Fibroiin sisaldub looduslikus siidis. Proteiidid ehk liitvalgud Liitvalgud koosnevad lihtvalgust ja sellega ühinenud mittevalgulisest komponendist ehk nn. prosteetilisest rühmast. Fosfoproteiidides on prosteetiliseks rühmaks fosforhape. On oluliseks lüliks nii taimede kui ka loomade ainevahetuses. Lipoproteiidides on lihtvalgud ühinenud fosfatiididega. Leidub nii taimsete kui loomsete rakkude tsütoplasmas ja plastiidides. Glükoproteiidid on tähtsamaid liitvalke. Kromoproteiidides on lihtvalgud seotud värvainetega. Nt rohelistes lehtedes CO 2 assimilatsiooni katalüüsiv kloroplastiin (klorofüll + valk). Nukleoproteiidides on lihtvalgud seotud nukleiinhapetega. Nukleiinhapped on kõrgmolekulaarsed ühendid, mis nukleoproteiididena sisalduvad kõigis elusates rakkudes. Valgu molekulide struktuur Valgu uuringutes on erilist tähelepanu pööratud peptiidahelate võimalikele ruumilistele
(näiteks, hemogloobin – rauda sisaldav valk, mis transpordib hapnikku) VALKUDE KLASSIFIKATSIOON 1. Struktuurne klassifikatsioon lihtvalgud ehk proteiinid (koosnevad ainult aminohapete jääkidest) liitvalgud ehk proteiidid (sisaldavad peale aminohapete jääkide ka MITTEVALGULIST KOMPONENTI EHK PROSTEETILIST RÜHMA; kr.k. prostheto = lisa). ◦ Lihtvalke jaotatakse valgumolekuli kuju ehk konformatsiooni alusel omakorda fibrillaarsed ja globulaarsed. (nt. albumiin) ◦ Liitvalke eristatakse prosteetilise rühma loomuse järgi. (nt. Hemoglobiin - metalloproteiin) Liitvalke, näiteks lipoproteiine võib vaadelda nii valgu ja lipiidi kompleksidena kui ka lipiidi ja valgu kompleksidena, s.t. nad võivad ehituslikult kuuluda nii valkude kui lipiidide hulka. Sellepärast nimetatakse neid "segamakromolekulideks". VALKUDE KLASSIFIKATSIOON Globulaarsed valgud on kerajas-ellipsoidse kujuga. See on arvukaim valkude rühm, kuhu
metabolismi või tehakse kahjutuks. Valkude klassifikatsioon 1. Struktuurne klassifikatsioon Eristab: lihtvalgud ehk proteiinid (koosnevad ainult aminohapete jääkidest) ja liitvalgud ehk proteiidid (sisaldavad peale aminohapete jääkide ka mittevalgulist komponenti ehk prosteetilist rühma; kr.k. prostheto = lisa). Lihtvalke jaotatakse valgumolekuli kuju ehk konformatsiooni alusel omakorda - fibrillaarsed ja globulaarsed. Liitvalke eristatakse prosteetilise rühma loomuse järgi. Liitvalke, näiteks lipoproteiine võib vaadelda nii valgu ja lipiidi kompleksidena kui ka lipiidi ja valgu kompleksidena, s.t. nad võivad ehituslikult kuuluda nii valkude kui lipiidide hulka. Sellepärast nimetatakse neid "segamakromolekulideks". VALGUD LIHTVALGUD LIITVALGUD
saada toiduga. Valgud jagatakse kahte suurde rühma:proteiinid ehk lihtvalgud ja protetiidid ehk liitvalgud. Lihtvalgud lõhustuvad hüdrolüüsil ainult aminohapeteks. Proteiinid ehk lihtvalgud jagunevad;protamiinid, histoonid, prpolamiinid, gluteliinid, albumiinid, globuliinid ja skleroproteiinid. Proteiidid ehk liitvalgud. Tähsamad liitvalgud on nukleoproteiidid, kromoproteiidid, glükoproteiidid, lipoproteiidid jt. Liitvalke iseloomustab suur bioloogiline aktiivsus, 4 mida põhjustavad gprosteetilse rühma koostisesse kuuluvad komponendid:nukleiinhapped, pigmendid, metallid jt.ühendeid. Valgud toidus Valgud peaksid andma toiduga saadavast energiast 10-15%. Et organismi valguvarud pole suured, peab toit igal söögikorral küllaldaselt valku sisaldama .Tasakaalustatud
iseseisva struktuuri ja funktsiooniga üksused. Tavaliselt stabiilne ka väljaspool ülejäänud valgu konteksti. Valgud koosnevad tavaliselt mitmetest domäänidest. pikkus umbes 25-500 aminohappejääki (36 jääki E-selektiin , 692 jääki lipoksügenaase-1) evolutsiooniliste protsesside käigus on sarnased domäänid moodustanud erinevaid valke domääne saab ka insenergeetiliselt liita ja moodustada kunstlikke liitvalke- kimäärseid valke- sageli säilib domäänide funktsionaalsus ja seega on võimalik tekitada uute omadustega valke Domeenide tekke põhjuseks: selektsioon evolutsiooni käigus (uute funktsioonide pakkumine ja testimine). Struktuurimotiivid – sekundaaarstruktuuridi regulaarne kombinatsioon. Ruumilise struktuuri motiivid sisaldavad sageli sarnaseid aminohappe järjestusi - järjestuse ehk primaarstruktuuri motiive. Ühesuguste biokeemiliste funktsioonide
