Tallinna Tehnikaülikool Materjaliteaduse instituut Füüsikalise keemia õppetool Üliõpilane: Teostatud: 22.02.2012. Õpperühm: YAGB42 Kontrollitud: Töö nr. 23FK Arvestatud: Sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste parameetrite määramine Töö eesmärk: · Ensüümreaktsiooni kineetiliste konstantide K m ja Vmax määramine Lineweaver- Burki koordinaatides ehitatud graaafiku abil (1/v sõltuvana 1/S ). · Ensüümi aktiivsuse määramine (1 sekundi jooksul ärareageerivate substraadi moolide arv 1 grammi ensüümi toimel 1 sekundi jooksul). Üldmõisted: On olemas esimest järku ja teist järku kineetilised võrrandid. 1) Esimest järku kineetiline võrrand: k ühik: 2) Teist järku kineetiline võrrand: k ühik:
(toru pikkusest) l ja 2 vmax kontsentratsioonist c: αeri] = = f([αeri] = αeri] = eri], l ,c). Polarisatsi mõõdetakse polarimeetri abil. Töövahendid. polarimeeter KRÜSS, suhkrulahus, invertaasi lahus Töö käik. Tegin vajaliku lahuse ja fikseerisin reaktsiooni algusaja. Panin lahuse katse toru teatud aja tagant vaatasin näitu ja panin selle kirja. Kõige alguses tegin katse p hiljem arvutustes teha kalibratsioon. Kõige viimase tulemuse saatis mulle labo ja vmax määramine Lineweaver-Burki s on glükoos ja fruktoos: C12H22O11 + H2O uses (kusjuures vee kontsentratsioon on tunduvalt tsioonina. Inversioonireaktsiooni kiirus on e reaktsiooni katalüsaatorite – kas mineraalhapete kiirust mõõdetakse lahust läbiva polariseeritud e kaudu. Seda võimaldab suhkru ja tema polarisatsioonitasandit paremale (eripööre [αeri] = αeri] = eri] = una glükoos pöörab paremale (eripööre [αeri] = αeri] = eri] =
Tallinna Tehnikaülikool Materjaliteaduse instituut Füüsikalise keemia õppetool Üliõpilane: Teostatud: 22.02.2012. Õpperühm: Kontrollitud: Töö nr. 23FK Arvestatud: FK23a Sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste parameetrite määramine Töö eesmärk ja üldmõisted: Eesmärgiks on ensüümreaktsiooni kineetiliste konstantide Km ja vmax määramine Lineweaver- Burki koordinaatides ehitatud graafiku abil (1/v sõltuvana 1/S). Samuti on võimalik määrata ensüümi aktiivsust (1 sekundi jooksul ärareageerivate substraadi moolide arv 1 grammi ensüümi toimel 1 sekundi jooksul ehk teiste sõnadega reaktsiooni kiirus ühikulise hulga ensüümi toimel). Üldmõisted: Erinevalt esimest järku kineetilisest võrrandist kirjeldub reaktsiooni kiirus sõltuvana substraadi kontsentratsioonist võrdhaarse hüperboolina (graafik käitub vastavalt
kuid konts. kasvamisel kasvu kiirus kahaeb. Teatud reageeriva aine konts. juures lisamine kiirust enam ei muuda. See on lähedane nn. väärtusele. Michaelis-Menteni konstant kontsentratsioon, mille juures reaktsiooni kiirus on pool maksimumist Michaelis-Menteni võrrand Lineweaver-Burke-i võrrand Kasutatakse, sest selliselt tulevad sirged, mille tõusude kaudu saab erinevaid kineetilisi suurusi kergemini leida. 8
TTÜ Materjaliteaduse Instituut Füüsikalise keemia õppetool Kolloidkeemia laboratoorne töö 23a Sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste parameetrite määramine Eesmärgiks on ensüümreaktsiooni kineetiliste konstantide Km ja vmax määramine Lineweaver- Burki koordinaatides ehitatud graafiku abil (1/v sõltuvana 1/S). Samuti on võimalik määrata ensüümi aktiivsust (1 sekundi jooksul ärareageerivate substraadi moolide arv 1 grammi ensüümi toimel 1 sekundi jooksul ehk teiste sõnadega reaktsiooni kiirus ühikulise hulga ensüümi toimel). Töö ettevalmistamine: Reagentideks on: substraadiks suhkrulahus ja ensüümiks invertaasi lahus. Ensüümi lahus
