO4-ga reageerinud, jääb lahus püsivalt rohekaks, sest moodustub kompleks Cu (II)-triloonkompleks. Värvuse muutust aitab detekteerida mureksiid. Vaadates kalibreerimisgraafikut, võiks pidada katset õnnestunuks, kuid kui heita pilk arvutatud aktiivsustele, siis A10 ja A20 erinevat üksteisest 21,9%. Arvan peapõhjuse leidvat ikka tiitrimises: tulemus 4,12 ml ei ole number, mille eest ma pea julgeksin anda, sest just viimase tilga lisamisel keerasin ma kraani vales suunas ning lahusesse sattus tublisti rohkem CuSO 4 lahust, kui oleks tohtinud. Arvestasin ,,sorina kestust" ja seda, kui palju ,,umbes" selle ajaga
Astmeline dissotsiatsioon;sõltuvalt pHst 5 vormi lahuseid;lahustub hästi Kompleksühendi püsivuskonstant, tinglik püsivuskonstant: Kompleksonomeetrilise tiitrimise kõver Arvutatakse tinglik püsivuskonstant,arvutatakse tiitrimiskõvera punktid enne ekvivalentpunkti;siis ekvivalentpunktis ja peale eksvivalentpunkti. Metalliindikaatorid Indikaatorid on orgaanilised ühendid mis moodustavad värvilisi kelaate metallidega. MIn- + HY3-= HIn2- + MY2- : ET-00 Mureksiid: In- + Me2+= MeIn+ Ksülenooloranz kompleksid metalliioonidega on punased Eriokroom must T: H2O + H2In- = HIn2- + H+ K1= 5.10-7 H2O + H2In2- = In3- + H+ K2 = 2,8.10-12 Orgaanilised ained, mis annavad metallikatioonidega intensiivselt värvunud komplekse. Kompleksonomeetriliste tiitrimiste kasutamine Metallikatioonide määramiseks .Vee kareduse määramine. Ca, Mg ja raskemetallid,
R-CHO + Cu(II)-triloon B kompleks + 4Na+ + 4OH- R-COOH + triloon B + Cu2O Triloon B koguse saab ära määrata tiitrimise teel kasutades 0,02 molaarset vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus tekitab vaba Triloon B uuesti sidemeid Cu(II) ioonidega mis on 3 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine Martin Tamm (121006YASB) Biokeemia protokoll nähtav ka värvuse muutumises kui on lisatud mureksiidi lahust. Mureksiid ehk ammoonium purpuraat on indikaator tumesinise värvusega mida lisatakse komplekslahusesse, et värvuse muutust märgata. Tiitrimise reaktsioon kulgeb järgmiselt: Vaba triloon B + 2CuSO4 Cu(II)-triloon B kompleks + 2Na2SO4 Tiitrimiseks kulunud vasksulfaadi lahuse hulga järgi leitakse suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus kasutades kalibreerimissirget mis on eelnevalt valmist tehtud. Ensüümi aktiivsuse ühik on mikrokatal (µkat)
34. Titrandid kompleksonomeetrias (EDTA, NTA). 35. Aminopolükarboksüülhapete omadused (struktuur, dissotsiatsioon). 36. Kompleksühendi püsivuskonstant, tinglik püsivuskonstant. 37. Kompleksonomeetrilise tiitrimise kõver. 38. Metallindikaatorid (eriokroom must T, ksülenooloranz jt.). 200 orgaanilist ühendit- orgaanilised vaigud, mis moodustavad kelaate metalliioonidega. Need on intensiivse värvusega. MIn + HY = HIn + MY ET-00 - 3- 2- 2- Mureksiid - 2+ + In + Me = MeIn Ksülenooloranz kompleksid metalliioonidega on punased Eriokroom must T (H3Ind) on üks enamkasutatavaid indikaatoreid kompleksonomeetriliste tiitrimiste korral EDTA-ga (Na2H2Y). Tema molekul sisaldab ühte sulfurüülrühma, mis on vesikeskkonnas täielikult dissotsieerunud, ja kahte fenüülset OH rühma, mis dissotsieeruvad ainult osaliselt (Ka1=5.0 -7 -12 ·10 ja Ka2=2.8 ·10 ). 2- +
NTA Nitrilotrietaanhape (NTA) ehk kompleksoon I Aminopolükarboksüülhapete omadused- astmeline dissotsiatsioon (Struktuur,Dissotsiatsioon) Kompleksühendi püsivuskonstant, tinglik püsivuskonstant- Kompleksonomeetrilise tiitrimise kõver- Metalliindikaatorid- 200 orgaanilist ühendit- orgaanilised vaigud, mis moodustavad kelaate metalliioonidega. Need on intensiivse värvusega. MIn- + HY3-= HIn2- + MY2- : ET-00 Mureksiid: In- + Me2+= MeIn+ Ksülenooloranz kompleksid metalliioonidega on punased eriokroom must T: H2O + H2In- = HIn2- + H+ K1= 5.10-7 H2O + H2In2- = In3- + H+ K2 = 2,8.10-12 Orgaanilised ained, mis annavad metallikatioonidega intensiivselt värvunud komplekse. Indikaatori valiku põhimõtted kompleksonomeetrias- Kompleksonomeetriliste tiitrimiste kasutamine-Meetod rakendatav praktiliselt kõigi metallikatioonide (v.a.
Cl-, NO3- jt. sisaldusega 2) sageli kasutatakse kareduskraade (mis erinevates riikides võivad olla erinevad) 1 saksa kareduskraad vastab: 0,01 g CaO/l = 0,01 g = = 0,000357 mol/l = 0,357 mmol/l 28 (täpsemalt: mg-ekv/l) Vee karedust mõõdetakse tiitrimisel EDTA-Na (kompleksoon III, triloon B) lahusega spetsiaalindikaatorite (kromogeenmust, mureksiid jt.) juuresolekul. Loodusliku vee karedus kõigub laiades piirides (mmol/l): 0,1 … 0,2 – tundra ja taiga veekogudes kuni 80 … 100 mineraalvees, meredes, ookeanides Pehme vesi – üldkaredus kuni 2 mmol/l sooli keskmise karedusega – 2 … 10 - “ - kare - üle 10 -“- Vee kareduse vähendamiseks (või eemaldamiseks) on mitmeid meetodeid (nii keemilisi kui füüsikalisi).
annaabi.ee 