meetoditega. 46. Valkude strukutuuri ja fukntsiooni (valk-valk) interaktsiooni meetodid Valgu molekulaarse struktuuri võib määrata tuumamagnetresonantsi abil Valgu funktsioonide üle võib otsustada tema järjestuse võrdlemisel mõne tuntud funktsiooniga valgu järjestusega Affiinsuskromatograafia ja immunosadestamine võimaldavad leida seostunud valke Valgu funktsiooni uurimisel võib kasutada liitvalke (fusion proteins), samuti võib nende abil valku rakus lokaliseerida. 47.Antikehad ja liitvalgud Antikehade kasutamine molekulaarbioloogias Flourentsmikroskoopia: Väga laialt on levinud rakubioloogias nn. immuunfluorestsentsi meetod, mis põhineb fluorestseeruvat värvainetega konjugeeritud antikehade kasutamisele. Enamlevinud fluorokroomidena antikehade märgistamiseks kasutatakse FITC (fluorestsiin-isotiotsüanaat), TRITC (tetrametüül-rodamiin-
uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul) reportergeeni (GFP, lacZ jt.) või märgise (FLAG, myc, V5, GFP) järjestust eukarüootset promootorit ja polüadenüleerimisjärjestust selektsioonimarkeri ekspressioonikassetti 122. 123. pEGFP : võimaldab ekspresseerida EGFP-d (roheliselt fluorestseeruv valk) eukarüootsetes rakkudes võimaldab ekspresseerida EGFP liitvalke, kui EGFP geeni ette või järele on kloneeritud samas lugemisraamis uuritavat valku kodeeriv järjestus replitseerub episomaalsena rakuliinides, kus on ekspresseeritud SV40 viiruse large T-antigen (Cos1, Cos7), mis tähendab tugevamat ekspressiooni 124. 125. 126. 127. 128. 129. 130. 131. Esimene päev – rakkude transfekteerimine PEI-ga 132. Esmalt tuleb vaadelda rakkud mikroskoobis ja hinnata nende seisukorra. Rakud ei ole
Sageli ka: • reportergeeni (GFP, lacZ jt.) järjestus • märgise järjestus(FLAG, myc, V5, GFP) • selektsioonimarkeri ekspressioonikasset Praktikumis on kasutusel pEGFP (enhanced green flourescent protein) ekspressioonivektor, mis: • võimaldab ekspresseerida EGFP-d (roheliselt fluorestseeruv valk) eukarüootsetes rakkudes • võimaldab ekspresseerida EGFP liitvalke, kui EGFP geeni ette või järele on kloneeritud samas lugemisraamis uuritavat valku kodeeriv järjestus • replitseerub episomaalsena rakuliinides, kus on ekspresseeritud SV40 viiruse large T- antigen (Cos1, Cos7), mis tähendab tugevamat ekspressiooni Figure 3 pEGFP C1 ekspressioonivetori kaart (Clontech). Joonisel on tähistatud plasmiidi funktsionaalsed osad ning numbriliselt on välja toodud kaugus mõttelisest plasmiidi alguspunktist.
Lahutunud komponendid detekteeritakse füüsikaliste või keemiliste meetoditega. 43.Valkude struktuuri uurimise meetodid · Valgu molekulaarse struktuuri võib määrata tuumamagnetresonantsi abil · Valgu funktsioonide üle võib otsustada tema järjestuse võrdlemisel mõne tuntud funktsiooniga valgu järjestusega · Affiinsuskromatograafia ja immunosadestamine võimaldavad leida seostunud valke Valgu funktsiooni uurimisel võib kasutada liitvalke (fusion proteins), samuti võib nende abil valku rakus lokaliseerida. 44.Antikehade ja liitvalkude kasutamisvõimalusi molekulaarbioloogias Antikehade kasutamine molekulaarbioloogias Flourentsmikroskoopia: Väga laialt on levinud rakubioloogias nn. immuunfluorestsentsi meetod, mis põhineb fluorestseeruvat värvainetega konjugeeritud antikehade kasutamisele. Enamlevinud fluorokroomidena antikehade märgistamiseks
Lahutunud komponendid detekteeritakse füüsikaliste või keemiliste meetoditega. 43.Valkude struktuuri uurimise meetodid · Valgu molekulaarse struktuuri võib määrata tuumamagnetresonantsi abil · Valgu funktsioonide üle võib otsustada tema järjestuse võrdlemisel mõne tuntud funktsiooniga valgu järjestusega · Affiinsuskromatograafia ja immunosadestamine võimaldavad leida seostunud valke Valgu funktsiooni uurimisel võib kasutada liitvalke (fusion proteins), samuti võib nende abil valku rakus lokaliseerida. 44.Antikehade ja liitvalkude kasutamisvõimalusi molekulaarbioloogias -Immunohistokeemia on molekulaarbioloogias üheks tavalisemaks uurimismeetodiks, kus kasutatakse ultraviolettvalguses helendavaid antikehasid, mis kinnituvad kindlate molekulide külge. Näiteks saab neid kasutada apoptoosivalkude (toksilisuse hindamisel), neurotransmitterite, c-FOS, retseptorite jne. hulga visualiseerimiseks