TTÜ Materjaliteaduse Instituut Füüsikalise keemia õppetool Kolloidkeemia laboratoorne töö 23a Sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste parameetrite määramine Eesmärgiks on ensüümreaktsiooni kineetiliste konstantide Km ja vmax määramine Lineweaver- Burki koordinaatides ehitatud graafiku abil (1/v sõltuvana 1/S). Samuti on võimalik määrata ensüümi aktiivsust (1 sekundi jooksul ärareageerivate substraadi moolide arv 1 grammi ensüümi toimel 1 sekundi jooksul ehk teiste sõnadega reaktsiooni kiirus ühikulise hulga ensüümi toimel). Töö ettevalmistamine: Reagentideks on: substraadiks suhkrulahus ja ensüümiks invertaasi lahus. Ensüümi lahus
Edasi teostata tagant (alguses tihemini ~2 min. või 5 min, järel, siis 10 min järel, ning mida a 4) Loputatakse polarimeetri toru ja täidetakse (mullideta!) reaktsioonisegust võ polarimeetrisse ning mõõdetakse polarisatsioonitasandi pöördenurka 5) Esimene mõõtmine võetakse lühimal ajahetkel, mis võimalik. Edasi teostata tagant (alguses tihemini ~2 min. või 5 min, järel, siis 10 min järel, ning mida a ja vmax määramine Lineweaver-Burki vôrrand: atsioon; Km- Michaelis-Menteni konstant; vmax – ]0 = Km, siis v0 = ehk Km on substraadi aksimaalsest. Järeldus: mida väikesem on Km , seda üüm (ferment) efektiivselt. See kirjeldab produkti substraadi kontsentratsioonidel limiteerivad used). Kõrgetel substraadi kontsentratsioonidel on s on glükoos ja fruktoos: ioon on tunduvalt suurem sahharoosi nireaktsiooni kiirus on neutraalses keskkonnas väga kas mineraalhapete või (antud töös)
TTÜ Materjaliteaduse Instituut Füüsikalise keemia õppetool Kolloidkeemia laboratoorne töö 23a Sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste parameetrite määramine Tallinn 2013 Eesmärgiks on ensüümreaktsiooni kineetiliste konstantide Km ja vmax määramine Lineweaver- Burki koordinaatides ehitatud graafiku abil (1/v sõltuvana 1/S). Samuti on võimalik määrata ensüümi aktiivsust (1 sekundi jooksul ärareageerivate substraadi moolide arv 1 grammi ensüümi toimel 1 sekundi jooksul ehk teiste sõnadega reaktsiooni kiirus ühikulise hulga ensüümi toimel). Töö ettevalmistamine: Reagentideks on: substraadiks suhkrulahus ja ensüümiks invertaasi lahus. Ensüümi lahus
· Vajalik PH ja temperatuuri kontroll (ensüümid on õrnad molekulid) · Muudame korraga ainult ühte reaktsioonitingimust · Korduskatsed mõõtmisvea määramine Ensüümkineetika andmete analüüs Kas meie ensüümi kineetika vastab Michaelis-Menteni võrrandile? Milline on kcat ja KM väärtus? V = Vmax[S]/(KM + [S]) V versus [S] hüperbool Michaelis Menteni võrrandi lineaarsed versioonid sirge võrrandid: Sirge võrrand y = ax + b (a tõus ja b vabaliige) 1. Lineweaver-Burki kaksikpöördväärtuste teljestik: 1/V versus 1/[S] 1/V = (1/[S])(KM/Vmax) + 1/Vmax 2. Hanes: [S]/V versus [S] [S]/V = [S]/Vmax + KM/Vmax 3. Eadie-Hofstee: V versus V/[S] V = Vmax KM(V/[S]) Ensüümkineetika andmete analüüs Kui tulemuseks on sirge siis kehtib Michaelis Menteni võrrandile vastav kineetika Vmax ja KM on leitavad sirge parameetritest (tõus ja vabaliige)
ensüüm on [ES] vormis. · Km on sisuliselt S kontsentratsioon (mmol /l), mille puhul kiirus on pool maksimaalkiirusest. Km näitab ensüümi afiinsust substraadile. Lineweaver-Burk graafik. Michaelis-Menteni võrrand, millega saab reaktsioonikiiruse hõperboolsõltuvuse kirjeldada. 3. Reaktsioonikiiruse sõltuvus temperatuurist · Temperatuur, mille juures ensüümreaktsioonikiirus on maksimaalne, on reaktsiooni temperaturioptimum.
ajaühikus produktiks. Ensüümi aktiivususe ühik: (IU international unit) 1IU on ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 mikromooli produkti teket 1 min jooksul. Katal (kat) 1 katal ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 mooli substraadi konversiooni produktiks 1 sek jooksul. 3. Michaelis-Menten'i kineetilise võrrandi matemaatiline ja graafiline väljendus. Michaelis-Menten'i võrrandi teisendus Lineweaver-Burk'i koordinaatides. Vmax ja Km arvväärtuste määramine. Lineweaver-Burk'i koordinaatides. 4. Reaktsiooni kiirust mõjutavad tegurid. Ensüümide inhibiitorid mõiste, inhibeerimise tüübid, nende analüüs. Temperatuuri ja keskkonna pH mõju põhjendused, graafilised sõltuvused. 1) pH Ensüümid on aktiivsed teatud pH vahemikus; pH mõjutab Km või Vma väärtusi. 2) Temperatuur
rmax = k3 c E0 (9.27) Asendades K = (k2 + k3)/k1 (9.28) ja v. (9.27) vôrrandisse (9.26) saame nn. Michaelis-Menteni vôrrandi: rmax [ S] t =0 [ r] t =0 = (9.29) K + [ S] t =0 vôi sama vôrrandi mônevôrra erineval kujul, mida tuntakse ka Lineweaver - Burk´e vôrrandina: 1 1 K = + (9.30) [ r ] t =0 rmax rmax [ S] 0 10.Nõuded katalüsaatorile ja katalüsaatori valmistamiseks. Reaktsiooni kiiruse mutumist põhjusstav aine või keha on katalüsaator. Katalüsaator võtab ühel või teisel viisil osa keemilisest reaktsioonist, kuid reaktsiooni lõuks taastuvad
produkti teket 1 minuti jooksul); katal (1 kat on ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 moli substraadi konversiooni 7 produktiks 1 sek jooksul) 1 kat = 6 x 10 IU; eriaktiivsus (ensüümiaktiivsus 1 mg ensüümivalgu kohta). [ ] 3. Michaelis-Menten'i võrrand: . [ ] Võrrandi teisendus Lineweaver-Burk'i koordinaatides: ([ ] ) . 4. Reaktsiooni kiirust mõjutavad tegurid: pH mõjutab aminohapete ioniseerivate külgahelate, valkude prosteetiliste rühmade ja substraatide dissotsiatsiooni; mõjutab K m ja/või Vmax väärtusi. Temperatuuri tõustes o ensüümreaktsioonid kiirenevad ~2 korda iga 10 kohta. Mingist piirist hakkab kiirus langema tingituna valgu termilisest denaturatsioonist.
kiiruse : rmax = k3 c E0 (9.27) Asendades K = (k2 + k3)/k1 (9.28) ja v. (9.27) võrrandisse (9.26) saame nn. Michaelis-Menteni võrrandi: rmax St =0 r t 0 (9.29) K St =0 või sama võrrandi mõnevõrra erineval kujul, mida tuntakse ka Lineweaver - Burk´e võrrandina: 1 1 K (9.30) r t 0 rmax rmax S0 Kolloidkeemia uurib peendisperssete heterogeensete süsteemide omadusi pindnähtuste alusel ning samuti kõrgmolekulaarsete ühendite ja nende lahuste füüsikalis-keemilisi omadusi. Faasi, milles dispergeeritud aine on ühtlaselt jaotatud, nimetatakse dispersioonikeskkonnaks.