47. Valkude struktuuri ja funktsiooni (valk-valk interaktsioonide) uurimise meetodid Tamme, loeng 6, slaid 14 • Valgu molekulaarse struktuuri võib määrata tuumamagnetresonantsi abil • Valgu funktsioonide üle võib otsustada tema järjestuse võrdlemisel mõne tuntud funktsiooniga valgu järjestusega • Affiinsuskromatograafia ja immunosadestamine võimaldavad leida seostunud valke Valgu funktsiooni uurimisel võib kasutada liitvalke (fusion proteins), samuti võib nende abil valku rakus lokaliseerida. 48. Antikehade ja liitvalkude kasutamisvõimalusi Tamme, Loeng 6, slaid 16 Antikehade kasutamine molekulaarbioloogias Flourentsmikroskoopia: Väga laialt on levinud rakubioloogias nn. immuunfluorestsentsi meetod, mis põhineb fluorestseeruvat värvainetega konjugeeritud antikehade kasutamisele. Enamlevinud fluorokroomidena antikehade märgistamiseks
47. Valkude struktuuri ja funktsiooni (valk-valk interaktsioonide) uurimise meetodid Tamme, loeng 6, slaid 14 · Valgu molekulaarse struktuuri võib määrata tuumamagnetresonantsi abil · Valgu funktsioonide üle võib otsustada tema järjestuse võrdlemisel mõne tuntud funktsiooniga valgu järjestusega · Affiinsuskromatograafia ja immunosadestamine võimaldavad leida seostunud valke Valgu funktsiooni uurimisel võib kasutada liitvalke (fusion proteins), samuti võib nende abil valku rakus lokaliseerida. 48. Antikehade ja liitvalkude kasutamisvõimalusi Tamme, Loeng 6, slaid 16 Antikehade kasutamine molekulaarbioloogias Flourentsmikroskoopia: Väga laialt on levinud rakubioloogias nn. immuunfluorestsentsi meetod, mis põhineb fluorestseeruvat värvainetega konjugeeritud antikehade kasutamisele. Enamlevinud fluorokroomidena antikehade märgistamiseks
Mõlemil juhul oli varem näidatud, et haigust põhjustab bakteris leiduv valguline toksiin. Seetõttu kasutati vaktsiinis keemiliselt muudetud toksiini, mis oli kaotanud oma toksilised omadused. Saadi suurepärased tõhusad ja ohutud vaktsiinid, mis on kasutusel siiani. Puhastatud ühekomponendilise vaktsiini puhul toimub immuunstimulatsioon eelkõige kaitset pakkuvatele molekulidele, kuid tavaliselt on see B-rakuline immuunvastus ja kaitse võib jääda nõrgaks, seepärast kasutatakse liitvalke: N.polüsahhariid+ valguline AG. · REKOMBINANTSED VAKTSIINID - Suureks probleemiks uute vaktsiinide saamisel on mikroobid, mis ei kasva laborioludes. N: B ja C hepatiidi viirused; pidaltõbi, hingamisteede nakkus, malaaria. Läbimurre selliste mikroobide vastaste vaktsiinide valmistamisel tuli tehnoloogiaga, kus haigust tekitavate mikroorganismide geenid kantakse üle ja ekspresseeritakse tehistingimustes - kergesti kasvatavates organismides (E
Mõlemil juhul oli varem näidatud, et haigust põhjustab bakteris leiduv valguline toksiin. Seetõttu kasutati vaksiinis keemiliselt muudetud toksiini, mis oli kaotanud oma toksilised omadused. Saadi suurepärased tõhusad ja ohutud vaksiinid, mis on kasutusel siiani. Puhastatud ühekomponendilise vaksiini puhul toimub immuunstimulatsioon eelkõige kaitset pakkuvatele molekulidele, kuid tavaliselt on see B-rakuline immuun vastus ja kaitse võib jääda nõrgaks, seepärast kasutatakse liitvalke: N.polüsahhariid+ valguline AG. Rekombinantsed vaktsiinid- Suureks probleemiks uute vaksiinide saamisel on mikroobid, mis ei kasva (hästi) laborioludes. N: B ja C hepatiidi viirused; bakterid - N: pidaltõve tekitaja Mycobacterium leprae ja hingamisteede nakkuste tekitaja Clamydia pneumoniae ning parasiidid, N: malaariat põhjustav Plasmodium. Läbimurre selliste mikroobide vastaste vaksiinide valmistamisel tuli tehnoloogiaga, kus
annaabi.ee 