aktiivsuse kaudu. Rahvusvaheline ühik (IU -International Unit) 1 IU on ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 mikromooli produkti teket 1 minuti jooksul. Katal (kat) 1 katal on ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 mooli substraadi konversiooni produktiks 1 sekundi jooksul. Seega: 1 katal = 6 x 107IU Eriaktiivsus - Ensüümiaktiivsus 1 mg ensüümivalgu kohta 3. Michaelis-Menten'i kineetilise võrrandi matemaatiline ja graafiline väljendus. Michaelis-Menten'i võrrandi teisendus Lineweaver-Burk'i koordinaatides. Vmax ja Km arvväärtuste määramine. 4. Reaktsiooni kiirust mõjutavad tegurid. Ensüümide inhibiitorid mõiste, inhibeerimise tüübid, nende analüüs. Temperatuuri ja keskkonna pH mõju põhjendused, graafilised sõltuvused. Reaktsiooni kiirust mõjutavad pH ja temperatuur ning inhibiitorid. Temperatuuri tõstmine kiirendab reaktsiooni, kuid kui temp tõuseb üle 50, siis reaktsiooni kiirus langeb, sest toimub valkude denatureerimine, ehk nõrkade
määrata Vmax ja Km ligikaudseid väärtusi. Väga kõrgetel substraadi kontsentratsioonidel limiteerivad kiirust ainult ensüümi hulk ja reaktsioonitingimused temperatuur, pH, ioonjõud. Substraadi suhtes on reaktsioon sellisel juhul ,,0-järku". Kineetiliste konstantide Vmax ja Km väärtuste täpsemaks määramiseks kasutatakse mitmeid Michaeli-Menten'i kiiruse võrrandi lineariseeritud vorme, millistest üks levinumaid on Lineweaver-Berk'i versioon. Selle puhul tuuakse välja kiiruse pöördväärtuse sõltuvus substraadi kontsentratsiooni pöördväärtusest (nn topelt pöördväärtuste sõltuvus): 1/v = Km / Vmax 1/ [S] + 1/Vmax 70 Lineweaver-Burk'i koordinaatides 1/v versus 1/[S] esitatud sõltuvus on sirge, mille
sekundi jooksul Eriaktiivsus Ensüümiaktiivsus 1 mg ensüümivalgu kohta LIISI KINK 27 BIOKEEMIA test I 3. Michaelis-Menten'i kineetilise võrrandi matemaatiline ja graafiline väljendus. Michaelis- Menten'i võrrandi teisendus Lineweaver-Burk'i koordinaatides. Vmax ja Km arvväärtuste määramine. `abc MM matemaatiline võrrand: G d !K _ C65 6 af e v0 reaktsiooni algkiirus substraadi kotsentratsioonil [S] Vmax reaktsiooni maksimaalne kiirus Km Michaelise konstant Võrrandi analüüs näitab, et Km väjendub substraadi kontsentratsiooni ühikutes. Olukorras, mil
kontsentratsioon ajas ei muutu, seega , seega võrrandis 17 , peab olema nimetaja . Siit tuleb ka Haldane seos ehk võrrand. vs=ksE0[S]eq (tasakaaluline konts) vp=kpE0[P]eq 1.MM võrrandi lineaarsed versioonid Lineweaver-Bukri kaksikpöördväärtuste teljestik: 1/v versus 1/[S] Tänapäeval kasutatakse nende lineaarsete võrrandite asemel regressioonanalüüsi, katsepunktide lähendamist paraboolile, seda teeb arvuti ja saab täpselt kõik vajalikud asjad teada. Sirge võrrandi saamiseks on kõige parem tuletada see. Selleks tuleb võtta pöördväärtus. , tõus on KM/Vmax ja vabaliige on piirkiiruse pöördväärtus
annaabi.ee 
